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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La linea cellulare THP-1 è ampiamente utilizzata come modello per studiare le funzioni dei monociti/macrofagi umani in varie aree di ricerca legate alla biologia. Questo articolo descrive un protocollo per l'ingegneria efficiente basata su CRISPR-Cas9 e l'isolamento di cloni di singole cellule, che consente la produzione di dati fenotipici robusti e riproducibili.

Abstract

La linea cellulare THP-1 per la leucemia monocitica acuta umana (LMA) è ampiamente utilizzata come modello per studiare le funzioni dei macrofagi derivati dai monociti umani, compresa la loro interazione con patogeni umani significativi come il virus dell'immunodeficienza umana (HIV). Rispetto ad altre linee cellulari immortalizzate di origine mieloide, le cellule THP-1 conservano molte vie di segnalazione infiammatoria intatte e mostrano caratteristiche fenotipiche che assomigliano più da vicino a quelle dei monociti primari, inclusa la capacità di differenziarsi in macrofagi quando trattate con forbolo-12-miristato 13-acetato (PMA). L'uso della tecnologia CRISPR-Cas9 per ingegnerizzare le cellule THP-1 attraverso il knockout genico mirato (KO) fornisce un approccio potente per caratterizzare meglio i meccanismi immuno-correlati, comprese le interazioni virus-ospite. Questo articolo descrive un protocollo per un'efficiente ingegneria basata su CRISPR-Cas9 che utilizza l'elettroporazione per fornire ribonucleoproteine Cas9:sgRNA preassemblate nel nucleo cellulare. L'utilizzo di più sgRNA che hanno come bersaglio lo stesso locus in posizioni leggermente diverse comporta la delezione di grandi frammenti di DNA, aumentando così l'efficienza dell'editing, come valutato dal saggio dell'endonucleasi T7 I. L'editing mediato da CRISPR-Cas9 a livello genetico è stato convalidato dal sequenziamento Sanger seguito dall'analisi Inference of CRISPR Edits (ICE). La deplezione delle proteine è stata confermata dall'immunoblotting accoppiato a un test funzionale. Utilizzando questo protocollo, sono stati raggiunti fino al 100% di indel nel locus target e una diminuzione di oltre il 95% dell'espressione proteica. L'elevata efficienza di editing rende conveniente isolare i cloni di singole cellule limitando la diluizione.

Introduzione

THP-1 è una linea cellulare umana derivata da monociti isolata da un paziente affetto da leucemia acuta (LMA), che mostra caratteristiche fenotipiche molto simili a quelle dei monociti primari1. Rispetto ai macrofagi primari derivati da monociti, che non si dividono e mostrano sia una durata di vita limitata che una variabilità inter-/intra-donatrice nel fenotipo, le cellule THP-1 possono essere coltivate praticamente all'infinito e hanno un comportamento più omogeneo che favorisce la riproducibilità dei risultati 2,3,4,5,6 . In particolare, le cellule THP-1 possono essere differenziate verso un fenotipo simile ai macrofagi con forbolo-12-miristato 13-acetato (PMA), rendendole un modello in vitro ampiamente utilizzato per studiare le risposte di monociti/macrofagi ai segnali infiammatori 7,8,9,10,11,12,13 o all'infezione da parte di patogeni umani clinicamente rilevanti, incluso l'HIV 14,15,16. La possibilità di ingegnerizzare geneticamente le cellule THP-1 è di interesse in molte aree di ricerca legate alla biologia.

La proteina 9 associata a CRISPR (CRISPR-Cas9) è un sistema immunitario adattativo procariotico che si basa su nucleasi guidata da RNA per degradare i genomi virali invasori, che è stato riprogrammato come strumento di ingegneria genetica17. Il processo di editing del genoma procede in tre fasi: riconoscimento, scissione e riparazione. Un RNA a guida singola (sgRNA) recluta la nucleasi Cas9 in uno specifico locus genomico attraverso l'accoppiamento di basi con la sua sequenza guida da 20 bp. La presenza di una sequenza di Protospacer Adjacent Motif (PAM) direttamente a 3' della sequenza bersaglio genomica a 20 bp innesca lo svolgimento e la scissione mediati da Cas9 su entrambi i filamenti di DNA tra le posizioni 17 e 18 (3-bp 5' del PAM). La rottura a doppio filamento (DSB) risultante viene elaborata da due principali percorsi di riparazione. In assenza di un modello di riparazione che presenti omologia con il locus danneggiato, la via di giunzione delle estremità non omologhe (NHEJ) soggetta a errori introdurrà inserzioni e/o delezioni nucleotidiche casuali (indel), portando potenzialmente a mutazioni frameshift e/o all'introduzione di codoni di terminazione prematura (PTC). A loro volta, gli mRNA contenenti PTC sono bersaglio della degradazione da parte della via di decadimento dell'mRNA (NMD) mediata da nonsenso, interrompendo in ultima analisi l'espressione/funzione della proteina 18,19,20. In alternativa, il percorso HDR (Homology-Directed Repair) dipendente dal modello può operare e riparare fedelmente il DSB. Questo meccanismo è stato sfruttato per ottenere un editing genetico preciso, compresi i knock-in e le sostituzioni di basi. Vale la pena notare che lo stato del ciclo cellulare è un fattore importante che influenza la scelta della via di riparazione del DSB. Infatti, l'NHEJ è attivo in tutte le fasi del ciclo cellulare, mentre l'HDR è principalmente limitato alle fasi S/G221.

Le cellule THP-1 crescono in sospensione e sono notoriamente difficili da trasfettare con il DNA plasmidico, una procedura che probabilmente altera anche la loro vitalità e/o capacità di differenziazione22,23. La trasduzione con vettori lentivirali basati su HIV-1 che codificano sia per Cas9 che per l'sgRNA è spesso impiegata per mettere fuori combattimento (KO) un gene di interesse24. L'integrazione della cassetta Cas9/sgRNA nel genoma cellulare garantisce un'espressione prolungata e un KO efficiente, ma è anche una fonte persistente di effetti off-target25. In alternativa, le ribonucleoproteine (RNP) pre-assemblate Cas9:sgRNA vengono veicolate mediante elettroporazione, un metodo che prevede la formazione temporanea di pori sia nel plasma che nelle membrane nucleari dopo l'applicazione di impulsi elettrici. Preservare la vitalità cellulare è una sfida importante quando si intraprende questo approccio.

Qui, è stata prodotta una linea cellulare THP-1 che esprime stabilmente GFP (THP-1_GFP) per fungere da strumento per stabilire un protocollo per ottenere un efficiente editing basato su CRISPR-Cas9. Dopo aver progettato una strategia per inattivare il gene EGFP utilizzando tre sgRNA contemporaneamente (approccio multi-guida), l'efficienza KO in diverse condizioni di elettroporazione è stata determinata utilizzando l'espressione di GFP come lettura. La proliferazione cellulare è stata monitorata in parallelo. L'editing genetico è stato confermato sia da un test dell'endonucleasi I T7 (T7EI) che dal sequenziamento Sanger, seguito dall'analisi con l'algoritmo Inference of CRISPR Edits (ICE)26. I parametri che hanno prodotto una diminuzione dell'espressione di GFP fino al 95%, con le cellule THP-1 che recuperano i normali tassi di crescita dopo l'elettroporazione, sono stati impiegati con successo per inattivare un gene endogeno (SAMHD1) e produrre cloni di THP-1 a singola cellula.

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Guida la progettazione con CRISPOR (Figura 1.1)

NOTA: Il software SnapGene Viewer può essere utilizzato nei passaggi 4, 7 e 10 per annotare il sito di destinazione dell'editing e la posizione dell'ibridazione del primer PCR all'interno del gene di interesse.

  1. Vai al sito web di Ensembl (www.ensembl.org). Nella casella di ricerca , seleziona una specie e inserisci il nome del gene di interesse. Fare clic su Vai. Seleziona il risultato che corrisponde al gene (non una trascrizione).
  2. Fare clic su Mostra tabella di trascrizione e quindi selezionare l'ID trascrizione che corrisponde alla codifica delle proteine con etichetta oro nella colonna Biotipo . Una volta nella pagina della trascrizione, fai clic su Exons nel menu a sinistra.
  3. Scorri verso il basso e fai clic su Scarica sequenza. Assicurati che il formato del file sia FASTA. In Impostazioni - Sequenze incluse, deseleziona tutto tranne Sequenza genomica.
    Immettere il numero "500" in Sequenza di fiancheggiamento a entrambe le estremità della casella di trascrizione . Fare clic su Anteprima, selezionare l'intera sequenza (solo i nucleotidi senza l'intestazione) e copiarla (Ctrl+C).
  4. Apri SnapGene Viewer e fai clic su Nuovo file > DNA. Incollare la sequenza (CTRL+V) nella casella Crea una sequenza . Deselezionare Rileva funzioni comuni e selezionare Lineare in Topologia.
    Rinomina il file e fai clic su Crea. Nel menu a sinistra, deseleziona Mostra enzimi (prima icona). Nella parte inferiore della finestra, seleziona la scheda Sequenza .
    NOTA: Questo passaggio consente il recupero dell'intera sequenza genica, inclusi esoni, introni e sequenze fiancheggianti da 500 bp (opzionale). Quest'ultima informazione è utile per la progettazione di primer PCR per l'amplificazione di un sito bersaglio situato all'interno del primo esone.
  5. Torna al sito Web di Ensembl, scorri verso l'alto l'anteprima del file e fai clic su Indietro. Ora, cambia il formato del file in RTF. In Impostazioni - Sequenze incluse, deselezionare tutto tranne gli esoni. In Mostra varianti, seleziona No. Fare clic su Download nella parte superiore della pagina.
  6. Apri il file scaricato (con Word), che contiene la sequenza degli esoni e mostra la sequenza di codifica in blu, a partire dall'ATG iniziale. Scegliere l'esone da prendere di mira con la modifica diretta da CRISPR-Cas9 (vedere di seguito per le raccomandazioni), selezionarlo e copiarlo (Ctrl+C).
    1. L'esone bersaglio è un esone precoce o un esone che codifica per un dominio funzionalmente importante della proteina. Vale la pena notare che l'instaurazione di un PTC in un esone tardivo vicino al 3' UTR probabilmente non riuscirà a suscitare NMD, portando all'espressione di una proteina troncata C-terminale. Al contrario, l'introduzione di un PTC in un esone precoce prossimale al sito di iniziazione nativo è associata a un rischio di traduzione illegittima (ITL, noto anche come ATI)), producendo l'espressione inaspettata di una proteina troncata N-terminale che inizia in un sito di inizio della traduzione in-frame (TIS) a valle del primo codone ATG. Per mitigare quest'ultimo rischio, si consiglia di valutare l'insorgenza di TIS alternativi utilizzando ATGpr27 (atgpr.dbcls.jp) e/o NetStart 1.028 (services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/).
    2. Assicurarsi che l'esone di destinazione contenga una sequenza di codifica. Tuttavia, potrebbe rivelarsi utile scegliere una ricottura di sgRNA con la regione 5'UTR a monte dell'ATG iniziale per includerla nel frammento eliminato.
    3. Idealmente, l'esone bersaglio dovrebbe essere comune a tutte le varianti di trascrizione codificanti proteine del gene. Controlla se questo è il caso sul Genome Data Viewer (www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/) dell'NCBI cercando il gene di interesse.
      Cliccando sul nome del gene (in verde) nella finestra del display verranno mostrate le varianti del trascritto (in viola). Gli esoni sono rappresentati da un rettangolo.
  7. In SnapGene Viewer, premere Ctrl+F, Ctrl+V, quindi Invio per cercare la sequenza dell'esone. Premi Ctrl+T per aggiungere una nuova funzionalità, assegnale un nome, cambia il tipo in "exon" e fai clic su OK.
  8. Vai al sito Web CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/) e incolla la sequenza dell'esone nel passaggio 1. Innanzitutto, selezionare un genoma di riferimento nel passaggio 2 e quindi il tipo di PAM da scegliere come bersaglio nel passaggio 3, in genere 20bp-NGG per SpCas9. Fare clic su INVIA.
  9. Seleziona due sgRNA in modo che siano separati fino a 150 bp, quindi seleziona un terzo sgRNA intermedio. Ecco alcune linee guida per la selezione degli sgRNA:
    1. Il punteggio di specificità del MIT è correlato agli effetti fuori bersaglio. Un punteggio più alto indica un minor numero di potenziali fuori target. La colonna di destra mostra tre siti fuori bersaglio previsti classificati dal più al meno probabile, insieme alle loro posizioni (in un esone, un introne o una regione intergenica). È possibile accedere all'elenco completo dei siti fuori target previsti facendo clic su Mostra tutto. Se possibile, seleziona gli sgRNA con un punteggio MIT >80, dando la priorità a quelli senza fuori bersaglio per 0, 1 o 2 discrepanze. Inoltre, gli sgRNA con off-target in un esone, che hanno il maggior potenziale di influenzare il fenotipo, dovrebbero essere evitati.
    2. Per l'efficacia prevista, fare riferimento al punteggio Doench '16. Si noti che un punteggio Doench '16 elevato indica semplicemente che l'sgRNA ha maggiori probabilità di essere efficace. L'efficacia effettiva deve essere determinata sperimentalmente. Per questo motivo, è sempre utile selezionare più sgRNA, anche se non sono destinati ad essere utilizzati insieme.
    3. Un contenuto di GC troppo alto o troppo basso, così come alcuni motivi, possono essere dannosi per l'efficienza dell'sgRNA e dovrebbero essere evitati. Questi parametri sono evidenziati da CRISPOR.
  10. Ripetere il passaggio 1.7 per aggiungere la sequenza sgRNA e la sequenza PAM associata alla sequenza genica in SnapGene Viewer. Allo stesso tempo, incolla la sequenza di sgRNA (senza il PAM) in un file di testo o Excel per mantenere l'orientamento 5'-3' richiesto quando si ordina l'oligonucleotide.
  11. Per l'amplificazione basata sulla PCR del sito target, progettare un paio di primer che lo circondano. La dimensione dell'amplicone dovrebbe essere compresa tra 800 e 1000 bp. PrimerQuest è stato utilizzato per progettare i primer per questo protocollo (https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest). In alternativa, CRISPOR fornisce un elenco di primer per amplificare la regione genomica mirata e i siti fuori bersaglio. Dopo aver visualizzato l'elenco completo dei potenziali siti fuori bersaglio (passaggio 1.9.1), fai clic su Primer fuori bersaglio nell'angolo in basso a destra.

2. Preparazione del reagente e della cellula per l'elettroporazione (Figura 1.2)

  1. Preparare una piastra di coltura a 24 pozzetti per recuperare le cellule dopo l'elettroporazione riempiendo i pozzetti con 500 μl di terreno RPMI 1640 integrato con il 20% di siero fetale bovino (FBS) inattivato a caldo (56 °C, 30 min) filtrato (0,20 μm). Non aggiungere antibiotici. Conservare la piastra in un'incubatrice umidificata a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore fino all'elettroporazione.
  2. Se gli sgRNA vengono spediti secchi, reidratarli con tampone TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) a una concentrazione finale di 100 μM (cioè 10 μL di tampone TE per 1 nmol di sgRNA). Agitare per 30 s, incubare a 4 °C durante la notte per consentire la completa reidratazione e, dopo una breve omogeneizzazione con pipetta, conservare la soluzione madre di sgRNA a -20 °C. A seconda del volume finale, fare delle aliquote per evitare più cicli di gelo-scongelamento.
  3. Preparare una soluzione di sgRNA funzionante a una concentrazione finale di 30 μM diluendo la soluzione madre da 100 μM in acqua priva di nucleasi. Agitare per 30 s e incubare 5 minuti a temperatura ambiente.
  4. Assemblare gli RNP Cas9:sgRNA con un rapporto molare 1:9 diluendo simultaneamente 1 μL di ciascuno dei tre sgRNA da 30 μM e 0,5 μL di soluzioni Cas9 da 20 μM in 3,5 μL di tampone di risospensione R, incluso nel kit di elettroporazione (volume finale di 7 μL, per una condizione sperimentale; scalare di conseguenza). Agitare brevemente e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Nel frattempo, preparare un controllo non modificato aggiungendo 0,5 μL di 20 μM Cas9 a 6,5 μL di tampone di risospensione R. Vortex brevemente e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  6. Aggiungere 5 μl di tampone di risospensione R a tutti i campioni per un volume finale di 12 μl per condizione di elettroporazione.
  7. Preparare le celle THP-1 per l'elettroporazione.
    1. Valutare la concentrazione e la vitalità mediante test di esclusione del blu di tripano. Diluire le cellule 1:2 in una soluzione colorante di blu di tripano allo 0,4%. Dopo 30 s di incubazione, omogeneizzare bene e aggiungere 10 μl in una parete di una camera di conteggio con uno stile di griglia migliorato di Neubauer. Contare tre quadrati grandi e dividere il conteggio per 100 per ottenere la concentrazione cellulare (x106 cellule/mL).
      NOTA: La salute delle cellule influenza la loro sensibilità all'elettroporazione. Bisogna fare attenzione a eseguire la coltura cellulare in condizioni ottimali. Il tempo all'esterno dell'incubatore deve essere limitato e tutti i reagenti e le soluzioni devono essere preparati e riscaldati in anticipo.
    2. Per ogni condizione, raccogliere un volume equivalente a 0,2 x 106 celle e centrifugare (336 x g, 5 min, 20 °C).
    3. Aspirare il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere il pellet in 500 μL di PBS. Centrifugare nuovamente (336 x g, 5 min, 20 °C).
    4. Aspirare con cautela il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere il pellet cellulare THP-1 con i 12 μL di soluzione di RNP (passaggio 2.6).

3. Messa a punto e nucleofezione del sistema di elettroporazione (Figura 1.3)

  1. Posizionare la stazione di pipettatura sotto una cappa di biosicurezza, inserire una provetta per elettroporazione nel supporto e aggiungere 3 mL di tampone E, incluso nel kit di elettroporazione.
  2. Dopo aver acceso l'elettroporazione, utilizzare il touch screen per impostare i seguenti parametri di elettroporazione: Tensione = 1 500 V, Durata = 10 ms, Numero = 3.
  3. Dotare la pipetta per elettroporazione di un puntale e aspirare 10 μl della soluzione di RNP/THP-1 (passaggio 2.7.4). Inserire la pipetta nel tubo di elettroporazione e premere Start sullo schermo del dispositivo di elettroporazione. Attendere che venga visualizzato il messaggio Completato e rimuovere la pipetta dal tubo.
  4. Trasferire le cellule in un pozzetto della piastra preriscaldata a 24 pozzetti e omogeneizzare delicatamente. Rimettete le piastre nell'incubatrice umidificata e lasciatele riposare indisturbate per 72 h.
    NOTA: Fare attenzione a non formare bolle durante il pipettaggio della sospensione RNP/THP-1, poiché interferirebbero con la procedura di elettroporazione. Se viene visualizzato un messaggio di errore in assenza di un arco elettrico visibile, rimuovere la pipetta per elettroporazione dal tubo e premere nuovamente Start . Tuttavia, se si osserva un arco elettrico sotto forma di una breve scintilla luminosa, potrebbe indicare la presenza di bolle. La procedura di elettroporazione probabilmente fallirà, anche in assenza di un messaggio di errore.

4. Recupero di THP-1 72 ore dopo l'elettroporazione (Figura 1.4)

  1. Contare le cellule per valutare la concentrazione (passaggio 2.7.1) 72 ore dopo l'elettroporazione.
  2. Se ci sono abbastanza cellule (cioè ≥0,6 x 106 cellule/mL), diluirle almeno un fattore 2 con RPMI integrato con il 20% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina e portare la concentrazione tra 0,3-0,5 x 106 cellule per mL. In caso contrario, lasciare che la cella si riprenda per altre 72 ore.
  3. Passaggio e amplificare le celle fino a quando non ce n'è abbastanza per la convalida del KO. Nel frattempo, può essere avviato l'isolamento di cloni a singola cellula (fase 7).

5. Validazione dell'editing genetico mediante saggio di disallineamento T7EI (Figura 1.5)

NOTA: Il test potrebbe sottostimare l'efficienza di editing dato che T7EI riconosce discrepanze superiori a 1 bp. Pertanto, il test T7EI non è utile per lo screening di popolazioni cellulari omozigoti (cioè cloni di singole cellule) a meno che non venga opportunamente modificato (passaggio 5.7).

  1. Valutare la concentrazione delle cellule (passaggio 2.7.1) e prelevare un volume equivalente a 0,1 x 106 cellule in una provetta da 1,5 mL. Centrifugare (336 x g, 5 min, 20 °C), aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μl di PBS. Centrifugare nuovamente e, utilizzando una pipetta, aspirare quanto più surnatante possibile senza disturbare il pellet. Congelare il campione e conservarlo a -20 °C.
  2. Estrarre il DNA genomico da utilizzare come matrice per l'amplificazione della PCR.
    1. Risospendere il pellet con 50 μL di soluzione di estrazione del DNA, omogeneizzare e trasferire l'intero volume in una provetta PCR da 0,2 mL. Agitare e centrifugare brevemente (pulsare per 3 s).
    2. Inserire la provetta in un termociclatore e riscaldarla a 65 °C per 15 minuti, seguita da 98 °C per 10 minuti.
    3. Diluire il DNA estratto con 90 μL di acqua ultrapura. Agitare e centrifugare brevemente (5.000 x g, 3 s).
  3. Diluire il primer PCR (vedere la Tabella dei materiali) in acqua ultrapura per una concentrazione finale di 10 μM (cioè 10 pmol/μL).
  4. Preparare la miscela per PCR (seguendo la NOTA di seguito) in una provetta per PCR da 0,2 mL (volume finale = 50 μL, per una condizione). Di solito, ci saranno almeno due condizioni: il KO e il controllo non modificato con il solo Cas9.
    NOTA: DNA genomico purificato: 10 μL; Primer diretto e inverso (10 μM): 2,5 μL ciascuno, la concentrazione finale di 500 nM; Tampone di reazione (5x): 10 μL. Vortice bene prima dell'aggiunta. Miscela di dNTP (25 mM di ciascuno): 0,6 μL, concentrazione finale di 0,3 mM per ogni dNTP. DNA polimerasi: 0,5 μl; Acqua ultrapura: 23,9 μL. Vortice e centrifugare brevemente (pulsare per 3 s).
  5. Posizionare le provette nel termociclatore ed eseguire il programma PCR con le seguenti impostazioni:
    NOTA: Un ciclo a 95 °C per 5 minuti, seguito da 30 cicli [98 °C per 20 s (fase di denaturazione), X °C per 15 s (fase di ricottura), 72 °C per 45 s (fase di allungamento)], quindi un ciclo finale a 72 °C per 2 minuti. Al termine dell'amplificazione, rimuovere le provette, vorticare e centrifugare brevemente (pulsare per 3 s). La temperatura di ricottura (X) è la temperatura di fusione (Tm) degli inneschi meno 5 °C.
  6. Per una popolazione policlonale modificata: in una nuova provetta da 0,2 mL, aggiungere 17,5 μL di amplicone PCR e 2 μL di NEBuffer 2 (10x) per un volume finale di 19,5 μL. Vortice e centrifugare brevemente (pulsare per 3 s). In alternativa, per lo screening di cloni di singole cellule, mescolare 1:1 dei prodotti PCR sia dalle cellule di controllo modificate che da quelle non modificate (passaggio 5.6) (Figura 1 supplementare).
  7. Per la formazione eteroduplex, posizionare le provette nel termociclatore ed eseguire il seguente programma: un ciclo a 95 °C per 10 min, uno con una rampa di -2 °C/s da 95 a 85 °C, uno con una rampa di -0,3 °C/s da 85 a 25 °C e un ciclo di raffreddamento finale a 10 °C in HOLD.
  8. Dopo la formazione eteroduplex, aggiungere 0,5 μl di soluzione T7EI nella provetta. Incubare a 37 °C per 30 min.
  9. Preparare un gel di agarosio all'1,2%:
    1. Pesare l'agarosio in un flacone di vetro e aggiungere il volume appropriato di 1x tampone TAE (40 mM di Tris-acetato, 1 mM di EDTA, pH 8,3). Mettetelo nel microonde facendo attenzione a non avvitare bene il tappo. Scaldare più volte fino a quando i cristalli di agarosio non saranno completamente sciolti.
      NOTA: Se necessario, mescolare la soluzione. Non lasciarlo bollire, altrimenti il volume diminuirà, modificando la concentrazione di agarosio.
    2. Aggiungere la colorazione in gel DNA diluita a 1/20.000 e mescolare bene.
    3. Versare la soluzione di agarosio in uno stampo, aggiungere un pettine e lasciare solidificare a temperatura ambiente.
  10. Preparare i campioni per l'elettroforesi su gel mescolando 5 μl di prodotti per la digestione T7EI (fase 5.9) o il prodotto per PCR non digerito con 5 μl di acqua e 2 μl di colorante caricante DNA 6x. Caricare i campioni e la scala dimensionale e migrare a 80 V per 45 minuti (il tempo può essere adattato a seconda delle dimensioni previste dei frammenti di DNA). Una volta terminata la migrazione, acquisire un'immagine del gel con un sistema di imaging appropriato.

6. Validazione dell'editing genetico mediante analisi di sequenziamento Sanger (Figura 1.6)

  1. Per caratterizzare la modificazione genetica, purificare i prodotti della PCR (step 5.4) e, dopo il sequenziamento Sanger, analizzare i risultati con lo strumento ICE (https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis).
  2. Controlla se una proteina può essere prodotta nonostante le modifiche.
    1. Scarica i risultati ICE e apri il file contribs.txt.
    2. Confrontate le sequenze modificate con la controparte WT. Mappare gli indel e verificare che si siano originati nella regione genomica bersaglio. Valuta le loro dimensioni. Se la lunghezza dell'indel non è un multiplo di tre, si verificherà uno spostamento di fotogrammi e verrà eventualmente introdotto un PTC. L'mRNA mutato subirà una degradazione mediata da NMD.

7. Isolamento di cloni su una singola cellula limitando la diluizione (Figura 1.7)

NOTA: L'isolamento di cloni a singola cellula non è obbligatorio. Tuttavia, se si sceglie di farlo, è importante caratterizzare più cloni e confrontare il loro fenotipo con la popolazione policlonale originale.

  1. Prelevare un campione di sospensione cellulare, diluirlo 1/2 con terreno di coltura e valutare la concentrazione (passaggio 2.7.1). La diluizione aumenta la precisione del conteggio.
  2. Eseguire da 2 a 3 fasi di diluizione seriali per raggiungere una concentrazione di 7 cellule/mL. Erogare 100 μl di sospensione cellulare per pozzetto in una piastra a fondo tondo da 96 pozzetti (ovvero 0,7 celle per pozzetto). Lasciare decantare la cellula per alcune ore prima di osservare le piastre al microscopio per identificare i pozzetti contenenti una cellula.
  3. Monitora regolarmente la formazione e la crescita delle colonie e trasferisci le cellule in una piastra di coltura o in un pallone più grande, quando necessario.

8. Caratterizzazione funzionale di cellule THP-1 KO SAMHD1 mediante saggio di restrizione HIV-1

  1. Seminare THP-1 in una piastra di coltura a 24 pozzetti con 0,25 x 106 cellule per pozzetto in 300 μL di RPMI integrato con il 10% di FBS, l'1% di penicillina-streptomicina (RPMI completo) e contenente 300 ng/mL di PMA per la differenziazione. Conservare la piastra in un'incubatrice umidificata (37 °C, 5% CO2) per 24 ore.
  2. Sostituire il mezzo con un mezzo RPMI completo privo di PMA e rimettere la piastra nell'incubatrice per altre 24 ore.
  3. Utilizzando una pompa a vuoto, aspirare tutto il terreno di coltura. Aggiungere 250 μl di soluzione virale contenente stock per HIV-1-GFP pseudotipizzata VSVg (MOI = 0,5 IFU/cellula). Includi un controllo non infetto. Posizionare la piastra a 4 °C per 2 ore per sincronizzare l'infezione.
  4. Lavare le celle una volta con RPMI. Aggiungere 500 μl di RPMI completo a ciascun pozzetto e incubare per 48 ore in condizioni standard (il tempo può essere regolato).
  5. Dopo aver rimosso il terreno di coltura, lavare le cellule una volta con 1x PBS freddo. Quindi, aggiungere 100 μl di tripsina-EDTA allo 0,05% in ciascun pozzetto. Porre la piastra in un incubatore a 37 °C fino a quando le cellule non sono completamente staccate (5 minuti dovrebbero essere sufficienti) prima di aggiungere 200 μL di RPMI completo per inattivare l'enzima. Trasferire 250 μl da ciascun pozzetto in una piastra a fondo tondo da 96 pozzetti (assicurarsi che il citometro a flusso accetti piastre di coltura).
  6. Centrifugare la piastra (757 x g, 3 min, decelerazione = 6, 20 °C) e aspirare il surnatante utilizzando una pipetta multicanale. Risospendere il pellet con 100 μl di PFA al 4% e incubare a 4 °C per 10 minuti. Aggiungere 100 μl di 1X PBS freddo.
  7. Analizzare il tasso di infezione, rappresentato dalle cellule GFP-positive, mediante citometria a flusso (vedere la Figura 2 supplementare per una strategia di gating suggerita).

Risultati

Una linea cellulare THP-1 è stata generata esprimendo stabilmente la proteina reporter GFP (THP-1_GFP) (Figura 2A) e utilizzata come strumento per stabilire un protocollo per un'efficiente edizione genica mediata da CRISPR-Cas9. A questo scopo, 3 sgRNA mirati al gene EGFP sono stati progettati con lo strumento web CRISPOR29 (Figura 2B), che sono stati simultaneamente complessati con Cas9 a un ra...

Discussione

Qui, viene descritto un protocollo per ottenere un editing mediato da CRISPR della linea cellulare THP-1. L'approccio si basa sul trasferimento di RNP sgRNA/Cas9 preassemblati mediante elettroporazione/nucleofezione. Questa strategia è stata scelta per limitare gli effetti off-target che potenzialmente insorgono in seguito all'integrazione lentivirale della cassetta sgRNA/Cas9, producendo un'espressione persistente della nucleasi. Sono stati selezionati più sgRNA che hanno come bersagl...

Divulgazioni

Tutti gli autori non hanno conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Siamo grati a JP Concordet (MNHN, U1154/UMR7196, Parigi), G. Bossis (IGMM, Montpellier) e D. Schlüter (Hannover Medical School, Germania) per la condivisione dei protocolli e per la discussione. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea (accordo di sovvenzione n. 101017572 alla AZ) e ANRS (ECTZ162721 di sovvenzione alla AZ). L'infrastruttura di ricerca IDMIT (Infectious Disease Model and Innovative Therapies) è sostenuta dal "Programme investissement d'avenir (PIA)" di riferimento ANR_11_INSB_0008.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm syringe filterClearLine146560_
0.4 % trypan blueBeckman Coulter383200_
1.5 mL tubeEppendorf3810X_
24-well plateCorning353047_
6x TriTrack DNA Loading DyeThermo scientificR1161_
75 cm² Culture Flask Vented CapCorning353136_
8-Strip PCR Tubes with CapsLife technologiesAM12230_
96-well plates Flat bottomCorning353072_
96-well plates Round bottomCorning353077_
AgaroseEuromedexD5_
ATGpr__https://atgpr.dbcls.jp/
ChemiDoc Imaging SystemBIO-RAD12003153_
Counting slideNanoEntekDHC-N04_
CRISPOR__http://crispor.gi.ucsc.edu/
DPBSGibco14190094_
EnsemblEMBL-EBI_https://www.ensembl.org/index.html
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF7524_
FlowJoBD Life Sciencesv10.10_
GeneRuler 100 bp Plus DNA LadderThermo scientificSM0323_
Genome Data ViewerNCBI_https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/
GraphPad PrismDotmatics_Version 9.3.1
Herculase II Fusion DNA PolymerasesAgilent600679_
ICE CRISPR Analysis ToolSynthego_https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis
Image Lab TouchBIO-RAD_Version 2.4.0.03
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SIncluded with T7EI M0302S
Neon Kit, 10 µLInvitrogenMPK1025KElectroporation kit containing tips, tubes, buffer R and E
Neon Transfection SystemInvitrogenMPK5000_
NetStart 1.0__https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/
Nuclease-free WaterSynthego__
PCR primer (EGFP)Eurofins_Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT
PCR primer (SAMHD1)Eurofins_Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122_
PFAElectron Microscopy Sciences15714_
PMASigma-AldrichP8139_
PrimerQuestIDT_https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104_
QuickExtract DNA Extraction SolutionBiosearch TechnologiesQE09050_
RPMI 1640, GlutaMAXGibco61870010_
SnapGene ViewerDotmatics_Version 7
SpCas9 2NLS NucleaseSynthego__
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102_
Synthetic sgRNA (EGFP)Synthego_#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG
Synthetic sgRNA (SAMHD1)Synthego_#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU
Syringe Plastipak Luer LockBD301229_
T100 Thermal CyclerBIO-RAD1861096_
T7 endonuclease INew England BiolabsM0302S_
TAE buffer UltraPure, 10xInvitrogen15558026400 mM Tris-Acetate, 10 mM EDTA
THP-1 cellsATCCTIB-202_
Trypsin-EDTA (0,05 %)Gibco25300054_
ZE5 Cell AnalyzerBIO-RAD12014135_

Riferimenti

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