THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

Özet

THP-1 hücre hattı, biyoloji ile ilgili çeşitli araştırma alanlarında insan monositlerinin / makrofajlarının işlevlerini araştırmak için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makale, sağlam ve tekrarlanabilir fenotipik verilerin üretilmesini sağlayan verimli CRISPR-Cas9 tabanlı mühendislik ve tek hücreli klon izolasyonu için bir protokolü açıklamaktadır.

Özet

İnsan akut monositik lösemi (AML) THP-1 hücre hattı, insan immün yetmezlik virüsü (HIV) gibi önemli insan patojenleri ile etkileşimleri de dahil olmak üzere, insan monositinden türetilmiş makrofajların işlevlerini incelemek için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Miyeloid kökenli diğer ölümsüzleştirilmiş hücre dizileriyle karşılaştırıldığında, THP-1 hücreleri birçok sağlam enflamatuar sinyal yolunu korur ve forbol-12-miristat 13-asetat (PMA) ile tedavi edildiğinde makrofajlara farklılaşma yeteneği de dahil olmak üzere birincil monositlerinkine daha çok benzeyen fenotipik özellikler gösterir. Hedeflenen gen nakavt (KO) yoluyla THP-1 hücrelerini tasarlamak için CRISPR-Cas9 teknolojisinin kullanılması, virüs-konak etkileşimleri de dahil olmak üzere bağışıklıkla ilgili mekanizmaları daha iyi karakterize etmek için güçlü bir yaklaşım sağlar. Bu makale, önceden monte edilmiş Cas9:sgRNA ribonükleoproteinlerini hücre çekirdeğine iletmek için elektroporasyon kullanan verimli CRISPR-Cas9 tabanlı mühendislik için bir protokolü açıklamaktadır. Aynı lokusu biraz farklı pozisyonlarda hedefleyen çoklu sgRNA'ların kullanılması, büyük DNA fragmanlarının silinmesine neden olur, böylece T7 endonükleaz I testi tarafından değerlendirildiği gibi düzenleme verimliliğini artırır. Genetik düzeyde CRISPR-Cas9 aracılı düzenleme, Sanger dizilemesi ve ardından CRISPR Düzenlemelerinin Çıkarımı (ICE) analizi ile doğrulandı. Protein tükenmesi, fonksiyonel bir test ile birlikte immünoblotlama ile doğrulandı. Bu protokol kullanılarak, hedeflenen lokusta %100'e kadar indels ve protein ekspresyonunda %95'in üzerinde bir azalma elde edildi. Yüksek düzenleme verimliliği, seyreltmeyi sınırlayarak tek hücreli klonları izole etmeyi kolaylaştırır.

Giriş

THP-1, akut lösemiden (AML) muzdarip bir hastadan izole edilen ve primer monositlerinkine çok benzeyen fenotipik özellikler gösteren bir insan monosit türevi hücre hattıdır¹. Fenotip olarak hem sınırlı yaşam süresi hem de donörler arası / donör içi değişkenliği göstermeyen ve bölünmeyen primer monosit türevli makrofajlarla karşılaştırıldığında, THP-1 hücreleri neredeyse sonsuza kadar kültürlenebilir ve sonuçların tekrarlanabilirliğini destekleyen daha homojen bir davranışa sahip olabilir ^2,3,4,5,6. Özellikle, THP-1 hücreleri, forbol-12-miristat 13-asetat (PMA) ile makrofaj benzeri bir fenotipe doğru farklılaşabilir, bu da onları monositlerin / makrofajların enflamatuar sinyallere^{tepkilerini araştırmak} için yaygın olarak kullanılan bir in vitro model haline getirir 7,8,9,10,11,12,13 veya HIV 14 dahil olmak üzere klinik olarak ilgili insan patojenlerinin neden olduğu enfeksiyon^,15,16. THP-1 hücrelerini genetik olarak tasarlama olasılığı, biyoloji ile ilgili birçok araştırma alanında ilgi çekicidir.

Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar-CRISPR ilişkili protein 9 (CRISPR-Cas9), bir genetik mühendisliği aracı olarak yeniden programlanmış, istilacı viral genomları parçalamak için RNA güdümlü nükleaz üzerinde geçiş yapan prokaryotik adaptif bir bağışıklık sistemidir¹⁷. Genom düzenleme süreci üç adımda ilerler: tanıma, bölünme ve onarım. Tek kılavuzlu bir RNA (sgRNA), Cas9 nükleazını 20 bp kılavuz dizisi ile baz eşleşmesi yoluyla belirli bir genomik lokusa alır. 20 bp genomik hedef dizinin doğrudan 3'ü olan bir Protospacer Bitişik Motif (PAM) dizisinin varlığı, 17 ve 18 (PAM'ın 3-bp 5'i) arasındaki her iki DNA zincirinde Cas9 aracılı çözülmeyi ve bölünmeyi tetikler. Elde edilen çift iplikli kopma (DSB), iki ana onarım yolu tarafından işlenir. Hasarlı lokus ile homoloji taşıyan bir onarım şablonunun yokluğunda, hataya eğilimli Homolog Olmayan Uç Birleştirme (NHEJ) yolu, rastgele nükleotid eklemeleri ve/veya delesyonları (indels) başlatacak ve potansiyel olarak çerçeve kayması mutasyonlarına ve/veya erken sonlandırma kodonlarının (PTC) eklenmesine yol açacaktır. Buna karşılık, PTC içeren mRNA'lar, anlamsız aracılı mRNA bozunması (NMD) yolu tarafından bozunma ile hedeflenir ve sonuçta protein ekspresyonu/işlevini^bozar 18,19,20. Alternatif olarak, şablona bağımlı Homoloji Yönelimli Onarım (HDR) yolu DSB'yi çalıştırabilir ve aslına uygun olarak onarabilir. Bu mekanizma, knock-in'ler ve baz ikameleri dahil olmak üzere hassas gen düzenlemesi elde etmek için kullanılmıştır. Hücre döngüsü durumunun, DSB onarım yolunun seçimini etkileyen önemli bir faktör olduğunu belirtmekte fayda var. Gerçekten de, NHEJ hücre döngüsünün tüm aşamalarında aktiftir, HDR ise esas olarak S / G2 fazları²¹ ile sınırlıdır.

THP-1 hücreleri süspansiyon halinde büyür ve plazmid DNA ile transfekte edilmesi herkesin bildiği gibi zordur, bu da muhtemelen canlılıklarını ve / veya farklılaşma kapasitelerini de değiştiren bir prosedürdür^22,23. Hem Cas9'u hem de sgRNA'yı kodlayan HIV-1 bazlı lentiviral vektörlerle transdüksiyon, genellikle ilgilenilen bir geni nakavt etmek (KO) için kullanılır²⁴. Cas9/sgRNA kasetinin hücresel genoma entegrasyonu, uzun süreli ekspresyon ve verimli KO sağlar, ancak aynı zamanda hedef dışı etkilerin kalıcı bir kaynağıdır²⁵. Alternatif olarak, önceden monte edilmiş Cas9:sgRNA ribonükleoproteinleri (RNP'ler), elektrik darbelerinin uygulanması üzerine hem plazma hem de nükleer zarlarda geçici gözenek oluşumunu içeren bir yöntem olan elektroporasyon ile verilir. Hücre canlılığını korumak, bu yaklaşımı gerçekleştirirken önemli bir zorluktur.

Burada, verimli CRISPR-Cas9 tabanlı düzenleme elde etmek için bir protokol oluşturmak için bir araç olarak hizmet etmek üzere GFP'yi (THP-1_GFP) kararlı bir şekilde ifade eden bir THP-1 hücre hattı üretildi. Aynı anda üç sgRNA kullanarak EGFP genini inaktive etmek için bir strateji tasarlandıktan sonra (çoklu kılavuz yaklaşımı), bir okuma olarak GFP ekspresyonu kullanılarak çeşitli elektroporasyon koşulları arasında KO etkinliği belirlendi. Hücre proliferasyonu paralel olarak izlendi. Gen düzenleme, hem bir T7 endonükleaz I (T7EI) testi hem de Sanger dizilimi ile doğrulandı, ardından CRISPR Düzenlemelerinin Çıkarımı (ICE) algoritması²⁶ ile analiz edildi. THP-1 hücrelerinin elektroporasyondan sonra normal büyüme oranlarını geri kazanmasıyla %95'e varan GFP ekspresyonu azalması sağlayan parametreler, endojen bir geni (SAMHD1) inaktive etmek ve tek hücreli THP-1 klonları üretmek için başarıyla kullanıldı.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. CRISPOR ile kılavuz tasarımı (Şekil 1.1)

NOT: SnapGene Viewer yazılımı, düzenleme hedef bölgesine ve ilgilenilen gen içindeki PCR primer hibridizasyonunun konumuna açıklama eklemek için 4, 7 ve 10. adımlarda kullanılabilir.

1. Ensembl web sitesine (www.ensembl.org) gidin. Arama kutusuna bir tür seçin ve ilgilendiğiniz genin adını girin. Git'e tıklayın. Gene karşılık gelen sonucu seçin (transkript değil).
2. Transkript tablosunu göster'e tıklayın ve ardından Biotype sütununda altın etiketli Protein kodlamasına karşılık gelen Transkript Kimliğini seçin. Transkript sayfasına girdikten sonra, soldaki menüden Exons'a tıklayın.
3. Aşağı kaydırın ve Sırayı indir'e tıklayın. Dosya biçiminin MOSTA olduğundan emin olun. Ayarlar - Dahil Edilen Diziler'de, Genomik dizi dışındaki her şeyin seçimini kaldırın.
   Transkript kutusunun her iki ucundaki Yan sırayla "500" sayısını girin. Önizleme'ye tıklayın, tüm diziyi seçin (başlık olmadan yalnızca nükleotidler) ve kopyalayın (Ctrl+C).
4. SnapGene Viewer'ı açın ve Yeni > DNA dosyasına tıklayın. Sırayı (Ctrl+V) Sıra oluştur kutusuna yapıştırın. Ortak özellikleri algıla seçeneğinin işaretini kaldırın ve Topoloji'de Doğrusal'ı seçin.
   Dosyayı yeniden adlandırın ve Oluştur'a tıklayın. Soldaki menüde Enzimleri göster (ilk simge) seçimini kaldırın. Pencerenin alt kısmında, Sıra sekmesini seçin.
   NOT: Bu adım, ekzonlar, intronlar ve 500 bp yan diziler (isteğe bağlı) dahil olmak üzere tüm gen dizisinin alınmasına izin verir. Bu son bilgi, ilk ekzon içinde yer alan bir hedef bölgenin amplifikasyonu için PCR primerleri tasarlamak için kullanışlıdır.
5. Ensembl web sitesine geri dönün, dosya önizlemesinde yukarı kaydırın ve Geri'ye tıklayın. Şimdi, Dosya biçimini RTF olarak değiştirin. Ayarlar - Dahil Edilen Diziler'de, Ekzonlar dışındaki her şeyin seçimini kaldırın. Varyasyonları göster bölümünde Hayır'ı seçin. Sayfanın üst kısmındaki İndir'e tıklayın.
6. Ekzon dizisini içeren ve ilk ATG'den başlayarak kodlama dizisini mavi renkte gösteren indirilen dosyayı (Word ile) açın. CRISPR-Cas9 tarafından yönlendirilen düzenleme tarafından hedeflenecek eksonu seçin (öneriler için aşağıya bakın), seçin ve kopyalayın (Ctrl + C).
   1. Hedeflenen ekson, proteinin işlevsel olarak önemli bir alanını kodlayan erken bir ekzon veya bir ekzondur. 3' UTR'ye yakın geç bir eksonda bir PTC'nin kurulmasının muhtemelen NMD'yi ortaya çıkarmayacağını ve bunun da C-terminal olarak kesilmiş bir proteinin ekspresyonuna yol açacağını belirtmekte fayda var. Tersine, bir PTC'nin doğal başlatma bölgesine proksimalde erken bir ekzon sokulması, gayri meşru çeviri riski (ITL, diğer adıyla alternatif çeviri başlatma (ATI)) riski ile ilişkilidir ve bu, ilk ATG kodonunun akış aşağısındaki bir çerçeve içi çeviri başlatma bölgelerinde (TIS) başlayan N-terminal olarak kesilmiş bir proteinin beklenmedik ekspresyonunu verir. Bu ikinci riski azaltmak için, ATGpr²⁷ (atgpr.dbcls.jp) ve/veya NetStart 1.0²⁸ (services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/) kullanılarak alternatif TIS oluşumunun değerlendirilmesi tavsiye edilir.
   2. Hedef ekzonun bir kodlama dizisi içerdiğinden emin olun. Bununla birlikte, silinen parçaya dahil etmek için ilk ATG'nin yukarı akışında 5'UTR bölgesi ile bir sgRNA tavlaması seçmek yararlı olabilir.
   3. İdeal olarak, hedeflenen ekson, genin tüm protein kodlayan transkript varyantları için ortak olmalıdır. İlgilenilen geni arayarak NCBI'nin Genom Veri Görüntüleyicisi'nde (www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/) durumun böyle olup olmadığını kontrol edin.
      Görüntüleme penceresindeki gen adına (yeşil renkte) tıklamak, transkript varyantlarını (mor renkte) gösterecektir. Ekzonlar bir dikdörtgen ile temsil edilir.
7. SnapGene Viewer'da, ekzon dizisini aramak için Ctrl+F, Ctrl+V ve ardından Enter tuşlarına basın. Yeni bir özellik eklemek için Ctrl+T tuşlarına basın, adlandırın, türü "ekzon" olarak değiştirin ve Tamam'a tıklayın.
8. CRISPOR web sitesine (http://crispor.gi.ucsc.edu/) gidin ve ekzon dizisini Adım 1'e yapıştırın. İlk olarak, Adım 2'de bir referans genomu seçin ve ardından Adım 3'te hedeflenecek PAM tipini, tipik olarak SpCas9 için 20bp-NGG seçin. GÖNDER'e tıklayın.
9. Aralarında 150 bp'ye kadar olacak şekilde iki sgRNA seçin, ardından aralarında üçüncü bir sgRNA seçin. İşte sgRNA seçimi için bazı yönergeler:
   1. MIT özgüllük skoru, hedef dışı etkilerle ilgilidir. Daha yüksek bir puan, daha az potansiyel hedef dışı olduğunu gösterir. Sağ sütun, konumlarıyla birlikte (bir ekson, bir intron veya bir intergenik bölgede) en olasıdan en az olasıya doğru sıralanmış, tahmin edilen üç hedef dışı siteyi görüntüler. Tahmin edilen hedef dışı sitelerin tam listesine tümünü göster'e tıklayarak erişilebilir. Mümkünse, MIT puanı >80 olan sgRNA'ları seçin ve 0, 1 veya 2 uyumsuzluk için hedef dışı olmayanlara öncelik verin. Ek olarak, fenotipi etkileme potansiyeli en yüksek olan bir eksonda hedef dışı olan sgRNA'lardan kaçınılmalıdır.
   2. Tahmin edilen etkinlik için Doench '16 puanına bakın. Yüksek bir Doench '16 puanının, sgRNA'nın etkili olma olasılığının daha yüksek olduğunu gösterdiğini unutmayın. Gerçek etkinlik deneysel olarak belirlenmelidir. Bu nedenle, birlikte kullanılması amaçlanmamış olsalar bile, birkaç sgRNA'nın seçilmesi her zaman yararlıdır.
   3. Çok yüksek veya çok düşük bir GC içeriği ve belirli motifler, sgRNA verimliliğine zarar verebilir ve bundan kaçınılmalıdır. Bu parametreler CRISPOR tarafından vurgulanır.
10. sgRNA dizisini ve ilişkili PAM dizisini SnapGene Viewer'daki gen dizisine eklemek için adım 1.7'yi tekrarlayın. Aynı zamanda, oligonükleotid siparişi verirken gereken 5'-3' oryantasyonunu korumak için sgRNA dizisini (PAM olmadan) bir metne veya Excel dosyasına yapıştırın.
11. Hedef bölgenin PCR tabanlı amplifikasyonu için, onu çevreleyen birkaç primer tasarlayın. Amplikon boyutu 800 ile 1000 bp arasında olmalıdır. Bu protokol için primerleri tasarlamak için PrimerQuest kullanıldı (https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest). Alternatif olarak, CRISPOR, hedeflenen genomik bölgeyi ve hedef dışı bölgeleri çoğaltmak için bir primer listesi sağlar. Potansiyel hedef dışı sitelerin tam listesini görüntüledikten sonra (adım 1.9.1), sağ alt köşedeki Hedef dışı primerler'e tıklayın.

2. Elektroporasyon için reaktif ve hücre hazırlığı (Şekil 1.2)

1. Kuyucukları %20 ısıyla inaktive edilmiş (56 ° C, 30 dakika), filtrelenmiş (0.20 μm) fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 500 μL RPMI 1640 ortamı ile doldurarak elektroporasyondan sonra hücreleri geri kazanmak için 24 oyuklu bir kültür plakası hazırlayın. Antibiyotik eklemeyin. Plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 24 saat boyunca elektroporasyona kadar nemlendirilmiş bir inkübatörde tutun.
2. sgRNA'lar kuru olarak gönderilirse, bunları TE tamponu (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) ile 100 μM'lik bir nihai konsantrasyona (yani 1 nmol sgRNA başına 10 μL TE tamponu) rehidre edin. 30 saniye boyunca vorteks, tam rehidrasyona izin vermek için gece boyunca 4 °C'de inkübe edin ve kısa bir pipet homojenizasyonundan sonra sgRNA stok çözeltisini -20 °C'de saklayın. Son hacme bağlı olarak, birden fazla donma-çözülme döngüsünden kaçınmak için alikotlar yapın.
3. 100 μM stok çözeltisini nükleaz içermeyen suda seyrelterek 30 μM'lik bir nihai konsantrasyonda çalışan bir sgRNA çözeltisi hazırlayın. 30 saniye boyunca vorteksleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
4. Cas9:sgRNA RNP'lerini, üç 30 μM sgRNA'nın her birinin 1 μL'sini ve 0.5 μL 20 μM Cas9 çözeltisini 3.5 μL resüspansiyon tamponu R'de aynı anda seyrelterek 1:9 molar oranda birleştirin, elektroporasyon kitinde bulunur (bir deneysel koşul için 7 μL'lik nihai hacim; buna göre ölçeklendirin). Kısa bir süre vorteks yapın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
5. Bu arada, 0,5 μL 20 μM Cas9'dan 6,5 μL resüspansiyon tamponu R. Vortex'e kısaca girerek düzenlenmemiş bir kontrol hazırlayın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
6. Elektroporasyon koşulu başına 12 μL'lik bir nihai hacim için tüm numunelere 5 μL yeniden süspansiyon tamponu R ekleyin.
7. THP-1 hücrelerini elektroporasyon için hazırlayın.
   1. Tripan mavisi dışlama testi ile konsantrasyonu ve canlılığı değerlendirmek. Hücreleri %0.4'lük bir tripan mavisi boyama solüsyonunda 1: 2 oranında seyreltin. 30 sn inkübasyondan sonra, iyice homojenize edin ve Neubauer tarafından geliştirilmiş ızgara stiline sahip bir sayma odasının duvarına 10 μL ekleyin. Üç büyük kare sayın ve hücre konsantrasyonunu elde etmek için sayıyı 100'e bölün (x10⁶ hücre / mL).
      NOT: Hücrelerin sağlığı, elektroporasyona karşı hassasiyetlerini etkiler. Hücre kültürünün en uygun koşullarda gerçekleştirilmesine özen gösterilmelidir. İnkübatörün dışındaki süre sınırlı olmalı ve tüm reaktifler ve çözeltiler önceden hazırlanmalı ve ısıtılmalıdır.
   2. Her koşul için 0,2 x 10⁶ hücreye eşdeğer bir hacim toplayın ve santrifüjleyin (336 x g, 5 dk, 20 °C).
   3. Süpernatanı bir pipet kullanarak aspire edin ve peleti 500 μL PBS'de yeniden süspanse edin. Tekrar santrifüjleyin (336 x g, 5 dk, 20 °C).
   4. Süpernatanı bir pipet kullanarak dikkatlice aspire edin ve THP-1 hücre peletini 12 μL RNP çözeltisi ile yeniden süspanse edin (adım 2.6).

3. Elektroporasyon sistemi kurulumu ve nükleofeksiyon (Şekil 1.3)

1. Pipet istasyonunu bir biyogüvenlik kabininin altına yerleştirin, desteğe bir elektroporasyon tüpü yerleştirin ve elektroporasyon kitinde bulunan 3 mL tampon E ekleyin.
2. Elektroporasyon cihazını açtıktan sonra, aşağıdaki elektroporasyon parametrelerini ayarlamak için dokunmatik ekranı kullanın: Voltaj = 1 500 V, Süre = 10 ms, Sayı = 3.
3. Elektroporasyon pipetini bir uçla donatın ve 10 μL RNP/THP-1 solüsyonunu aspire edin (adım 2.7.4). Pipeti elektroporasyon tüpüne yerleştirin ve elektroporasyon cihazı ekranında Başlat düğmesine basın. Tamamlandı mesajının görünmesini bekleyin ve pipeti tüpten çıkarın.
4. Hücreleri önceden ısıtılmış 24 oyuklu plakanın bir kuyusuna aktarın ve nazikçe homojenize edin. Plakayı nemlendirilmiş inkübatöre geri koyun ve 72 saat boyunca rahatsız edilmeden dinlenmelerine izin verin.
   NOT: RNP/THP-1 süspansiyonunu pipetlerken herhangi bir kabarcık yapmamaya dikkat edin, çünkü bunlar elektroporasyon prosedürüne müdahale edecektir. Görünür bir elektrik arkı olmadığında bir hata mesajı görüntülenirse, elektroporasyon pipetini tüpten çıkarın ve tekrar Başlat'a basın. Bununla birlikte, kısa bir parlak kıvılcım şeklinde bir elektrik arkı gözlenirse, kabarcıkların varlığına işaret edebilir. Elektroporasyon prosedürü, bir hata mesajı olmasa bile büyük olasılıkla başarısız olacaktır.

4. Elektroporasyondan 72 saat sonra THP-1 geri kazanımı (Şekil 1.4)

1. Elektroporasyondan 72 saat sonra konsantrasyonu değerlendirmek için hücreleri sayın (adım 2.7.1).
2. Yeterli hücre varsa (ör.≥0.6 x 10⁶ hücre / mL), bunları en az% 20 FBS ve% 1 Penisilin-Streptomisin ile desteklenmiş RPMI ile bir faktör 2 seyreltin ve konsantrasyonu 0.3-0.5 x 10^{mL başına 6} hücre arasına getirin. Aksi takdirde, hücrenin 72 saat daha iyileşmesine izin verin.
3. KO doğrulaması için yeterli olana kadar hücreleri geçirin ve yükseltin. Bu arada, tek hücreli klonların izolasyonu başlatılabilir (adım 7).

5. T7EI uyumsuzluk testi ile gen düzenleme doğrulaması (Şekil 1.5)

NOT: T7EI'nin 1 bp'den büyük uyumsuzlukları tanıdığı göz önüne alındığında, tahlil düzenleme verimliliğini hafife alabilir. Bu nedenle, T7EI testi, uygun şekilde modifiye edilmedikçe homozigot hücre popülasyonlarını (yani tek hücreli klonları) taramak için yararlı değildir (adım 5.7).

1. Hücre konsantrasyonunu değerlendirin (adım 2.7.1) ve 1.5 mL'lik bir tüpte 0.1 x 10⁶ hücreye eşdeğer bir hacim çekin. Santrifüj (336 x g, 5 dk, 20 °C), süpernatanı aspire edin ve peleti 500 μL PBS'de yeniden süspanse edin. Tekrar santrifüjleyin ve bir pipet kullanarak, peleti rahatsız etmeden mümkün olduğunca fazla süpernatan aspire edin. Numuneyi hızlı bir şekilde dondurun ve -20 °C'de saklayın.
2. PCR amplifikasyonu için bir matris görevi görmesi için genomik DNA'yı çıkarın.
   1. Peletleri 50 μL DNA ekstraksiyon solüsyonu ile yeniden süspanse edin, homojenize edin ve tüm hacmi 0.2 mL'lik bir PCR tüpüne aktarın. Kısaca vorteks ve santrifüj (3 saniye boyunca darbe).
   2. Tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve 65 °C'de 15 dakika, ardından 98 °C'de 10 dakika ısıtın.
   3. Ekstrakte edilen DNA'yı 90 μL ultra saf su ile seyreltin. Kısaca vorteks ve santrifüj (5.000 x g, 3 s).
3. PCR astarını (Malzeme Tablosuna bakınız) 10 μM'lik (yani 10 pmol/μL) nihai konsantrasyon için ultra saf suda seyreltin.
4. PCR karışımını (aşağıdaki NOT'u izleyerek) 0.2 mL'lik bir PCR tüpünde hazırlayın (bir koşul için son hacim = 50 μL). Genellikle, en az iki koşul olacaktır: KO ve yalnızca Cas9 ile düzenlenmemiş kontrol.
   NOT: Saflaştırılmış genomik DNA: 10 μL; İleri ve geri astar (10 μM): her biri 2,5 μL, nihai konsantrasyon 500 nM; Reaksiyon Tamponu (5x): 10 μL. Eklemeden önce iyice sarın. dNTP'yi karıştırın (her birinden 25 mM): 0.6 μL, her dNTP için 0.3 mM'lik nihai konsantrasyon. DNA polimeraz: 0.5 μL; Ultra saf su: 23,9 μL. Kısa bir süre vorteks ve santrifüj (3 saniye boyunca darbe).
5. Tüpleri termal döngüleyiciye yerleştirin ve PCR programını aşağıdaki ayarlarla çalıştırın:
   NOT: 95 ° C'de 5 dakika boyunca bir döngü, ardından 30 döngü [20 s için 98 ° C (denatürasyon adımı), 15 s için X °C (tavlama adımı), 72 s için 45 ° C (uzama adımı)], ardından 72 ° C'de 2 dakika boyunca bir son döngü. Amplifikasyonun sonunda, tüpleri, vorteks ve santrifüjü kısa bir süre çıkarın (3 saniye boyunca darbe). Tavlama sıcaklığı (X), astarların erime sıcaklığı (Tm) eksi 5 °C'dir.
6. Poliklonal düzenlenmiş bir popülasyon için: 0.2 mL'lik yeni bir tüpte, 19.5 μL'lik bir son hacim için 17.5 μL PCR amplikonu ve 2 μL NEBuffer 2 (10x) ekleyin. Kısaca girdap ve santrifüjleyin (3 saniye boyunca darbe). Alternatif olarak, tek hücreli klonları taramak için, hem düzenlenmiş hem de düzenlenmemiş kontrol hücrelerinden PCR ürünlerinin 1: 1'ini karıştırın (adım 5.6) (Ek Şekil 1).
7. Heterodubleks oluşum için, tüpleri termal döngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 95 °C'de 10 dakika boyunca bir döngü, biri 95 ila 85 °C arasında -2 °C/s'lik bir rampa ile, biri 85 ila 25 °C arasında -0,3 °C/s'lik bir rampa ile ve HOLD'da 10 °C'de bir son soğutma döngüsü.
8. Heterodubleks oluşumundan sonra, tüpe 0.5 μL T7EI çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
9. % 1.2 agaroz jeli hazırlayın:
   1. Agarozu bir cam şişede tartın ve uygun hacimde 1x TAE tamponu (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA, pH 8.3) ekleyin. Kapağı sıkıca vidalamamaya dikkat ederek bir mikrodalgaya koyun. Agaroz kristalleri tamamen çözülene kadar birkaç kez ısıtın.
      NOT: Gerekirse, çözeltiyi karıştırın. Kaynamasına izin vermeyin, aksi takdirde agaroz konsantrasyonunu değiştirerek hacim azalır.
   2. 1/20.000 oranında seyreltilmiş DNA jel boyasını ekleyin ve iyice karıştırın.
   3. Agaroz çözeltisini bir kalıba dökün, bir tarak ekleyin ve oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.
10. 5 μL T7EI-sindirim ürününü (adım 5.9) veya sindirilmemiş PCR ürününü 5 μL su ve 2 μL 6x DNA yükleme boyası ile karıştırarak jel elektroforezi için numuneler hazırlayın. Numuneleri ve boyut merdivenini yükleyin ve 45 dakika boyunca 80 V'ta hareket ettirin (zaman, DNA parçalarının beklenen boyutuna bağlı olarak uyarlanabilir). Migrasyon bittikten sonra, uygun bir görüntüleme sistemi ile jelin bir görüntüsünü elde edin.

6. Sanger dizileme analizi ile gen düzenleme doğrulaması (Şekil 1.6)

1. Genetik modifikasyonu karakterize etmek için PCR ürünlerini saflaştırın (adım 5.4) ve Sanger dizilemesinden sonra sonuçları ICE aracı (https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis) ile analiz edin.
2. Modifikasyonlara rağmen bir proteinin üretilip üretilemeyeceğini kontrol edin.
   1. ICE sonuçlarını indirin ve contribs.txt dosyasını açın.
   2. Düzenlenen dizileri WT muadili ile karşılaştırın. İndelleri haritalayın ve hedeflenen genomik bölgede ortaya çıktıklarını doğrulayın. Boyutlarını değerlendirin. İç uzunluk üçün katı değilse, bir çerçeve kayması meydana gelecek ve muhtemelen bir PTC tanıtılacaktır. Mutasyona uğramış mRNA'nın NMD aracılı bozunmaya uğraması bekleniyor.

7. Seyreltmeyi sınırlayarak tek hücreli klon izolasyonu (Şekil 1.7)

NOT: Tek hücreli klonların izolasyonu zorunlu değildir. Bununla birlikte, bunu yapmayı seçerseniz, birden fazla klonu karakterize etmek ve fenotiplerini orijinal poliklonal popülasyonla karşılaştırmak önemlidir.

1. Bir hücre süspansiyonu örneği alın, kültür ortamı ile 1/2 oranında seyreltin ve konsantrasyonu değerlendirin (adım 2.7.1). Seyreltme, sayım doğruluğunu artırır.
2. 7 hücre / mL konsantrasyona ulaşmak için 2 ila 3 seri seyreltme adımı gerçekleştirin. Yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakada (yani, oyuk başına 0.7 hücre) oyuk başına 100 μL hücre süspansiyonu dağıtın. Bir hücre içeren kuyucukları tanımlamak için mikroskopta plakaları gözlemlemeden önce hücrenin birkaç saat boşalmasına izin verin.
3. Düzenli olarak koloni oluşumunu ve büyümesini izleyin ve gerektiğinde hücreleri daha büyük bir kültür plakasına veya şişeye aktarın.

8. THP-1 KO SAMHD1 hücrelerinin HIV-1 kısıtlama testi ile fonksiyonel karakterizasyonu

1. % 10 FBS,% 1 Penisilin-Streptomisin (tam RPMI) ile desteklenmiş ve farklılaşma için 300 ng / mL PMA içeren 300 μL RPMI'de oyuk başına 0.25 x^{10 6} hücreli 24 oyuklu bir kültür plakasında tohum THP-1. Plakayı 24 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde (37 °C,% 5 CO₂) tutun.
2. Ortamı PMA içermeyen tam bir RPMI ortamıyla değiştirin ve plakayı 24 saat daha inkübatöre geri koyun.
3. Bir vakum pompası kullanarak tüm kültür ortamını aspire edin. 250 μL VSVg psödotipli HIV-1-GFP viral stok içeren çözelti ekleyin (MOI = 0.5 IFU/hücre). Enfekte olmayan bir kontrol ekleyin. Enfeksiyonu senkronize etmek için plakayı 2 saat boyunca 4 ° C'ye yerleştirin.
4. Hücreleri RPMI ile bir kez yıkayın. Her oyuğa 500 μL tam RPMI ekleyin ve standart koşullarda 48 saat inkübe edin (zaman ayarlanabilir).
5. Kültür ortamını çıkardıktan sonra, hücreleri bir kez soğuk 1x PBS ile yıkayın. Ardından, her oyuğa 100 μL% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin. Enzimi inaktive etmek için 200 μL tam RPMI eklemeden önce plakayı hücreler tamamen ayrılana kadar (5 dakika yeterli olmalıdır) 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin. Her oyuktan 250 μL'yi 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya aktarın (akış sitometresinin kültür plakalarını kabul ettiğinden emin olun).
6. Plakayı santrifüjleyin (757 x g, 3 dk, yavaşlama = 6, 20 °C) ve çok kanallı bir pipet kullanarak süpernatanı aspire edin. Peleti 100 μL %4 PFA ile yeniden süspanse edin ve 4 °C'de 10 dakika inkübe edin. 100 μL soğuk 1X PBS ekleyin.
7. Akış sitometrisi ile GFP pozitif hücreler tarafından temsil edilen enfeksiyon oranını analiz edin (önerilen bir geçit stratejisi için Ek Şekil 2'ye bakınız).

Sonuçlar

GFP raportör proteinini (THP-1_GFP) stabil bir şekilde eksprese eden bir THP-1 hücre hattı oluşturuldu (Şekil 2A) ve verimli bir CRISPR-Cas9 aracılı gen baskısı için bir protokol oluşturmak için bir araç olarak kullanıldı. Bu amaçla, EGFP genini hedefleyen 3 sgRNA, CRISPOR web aracı²⁹ (Şekil 2B) ile tasarlandı ve bunlar aynı anda Cas9 ile 9:1'lik bir molar oranda kompleks hal...

Tartışmalar

Burada, THP-1 hücre hattının başarılı bir CRISPR aracılı düzenlemesini elde etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Yaklaşım, önceden monte edilmiş sgRNA/Cas9 RNP'lerin elektroporasyon/nükleofeksiyon yoluyla transferine dayanır. Bu strateji, sgRNA/Cas9 kasetinin lentiviral aracılı entegrasyonu üzerine potansiyel olarak ortaya çıkan ve nükleazın kalıcı ekspresyonunu sağlayan hedef dışı etkileri sınırlamak için seçilmiştir. İlgili geni hedefleyen çok...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm syringe filter	ClearLine	146560	_
0.4 % trypan blue	Beckman Coulter	383200	_
1.5 mL tube	Eppendorf	3810X	_
24-well plate	Corning	353047	_
6x TriTrack DNA Loading Dye	Thermo scientific	R1161	_
75 cm² Culture Flask Vented Cap	Corning	353136	_
8-Strip PCR Tubes with Caps	Life technologies	AM12230	_
96-well plates Flat bottom	Corning	353072	_
96-well plates Round bottom	Corning	353077	_
Agarose	Euromedex	D5	_
ATGpr	_	_	https://atgpr.dbcls.jp/
ChemiDoc Imaging System	BIO-RAD	12003153	_
Counting slide	NanoEntek	DHC-N04	_
CRISPOR	_	_	http://crispor.gi.ucsc.edu/
DPBS	Gibco	14190094	_
Ensembl	EMBL-EBI	_	https://www.ensembl.org/index.html
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524	_
FlowJo	BD Life Sciences	v10.10	_
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo scientific	SM0323	_
Genome Data Viewer	NCBI	_	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/
GraphPad Prism	Dotmatics	_	Version 9.3.1
Herculase II Fusion DNA Polymerases	Agilent	600679	_
ICE CRISPR Analysis Tool	Synthego	_	https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis
Image Lab Touch	BIO-RAD	_	Version 2.4.0.03
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with T7EI M0302S
Neon Kit, 10 µL	Invitrogen	MPK1025K	Electroporation kit containing tips, tubes, buffer R and E
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	_
NetStart 1.0	_	_	https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/
Nuclease-free Water	Synthego	_	_
PCR primer (EGFP)	Eurofins	_	Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT
PCR primer (SAMHD1)	Eurofins	_	Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	_
PFA	Electron Microscopy Sciences	15714	_
PMA	Sigma-Aldrich	P8139	_
PrimerQuest	IDT	_	https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	_
QuickExtract DNA Extraction Solution	Biosearch Technologies	QE09050	_
RPMI 1640, GlutaMAX	Gibco	61870010	_
SnapGene Viewer	Dotmatics	_	Version 7
SpCas9 2NLS Nuclease	Synthego	_	_
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102	_
Synthetic sgRNA (EGFP)	Synthego	_	#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG
Synthetic sgRNA (SAMHD1)	Synthego	_	#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU
Syringe Plastipak Luer Lock	BD	301229	_
T100 Thermal Cycler	BIO-RAD	1861096	_
T7 endonuclease I	New England Biolabs	M0302S	_
TAE buffer UltraPure, 10x	Invitrogen	15558026	400 mM Tris-Acetate, 10 mM EDTA
THP-1 cells	ATCC	TIB-202	_
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Gibco	25300054	_
ZE5 Cell Analyzer	BIO-RAD	12014135	_