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Resumen

La línea celular THP-1 se utiliza ampliamente como modelo para investigar las funciones de los monocitos/macrófagos humanos en diversas áreas de investigación relacionadas con la biología. Este artículo describe un protocolo para la ingeniería eficiente basada en CRISPR-Cas9 y el aislamiento de clones de una sola célula, lo que permite la producción de datos fenotípicos robustos y reproducibles.

Resumen

La línea celular THP-1 de leucemia monocítica aguda (LMA) humana se utiliza ampliamente como modelo para estudiar las funciones de los macrófagos derivados de monocitos humanos, incluida su interacción con patógenos humanos importantes, como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En comparación con otras líneas celulares inmortalizadas de origen mieloide, las células THP-1 conservan muchas vías de señalización inflamatoria intactas y muestran características fenotípicas que se asemejan más a las de los monocitos primarios, incluida la capacidad de diferenciarse en macrófagos cuando se tratan con forbol-12-miristato 13-acetato (PMA). El uso de la tecnología CRISPR-Cas9 para diseñar células THP-1 a través de la eliminación de genes (KO) específicos proporciona un enfoque poderoso para caracterizar mejor los mecanismos relacionados con el sistema inmunitario, incluidas las interacciones virus-huésped. Este artículo describe un protocolo para la ingeniería eficiente basada en CRISPR-Cas9 que utiliza la electroporación para administrar ribonucleoproteínas Cas9:sgRNA preensambladas en el núcleo de la célula. El uso de múltiples sgRNAs dirigidos al mismo locus en posiciones ligeramente diferentes da como resultado la deleción de grandes fragmentos de ADN, lo que aumenta la eficiencia de la edición, según lo evaluado por el ensayo de endonucleasa T7 I. La edición mediada por CRISPR-Cas9 a nivel genético se validó mediante secuenciación de Sanger seguida de un análisis de inferencia de ediciones CRISPR (ICE). La depleción proteica se confirmó mediante inmunotransferencia junto con un ensayo funcional. Con este protocolo, se lograron hasta un 100% de indels en el locus objetivo y una disminución de más del 95% en la expresión de proteínas. La alta eficiencia de edición hace que sea conveniente aislar clones de una sola célula limitando la dilución.

Introducción

THP-1 es una línea celular derivada de monocitos humanos aislada de un paciente que padece leucemia aguda (LMA), que muestra características fenotípicas muy parecidas a las de los monocitos primarios1. En comparación con los macrófagos primarios derivados de monocitos, que no se dividen y muestran una vida útil limitada y una variabilidad entre donantes e intradonantes en el fenotipo, las células THP-1 pueden cultivarse prácticamente para siempre y tienen un comportamiento más homogéneo que favorece la reproducibilidad de los resultados 2,3,4,5,6 . En particular, las células THP-1 se pueden diferenciar hacia un fenotipo similar al de los macrófagos con forbol-12-miristato 13-acetato (PMA), lo que las convierte en un modelo in vitro ampliamente utilizado para investigar las respuestas de monocitos/macrófagos a las señales inflamatorias 7,8,9,10,11,12,13 o la infección por patógenos humanos clínicamente relevantes, incluido el VIH 14,15,16. La posibilidad de modificar genéticamente las células THP-1 es de interés en muchas áreas de investigación relacionadas con la biología.

La proteína 9 asociada a CRISPR (CRISPR-Cas9) es un sistema inmunitario adaptativo procariota que se basa en la nucleasa guiada por ARN para degradar los genomas virales invasores, que ha sido reprogramada como una herramienta de ingeniería genética17. El proceso de edición del genoma se desarrolla en tres etapas: reconocimiento, escisión y reparación. Un ARN de una sola guía (sgRNA) recluta la nucleasa Cas9 a un locus genómico específico a través del emparejamiento de bases con su secuencia guía de 20 pb. La presencia de una secuencia de motivo adyacente al protoespaciador (MAP) directamente a 3' de la secuencia objetivo genómica de 20 pb desencadena el desenrollado y la escisión mediados por Cas9 en ambas hebras de ADN entre las posiciones 17 y 18 (3-pb 5' del PAM). La rotura de doble cadena (DSB) resultante es procesada por dos vías de reparación principales. En ausencia de una homología de rodamiento de plantilla de reparación con el locus dañado, la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) propensa a errores introducirá inserciones y/o deleciones aleatorias de nucleótidos (indels), lo que podría conducir a mutaciones de cambio de marco y/o la introducción de codones de terminación prematura (PTC). A su vez, los ARNm que contienen PTC son objeto de degradación por la vía de desintegración del ARNm (NMD) mediada por sinsentido, lo que en última instancia interrumpe la expresión/función de la proteína 18,19,20. Alternativamente, la vía de reparación dirigida por homología (HDR) dependiente de la plantilla puede operar y reparar fielmente el DSB. Este mecanismo se ha aprovechado para lograr una edición genética precisa, incluidos los knock-ins y las sustituciones de bases. Vale la pena señalar que el estado del ciclo celular es un factor importante que influye en la elección de la vía de reparación de DSB. De hecho, NHEJ está activo en todas las etapas del ciclo celular, mientras que HDR se restringe principalmente a las fases S/G221.

Las células THP-1 crecen en suspensión y son notoriamente difíciles de transfectar con ADN plasmídico, procedimiento que posiblemente también altere su viabilidad y/o capacidad de diferenciación22,23. La transducción con vectores lentivirales basados en el VIH-1 que codifican tanto Cas9 como el sgRNA se emplea a menudo para eliminar (KO) un gen de interés24. La integración del casete Cas9/sgRNA en el genoma celular garantiza una expresión prolongada y un KO eficiente, pero también es una fuente persistente de efectos fuera del objetivo25. Alternativamente, las ribonucleoproteínas (RNP) Cas9:sgRNA preensambladas se administran por electroporación, un método que implica la formación temporal de poros tanto en el plasma como en las membranas nucleares mediante la aplicación de impulsos eléctricos. Preservar la viabilidad celular es un reto importante a la hora de emprender este enfoque.

Aquí, se produjo una línea celular THP-1 que expresa GFP de manera estable (THP-1_GFP) para que sirva como herramienta para establecer un protocolo para lograr una edición eficiente basada en CRISPR-Cas9. Después de diseñar una estrategia para inactivar el gen EGFP utilizando tres sgRNAs simultáneamente (enfoque multiguía), se determinó la eficiencia de KO entre varias condiciones de electroporación utilizando la expresión de GFP como lectura. La proliferación celular se monitoreó en paralelo. La edición génica se confirmó mediante un ensayo de endonucleasa T7 I (T7EI) y secuenciación de Sanger, seguido de un análisis con el algoritmo de inferencia de ediciones CRISPR (ICE)26. Los parámetros que produjeron una disminución de la expresión de GFP de hasta el 95%, con células THP-1 recuperando tasas de crecimiento normales después de la electroporación, se emplearon con éxito para inactivar un gen endógeno (SAMHD1) y producir clones de THP-1 de una sola célula.

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Diseño de guías con CRISPOR (Figura 1.1)

NOTA: El software SnapGene Viewer se puede utilizar en los pasos 4, 7 y 10 para anotar el sitio objetivo de edición y la ubicación de la hibridación del cebador de PCR dentro del gen de interés.

  1. Ir al sitio web de Ensembl (www.ensembl.org). En el cuadro de búsqueda , seleccione una especie y escriba el nombre del gen de interés. Haga clic en Ir. Seleccione el resultado que corresponda al gen (no una transcripción).
  2. Haga clic en Mostrar tabla de transcripción y luego seleccione el ID de transcripción que corresponda a la codificación de proteínas con etiqueta dorada en la columna Biotipo . Una vez en la página de transcripción, haga clic en Exones en el menú de la izquierda.
  3. Desplácese hacia abajo y haga clic en Descargar secuencia. Asegúrese de que el formato de archivo sea FASTA. En Configuración - Secuencias incluidas, anule la selección de todo excepto Secuencia genómica.
    Introduzca el número "500" en Secuencia de flanqueo en cualquiera de los extremos del cuadro de transcripción . Haga clic en Vista previa, seleccione la secuencia completa (solo los nucleótidos sin el encabezado) y cópiela (Ctrl + C).
  4. Abra SnapGene Viewer y haga clic en Nuevo archivo de ADN >. Pegue la secuencia (Ctrl+V) en el cuadro Crear una secuencia . Desactive Detectar entidades comunes y seleccione Lineal en Topología.
    Cambie el nombre del archivo y haga clic en Crear. En el menú de la izquierda, anule la selección de Mostrar enzimas (primer icono). En la parte inferior de la ventana, seleccione la pestaña Secuencia .
    NOTA: Este paso permite la recuperación de la secuencia completa del gen, incluidos los exones, los intrones y las secuencias flanqueantes de 500 pb (opcional). Esta última información es útil para el diseño de cebadores de PCR para la amplificación de un sitio objetivo ubicado dentro del primer exón.
  5. De vuelta en el sitio web de Ensmbl, desplácese hacia arriba en la vista previa del archivo y haga clic en Atrás. Ahora, cambie el formato de archivo a RTF. En Configuración - Secuencias incluidas, anule la selección de todo excepto Exones. En Mostrar variantes, seleccione No. Haga clic en Descargar en la parte superior de la página.
  6. Abra el archivo descargado (con Word), que contiene la secuencia de exones y muestra la secuencia de codificación en azul, comenzando con el ATG inicial. Elija el exón al que se dirigirá la edición dirigida por CRISPR-Cas9 (consulte las recomendaciones a continuación), selecciónelo y cópielo (Ctrl+C).
    1. El exón objetivo es un exón temprano o un exón que codifica un dominio funcionalmente importante de la proteína. Vale la pena señalar que el establecimiento de una PTC en un exón tardío cerca de la UTR 3' probablemente no provocará NMD, lo que conducirá a la expresión de una proteína C-terminal truncada. Por el contrario, la introducción de una PTC en un exón temprano proximal al sitio de iniciación nativo se asocia con un riesgo de traducción ilegítima (ITL, también conocida como iniciación de traducción alternativa (ATI)), que produce la expresión inesperada de una proteína truncada N-terminal que comienza en un sitio de iniciación de traducción (TIS) en el marco aguas abajo del primer codón ATG. Para mitigar este último riesgo, se recomienda evaluar la aparición de TIS alternativos utilizando ATGpr27 (atgpr.dbcls.jp) y/o NetStart 1.028 (services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/).
    2. Asegúrese de que el exón de destino contenga una secuencia de codificación. Sin embargo, podría resultar útil elegir un recocido de sgRNA con la región 5'UTR aguas arriba del ATG inicial para incluirlo en el fragmento delecionado.
    3. Idealmente, el exón objetivo debería ser común a todas las variantes de transcripción del gen que codifican proteínas. Verifique si ese es el caso en el Visor de Datos del Genoma (www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/) del NCBI buscando el gen de interés.
      Al hacer clic en el nombre del gen (en verde) en la ventana de visualización, se mostrarán las variantes de la transcripción (en púrpura). Los exones están representados por un rectángulo.
  7. En SnapGene Viewer, presione Ctrl+F, Ctrl+V y, a continuación, Intro para buscar la secuencia del exón. Presione Ctrl + T para agregar una nueva característica, asígnele un nombre, cambie el tipo a "exón" y haga clic en Aceptar.
  8. Vaya al sitio web de CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/) y pegue la secuencia de exones en el paso 1. En primer lugar, seleccione un genoma de referencia en el paso 2 y, a continuación, el tipo de PAM al que se dirigirá en el paso 3, normalmente 20 pb-NGG para SpCas9. Haga clic en ENVIAR.
  9. Seleccione dos sgRNAs para que estén separados por hasta 150 pb, luego seleccione un tercer sgRNA en el medio. Estas son algunas pautas para la selección de sgRNA:
    1. La puntuación de especificidad del MIT se relaciona con los efectos fuera del objetivo. Una puntuación más alta indica menos posibles objetivos desviados. La columna de la derecha muestra tres sitios fuera del objetivo pronosticados clasificados de mayor a menor probabilidad, junto con sus ubicaciones (en un exón, un intrón o una región intergénica). Se puede acceder a la lista completa de sitios fuera del objetivo previstos haciendo clic en Mostrar todo. Si es posible, seleccione sgRNAs con una puntuación MIT >80, dando prioridad a aquellos sin objetivos desviados para 0, 1 o 2 discrepancias. Además, deben evitarse los sgRNAs con objetivos fuera de un exón, que tienen el mayor potencial para afectar al fenotipo.
    2. Para conocer la eficacia prevista, consulte la puntuación de Doench '16. Tenga en cuenta que una puntuación alta de Doench '16 simplemente indica que es más probable que el sgRNA sea efectivo. La eficacia real debe determinarse experimentalmente. Por esta razón, siempre es útil seleccionar varios sgRNAs, incluso si no están destinados a ser utilizados juntos.
    3. Un contenido de GC demasiado alto o demasiado bajo, así como ciertos motivos, pueden ser perjudiciales para la eficiencia del sgRNA y deben evitarse. Estos parámetros son resaltados por CRISPOR.
  10. Repita el paso 1.7 para agregar la secuencia de sgRNA y la secuencia PAM asociada a la secuencia génica en SnapGene Viewer. Al mismo tiempo, pegue la secuencia de sgRNA (sin el PAM) en un archivo de texto o Excel para conservar la orientación 5'-3' requerida al pedir el oligonucleótido.
  11. Para la amplificación basada en PCR del sitio objetivo, diseñe un par de cebadores a su alrededor. El tamaño del amplicón debe estar entre 800 y 1000 pb. Se utilizó PrimerQuest para diseñar los cebadores para este protocolo (https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest). Alternativamente, CRISPOR proporciona una lista de cebadores para amplificar la región genómica objetivo, así como los sitios fuera del objetivo. Después de mostrar la lista completa de posibles sitios fuera del objetivo (paso 1.9.1), haga clic en Cartillas fuera del objetivo en la esquina inferior derecha.

2. Preparación de reactivos y celdas para electroporación (Figura 1.2)

  1. Prepare una placa de cultivo de 24 pocillos para recuperar las células después de la electroporación llenando los pocillos con 500 μL de medio RPMI 1640 suplementado con un 20% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor (56 °C, 30 min), filtrado (0,20 μm). No agregue antibióticos. Mantener la placa en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h hasta la electroporación.
  2. Si los sgRNAs se envían secos, rehidratarlos con tampón TE (10 mM de Tris, 1 mM de EDTA, pH 8,0) hasta una concentración final de 100 μM (es decir, 10 μL de tampón TE por 1 nmol de sgRNA). Vortex durante 30 s, incubar a 4 °C durante la noche para permitir una rehidratación completa y, después de una breve homogeneización de la pipeta, almacenar la solución madre de sgRNA a -20 °C. Dependiendo del volumen final, haga alícuotas para evitar múltiples ciclos de congelación y descongelación.
  3. Prepare una solución de sgRNA de trabajo a una concentración final de 30 μM diluyendo la solución madre de 100 μM en agua libre de nucleasas. Vórtice durante 30 s e incube 5 min a temperatura ambiente.
  4. Ensamble los RNP Cas9:sgRNA en una proporción molar de 1:9 diluyendo simultáneamente 1 μL de cada uno de los tres sgRNAs de 30 μM y 0,5 μL de soluciones Cas9 de 20 μM en 3,5 μL de tampón de resuspensión R, incluido en el kit de electroporación (volumen final de 7 μL, para una condición experimental; escala correspondiente). Agite brevemente e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  5. Mientras tanto, prepare un control sin editar añadiendo 0,5 μL de 20 μM de Cas9 a 6,5 μL de tampón de resuspensión R. Vortex brevemente e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  6. Añada 5 μL de tampón de resuspensión R a todas las muestras para obtener un volumen final de 12 μL por condición de electroporación.
  7. Prepare las celdas THP-1 para la electroporación.
    1. Evaluar la concentración y viabilidad mediante la prueba de exclusión de azul de tripano. Diluir las células 1:2 en una solución de tinción con azul de tripano al 0,4%. Después de 30 s de incubación, homogeneizar bien y añadir 10 μL en la pared de una cámara de recuento con un estilo de rejilla mejorado por Neubauer. Cuente tres cuadrados grandes y divida la cuenta por 100 para obtener la concentración de células (x106 células/mL).
      NOTA: La salud de las células influye en su sensibilidad a la electroporación. Se debe tener cuidado de realizar el cultivo celular en condiciones óptimas. El tiempo fuera de la incubadora debe ser limitado, y todos los reactivos y soluciones deben prepararse y calentarse con anticipación.
    2. Para cada condición, recoja un volumen equivalente a 0,2 x 106 celdas y centrifugue (336 x g, 5 min, 20 °C).
    3. Aspirar el sobrenadante con una pipeta y volver a suspender el pellet en 500 μL de PBS. Vuelva a centrifugar (336 x g, 5 min, 20 °C).
    4. Aspirar el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta y resuspender el pellet de la célula THP-1 con los 12 μL de solución de RNP (paso 2.6).

3. Configuración del sistema de electroporación y nucleofección (Figura 1.3)

  1. Coloque la estación de pipetas debajo de una cabina de bioseguridad, coloque un tubo de electroporación en el soporte y agregue 3 mL de tampón E, incluido en el kit de electroporación.
  2. Después de encender el dispositivo de electroporación, utilice la pantalla táctil para configurar los siguientes parámetros de electroporación: Voltaje = 1 500 V, Duración = 10 ms, Número = 3.
  3. Equipar la pipeta de electroporación con una punta y aspirar 10 μL de la solución RNP/THP-1 (paso 2.7.4). Inserte la pipeta en el tubo de electroporación y pulse Start en la pantalla del dispositivo de electroporación. Espere a que aparezca el mensaje Completado y retire la pipeta del tubo.
  4. Transfiera las celdas a un pocillo de la placa precalentada de 24 pocillos y homogeneice suavemente. Vuelva a colocar la placa en la incubadora humidificada y déjela reposar sin ser molestada durante 72 h.
    NOTA: Tenga cuidado de no hacer burbujas al pipetear la suspensión RNP/THP-1, ya que interferirán con el procedimiento de electroporación. Si aparece un mensaje de error en ausencia de un arco eléctrico visible, retire la pipeta de electroporación del tubo y vuelva a pulsar Iniciar . Sin embargo, si se observa un arco eléctrico en forma de una breve chispa brillante, podría indicar la presencia de burbujas. Es probable que el procedimiento de electroporación falle, incluso en ausencia de un mensaje de error.

4. Recuperación de THP-1 72 h después de la electroporación (Figura 1.4)

  1. Cuente las células para evaluar la concentración (paso 2.7.1) 72 h después de la electroporación.
  2. Si hay suficientes células (es decir, ≥0,6 x 106 células/mL), diluirlas al menos un factor 2 con RPMI suplementado con 20% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y llevar la concentración entre 0,3-0,5 x 106 células por mL. De lo contrario, deje que la celda se recupere durante otras 72 horas.
  3. Pase y amplifique las celdas hasta que haya suficientes para la validación de KO. Mientras tanto, se puede iniciar el aislamiento de clones unicelulares (paso 7).

5. Validación de la edición génica mediante el ensayo de desajuste T7EI (Figura 1.5)

NOTA: El ensayo podría subestimar la eficiencia de edición dado que T7EI reconoce discrepancias mayores que 1 pb. Por lo tanto, el ensayo T7EI no es útil para el cribado de poblaciones de células homocigóticas (es decir, clones de células individuales) a menos que se modifique adecuadamente (paso 5.7).

  1. Evalúe la concentración de células (paso 2.7.1) y extraiga un volumen equivalente a 0,1 x 106 células en un tubo de 1,5 mL. Centrífuga (336 x g, 5 min, 20 °C), aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 μL de PBS. Centrifugar de nuevo y, con una pipeta, aspirar la mayor cantidad posible de sobrenadante sin alterar el pellet. Congele la muestra y guárdela a -20 °C.
  2. Extraer el ADN genómico para que sirva de matriz para la amplificación por PCR.
    1. Resuspender el pellet con 50 μL de solución de extracción de ADN, homogeneizar y transferir todo el volumen en un tubo de PCR de 0,2 mL. Vórtice y centrífuga brevemente (pulso durante 3 s).
    2. Coloque el tubo en un termociclador y caliéntelo a 65 °C durante 15 minutos, seguido de 98 °C durante 10 minutos.
    3. Diluir el ADN extraído con 90 μL de agua ultrapura. Vórtice y centrífuga brevemente (5.000 x g, 3 s).
  3. Diluya el cebador de PCR (consulte la tabla de materiales) en agua ultrapura hasta obtener una concentración final de 10 μM (es decir, 10 pmol/μL).
  4. Prepare la mezcla de PCR (siguiendo la NOTA a continuación) en un tubo de PCR de 0,2 mL (volumen final = 50 μL, para una condición). Por lo general, habrá al menos dos condiciones: el KO y el control sin editar solo con Cas9.
    NOTA: ADN genómico purificado: 10 μL; Cebador directo e inverso (10 μM): 2,5 μL cada uno, la concentración final de 500 nM; Tampón de reacción (5x): 10 μL. Vortex bien antes de añadir. Mezcla de dNTP (25 mM de cada uno): 0,6 μL, concentración final de 0,3 mM para cada dNTP. ADN polimerasa: 0,5 μL; Agua ultrapura: 23,9 μL. Vórtice y centrífuga brevemente (pulso durante 3 s).
  5. Coloque los tubos en el termociclador y ejecute el programa de PCR con los siguientes ajustes:
    NOTA: Un ciclo a 95 °C durante 5 min, seguido de 30 ciclos [98 °C durante 20 s (etapa de desnaturalización), X °C durante 15 s (etapa de recocido), 72 °C durante 45 s (etapa de elongación)], luego un ciclo final a 72 °C durante 2 min. Al final de la amplificación, retire los tubos, el vórtice y centrifugue brevemente (pulse durante 3 s). La temperatura de recocido (X) es la temperatura de fusión (Tm) de los cebadores menos 5 °C.
  6. Para una población policlonal editada: en un nuevo tubo de 0,2 mL, añadir 17,5 μL del amplicón de PCR y 2 μL de NEBuffer 2 (10x) para un volumen final de 19,5 μL. Vórtice y centrífuga brevemente (pulso durante 3 s). Alternativamente, para examinar clones de una sola célula, mezcle 1:1 de los productos de PCR de las células de control editadas y no editadas (paso 5.6) (Figura complementaria 1).
  7. Para la formación heterodúplex, coloque los tubos en el termociclador y ejecute el siguiente programa: un ciclo a 95 °C durante 10 min, uno con una rampa de -2 °C/s de 95 a 85 °C, uno con una rampa de -0,3 °C/s de 85 a 25 °C y un ciclo de enfriamiento final a 10 °C en HOLD.
  8. Después de la formación heterodúplex, agregue 0,5 μL de solución T7EI en el tubo. Incubar a 37 °C durante 30 min.
  9. Prepara un gel de agarosa al 1,2%:
    1. Pesar la agarosa en un frasco de vidrio y añadir el volumen adecuado de 1x tampón TAE (40 mM de Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 8,3). Colócalo en un microondas prestando atención a no enroscar la tapa firmemente. Calentar varias veces hasta que los cristales de agarosa se disuelvan por completo.
      NOTA: Si es necesario, mezcle la solución. No dejes que hierva, o el volumen disminuirá, cambiando la concentración de agarosa.
    2. Añadir la tinción de gel de ADN diluida a 1/20.000 y mezclar bien.
    3. Vierta la solución de agarosa en un molde, agregue un peine y deje que se solidifique a temperatura ambiente.
  10. Prepare las muestras para la electroforesis en gel mezclando 5 μL de los productos de digestión T7EI (paso 5.9) o el producto de PCR no digerido con 5 μL de agua y 2 μL de colorante de carga de ADN 6x. Cargue las muestras y la escala de tamaño y migre a 80 V durante 45 min (el tiempo se puede adaptar en función del tamaño esperado de los fragmentos de ADN). Una vez finalizada la migración, adquiera una imagen del gel con un sistema de imagen adecuado.

6. Validación de la edición génica mediante análisis de secuenciación de Sanger (Figura 1.6)

  1. Para caracterizar la modificación genética, purificar los productos de PCR (paso 5.4) y, después de la secuenciación de Sanger, analizar los resultados con la herramienta ICE (https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis).
  2. Controle si una proteína se puede producir a pesar de las modificaciones.
    1. Descargue los resultados de ICE y abra el archivo contribs.txt.
    2. Compare las secuencias editadas con la contraparte de WT. Mapea los indels y verifica que surgieron en la región genómica objetivo. Evalúe su tamaño. Si la longitud indel no es múltiplo de tres, se producirá un cambio de marco y posiblemente se introducirá un PTC. Se espera que el ARNm mutado sufra una degradación mediada por NMD.

7. Aislamiento de clones unicelulares mediante dilución limitada (Figura 1.7)

NOTA: El aislamiento de clones unicelulares no es obligatorio. Sin embargo, si se opta por hacerlo, es importante caracterizar múltiples clones y comparar su fenotipo con la población policlonal original.

  1. Tome una muestra de suspensión celular, dilúyala hasta la mitad con medio de cultivo y evalúe la concentración (paso 2.7.1). La dilución aumenta la precisión del recuento.
  2. Realice de 2 a 3 pasos de dilución en serie para alcanzar una concentración de 7 células/mL. Dispensar 100 μL de la suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (es decir, 0,7 celdas por pocillo). Deje que la célula decante durante unas horas antes de observar las placas en el microscopio para identificar los pocillos que contienen una célula.
  3. Monitoree regularmente la formación y el crecimiento de colonias y transfiera las células a una placa de cultivo o matraz más grande cuando sea necesario.

8. Caracterización funcional de células THP-1 KO SAMHD1 mediante ensayo de restricción de VIH-1

  1. Siembra THP-1 en una placa de cultivo de 24 pocillos con 0,25 x 106 células por pocillo en 300 μL de RPMI suplementada con 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina (RPMI completa) y que contiene 300 ng/mL de PMA para la diferenciación. Mantener la placa en una incubadora humidificada (37 °C, 5% CO2) durante 24 h.
  2. Sustituya el medio por un medio RPMI completo sin PMA y vuelva a colocar la placa en la incubadora durante otras 24 horas.
  3. Con una bomba de vacío, aspire todo el medio de cultivo. Añadir 250 μL de solución que contiene stock viral de VIH-1-GFP pseudotipado por VSVg (MOI = 0,5 IFU/célula). Incluya un control no infectado. Coloque la placa a 4 °C durante 2 h para sincronizar la infección.
  4. Lave las celdas una vez con RPMI. Agregue 500 μL de RPMI completo a cada pocillo e incube durante 48 h en condiciones estándar (el tiempo se puede ajustar).
  5. Después de retirar el medio de cultivo, lave las células una vez con 1x PBS frío. A continuación, añadir 100 μL de tripsina-EDTA al 0,05% en cada pocillo. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C hasta que las células se desprendan por completo (5 min deberían ser suficientes) antes de agregar 200 μL de RPMI completo para inactivar la enzima. Transfiera 250 μL de cada pocillo a una placa de fondo redondo de 96 pocillos (asegúrese de que el citómetro de flujo acepte placas de cultivo).
  6. Centrifugar la placa (757 x g, 3 min, deceleración = 6, 20 °C) y aspirar el sobrenadante con una pipeta multicanal. Vuelva a suspender el pellet con 100 μL de PFA al 4% e incube a 4 °C durante 10 min. Añadir 100 μL de PBS frío 1X.
  7. Analice la tasa de infección, representada por las células GFP positivas, mediante citometría de flujo (consulte la Figura complementaria 2 para obtener una estrategia de activación sugerida).

Resultados

Se generó una línea celular THP-1 que expresa de forma estable la proteína reportera GFP (THP-1_GFP) (Figura 2A) y se utilizó como herramienta para establecer un protocolo para una edición génica eficiente mediada por CRISPR-Cas9. Para ello, se diseñaron 3 sgRNA dirigidos al gen EGFP con la herramienta web CRISPOR29 (Figura 2B), que se complejaron simultáneamente con Cas9 en una proporci?...

Discusión

Aquí, se describe un protocolo para obtener una edición exitosa mediada por CRISPR de la línea celular THP-1. El enfoque se basa en la transferencia de RNPs sgRNA/Cas9 preensamblados por electroporación/nucleofección. Esta estrategia se eligió para limitar los efectos fuera del objetivo que potencialmente surgen de la integración mediada por lentivirales del casete sgRNA/Cas9, lo que produce una expresión persistente de la nucleasa. Se seleccionaron múltiples sgRNAs dirigidos al...

Divulgaciones

Todos los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a JP Concordet (MNHN, U1154/UMR7196, París), G. Bossis (IGMM, Montpellier) y D. Schlüter (Facultad de Medicina de Hannover, Alemania) por compartir los protocolos y por la discusión. Este proyecto ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención nº 101017572 a AZ) y ANRS (subvención ECTZ162721 a AZ). La infraestructura de investigación del Modelo de Enfermedades Infecciosas y Terapias Innovadoras (IDMIT) está respaldada por el "programme investissement d'avenir (PIA)" bajo el ANR_11_INSB_0008 de referencia.

Materiales

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0.2 µm syringe filterClearLine146560_
0.4 % trypan blueBeckman Coulter383200_
1.5 mL tubeEppendorf3810X_
24-well plateCorning353047_
6x TriTrack DNA Loading DyeThermo scientificR1161_
75 cm² Culture Flask Vented CapCorning353136_
8-Strip PCR Tubes with CapsLife technologiesAM12230_
96-well plates Flat bottomCorning353072_
96-well plates Round bottomCorning353077_
AgaroseEuromedexD5_
ATGpr__https://atgpr.dbcls.jp/
ChemiDoc Imaging SystemBIO-RAD12003153_
Counting slideNanoEntekDHC-N04_
CRISPOR__http://crispor.gi.ucsc.edu/
DPBSGibco14190094_
EnsemblEMBL-EBI_https://www.ensembl.org/index.html
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF7524_
FlowJoBD Life Sciencesv10.10_
GeneRuler 100 bp Plus DNA LadderThermo scientificSM0323_
Genome Data ViewerNCBI_https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/
GraphPad PrismDotmatics_Version 9.3.1
Herculase II Fusion DNA PolymerasesAgilent600679_
ICE CRISPR Analysis ToolSynthego_https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis
Image Lab TouchBIO-RAD_Version 2.4.0.03
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SIncluded with T7EI M0302S
Neon Kit, 10 µLInvitrogenMPK1025KElectroporation kit containing tips, tubes, buffer R and E
Neon Transfection SystemInvitrogenMPK5000_
NetStart 1.0__https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/
Nuclease-free WaterSynthego__
PCR primer (EGFP)Eurofins_Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT
PCR primer (SAMHD1)Eurofins_Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122_
PFAElectron Microscopy Sciences15714_
PMASigma-AldrichP8139_
PrimerQuestIDT_https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104_
QuickExtract DNA Extraction SolutionBiosearch TechnologiesQE09050_
RPMI 1640, GlutaMAXGibco61870010_
SnapGene ViewerDotmatics_Version 7
SpCas9 2NLS NucleaseSynthego__
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102_
Synthetic sgRNA (EGFP)Synthego_#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG
Synthetic sgRNA (SAMHD1)Synthego_#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU
Syringe Plastipak Luer LockBD301229_
T100 Thermal CyclerBIO-RAD1861096_
T7 endonuclease INew England BiolabsM0302S_
TAE buffer UltraPure, 10xInvitrogen15558026400 mM Tris-Acetate, 10 mM EDTA
THP-1 cellsATCCTIB-202_
Trypsin-EDTA (0,05 %)Gibco25300054_
ZE5 Cell AnalyzerBIO-RAD12014135_

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