Inactivation du gène CRISPR-Cas9 médiée par électroporation dans les cellules THP-1 et isolement de clones unicellulaires

Résumé

La lignée cellulaire THP-1 est largement utilisée comme modèle pour étudier les fonctions des monocytes/macrophages humains dans divers domaines de recherche liés à la biologie. Cet article décrit un protocole pour une ingénierie efficace basée sur CRISPR-Cas9 et l’isolement de clones unicellulaires, permettant la production de données phénotypiques robustes et reproductibles.

Résumé

La lignée cellulaire THP-1 de la leucémie monocytaire aiguë humaine (LMA) est largement utilisée comme modèle pour étudier les fonctions des macrophages dérivés des monocytes humains, y compris leur interaction avec des agents pathogènes humains importants tels que le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Par rapport à d’autres lignées cellulaires immortalisées d’origine myéloïde, les cellules THP-1 conservent de nombreuses voies de signalisation inflammatoires intactes et présentent des caractéristiques phénotypiques qui ressemblent davantage à celles des monocytes primaires, y compris la capacité de se différencier en macrophages lorsqu’elles sont traitées avec du phorbol-12-myristate 13-acétate (PMA). L’utilisation de la technologie CRISPR-Cas9 pour concevoir des cellules THP-1 par inactivation génique ciblée (KO) offre une approche puissante pour mieux caractériser les mécanismes immunitaires, y compris les interactions virus-hôte. Cet article décrit un protocole d’ingénierie efficace basé sur CRISPR-Cas9 utilisant l’électroporation pour délivrer des ribonucléoprotéines Cas9 :sgRNA pré-assemblées dans le noyau cellulaire. L’utilisation de plusieurs ARNsg ciblant le même locus à des positions légèrement différentes entraîne la délétion de grands fragments d’ADN, augmentant ainsi l’efficacité de l’édition, comme évalué par le test de l’endonucléase I T7. L’édition médiée par CRISPR-Cas9 au niveau génétique a été validée par le séquençage de Sanger suivi de l’analyse ICE (Inference of CRISPR Edits). La déplétion protéique a été confirmée par immunoblot couplé à un test fonctionnel. En utilisant ce protocole, jusqu’à 100 % d’indels dans le locus ciblé et une diminution de plus de 95 % de l’expression des protéines ont été obtenues. L’efficacité d’édition élevée permet d’isoler facilement les clones unicellulaires en limitant la dilution.

Introduction

THP-1 est une lignée cellulaire dérivée de monocytes humains isolée d’un patient souffrant de leucémie aiguë (LMA), qui présente des caractéristiques phénotypiques ressemblant étroitement à celles des monocytes primaires¹. Par rapport aux macrophages primaires dérivés de monocytes, qui ne se divisent pas et présentent à la fois une durée de vie limitée et une variabilité inter-/intra-donneur dans le phénotype, les cellules THP-1 peuvent être cultivées pratiquement indéfiniment et ont un comportement plus homogène qui favorise la reproductibilité des résultats 2,3,4,5,6 . Notamment, les cellules THP-1 peuvent être différenciées vers un phénotype de type macrophage avec le phorbol-12-myristate 13-acétate (PMA), ce qui en fait un modèle in vitro largement utilisé pour étudier les réponses des monocytes/macrophages aux signaux inflammatoires ^{7,8,9,10,11,12,13} ou à l’infection par des agents pathogènes humains cliniquement pertinents, y compris le VIH ^14,15,16. La possibilité de modifier génétiquement les cellules THP-1 présente un intérêt dans de nombreux domaines de recherche liés à la biologie.

La protéine associée à CRISPR 9 (CRISPR-Cas9) est un système immunitaire adaptatif procaryote qui s’appuie sur une nucléase guidée par l’ARN pour dégrader les génomes viraux envahisseurs, qui a été reprogrammé comme un outil de génie génétique¹⁷. Le processus d’édition du génome se déroule en trois étapes : la reconnaissance, le clivage et la réparation. Un ARN à guide unique (ARNsg) recrute la nucléase Cas9 dans un locus génomique spécifique par appariement de bases avec sa séquence guide de 20 pb. La présence d’une séquence PAM (Protospacer Adjacent Motif) directement 3' de la séquence cible génomique de 20 pb déclenche le déroulement et le clivage médiés par Cas9 sur les deux brins d’ADN entre les positions 17 et 18 (3-bp 5' du PAM). La rupture double brin (DSB) résultante est traitée par deux voies de réparation principales. En l’absence d’un modèle de réparation présentant une homologie avec le locus endommagé, la voie NHEJ (Non-Homologous End Joindre), sujette aux erreurs, introduira des insertions et/ou des délétions aléatoires de nucléotides (indels), conduisant potentiellement à des mutations de décalage de cadre et/ou à l’introduction de codons de terminaison prématurée (PTC). À leur tour, les ARNm contenant du PTC sont ciblés par la dégradation par la voie de désintégration de l’ARNm médiée par le non-sens (NMD), perturbant finalement l’expression/la fonction des protéines 18,19,20. Alternativement, le chemin HDR (Homology-Directed Repair) dépendant du modèle peut fonctionner et réparer fidèlement le DSB. Ce mécanisme a été exploité pour réaliser une édition génétique précise, y compris des knock-ins et des substitutions de bases. Il convient de noter que l’état du cycle cellulaire est un facteur important influençant le choix de la voie de réparation des CDB. En effet, NHEJ est actif à tous les stades du cycle cellulaire, tandis que le HDR est principalement limité aux phases S/G2²¹.

Les cellules THP-1 se développent en suspension et sont notoirement difficiles à transfecter avec l’ADN plasmidique, une procédure qui peut également modifier leur viabilité et/ou leur capacité de différenciation^22,23. La transduction avec des vecteurs lentiviraux basés sur le VIH-1 codant à la fois pour Cas9 et l’ARNsg est souvent utilisée pour inactiver (KO) un gène d’intérêt²⁴. L’intégration de la cassette Cas9/sgRNA dans le génome cellulaire garantit une expression prolongée et une KO efficace, mais constitue également une source persistante d’effets hors cible²⁵. Alternativement, les ribonucléoprotéines (RNP) Cas9 :sgRNA pré-assemblées sont délivrées par électroporation, une méthode impliquant la formation temporaire de pores dans les membranes plasmique et nucléaire lors de l’application d’impulsions électriques. La préservation de la viabilité cellulaire est un défi important lorsque l’on entreprend cette approche.

Ici, une lignée cellulaire THP-1 exprimant de manière stable la GFP (THP-1_GFP) a été produite pour servir d’outil à l’établissement d’un protocole permettant d’obtenir une édition efficace basée sur CRISPR-Cas9. Après avoir conçu une stratégie pour inactiver le gène EGFP à l’aide de trois ARNsg simultanément (approche multi-guides), l’efficacité de KO dans plusieurs conditions d’électroporation a été déterminée en utilisant l’expression de la GFP comme lecture. La prolifération cellulaire a été surveillée en parallèle. L’édition génomique a été confirmée à la fois par un test d’endonucléase I T7 (T7EI) et un séquençage de Sanger, suivis d’une analyse avec l’algorithme ICE (Inference of CRISPR Edits)²⁶. Des paramètres qui ont permis d’obtenir une diminution de l’expression de la GFP allant jusqu’à 95 %, les cellules THP-1 retrouvant des taux de croissance normaux après l’électroporation, ont été utilisés avec succès pour inactiver un gène endogène (SAMHD1) et produire des clones de THP-1 sur cellule unique.

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Conception du guide avec CRISPOR (Figure 1.1)

REMARQUE : Le logiciel SnapGene Viewer peut être utilisé aux étapes 4, 7 et 10 pour annoter le site cible d’édition et l’emplacement de l’hybridation de l’amorce PCR dans le gène d’intérêt.

1. Rendez-vous sur le site d’Ensembl (www.ensembl.org). Dans la zone de recherche , sélectionnez une espèce et entrez le nom du gène d’intérêt. Cliquez sur Go. Sélectionnez le résultat qui correspond au gène (pas un transcrit).
2. Cliquez sur Afficher le tableau des transcriptions , puis sélectionnez l’ID de transcription qui correspond au codage des protéines étiqueté en or dans la colonne Biotype . Une fois sur la page de transcription, cliquez sur Exons dans le menu de gauche.
3. Faites défiler vers le bas et cliquez sur Télécharger la séquence. Assurez-vous que le format de fichier est FASTA. Dans Paramètres - Séquences incluses, désélectionnez tout sauf Séquence génomique.
   Entrez le nombre « 500 » dans la séquence latérale à l’une ou l’autre des extrémités de la boîte de transcription . Cliquez sur Aperçu, sélectionnez la séquence entière (uniquement les nucléotides sans l’en-tête) et copiez-la (Ctrl+C).
4. Ouvrez SnapGene Viewer et cliquez sur Nouveau fichier > ADN. Collez la séquence (Ctrl+V) dans la zone Créer une séquence . Décochez la case Détecter les fonctionnalités communes et sélectionnez Linéaire dans la topologie.
   Renommez le fichier et cliquez sur Créer. Dans le menu de gauche, désélectionnez Afficher les enzymes (première icône). En bas de la fenêtre, sélectionnez l’onglet Séquence .
   REMARQUE : Cette étape permet de récupérer la séquence complète du gène, y compris les exons, les introns et les séquences flanquantes de 500 pb (facultatif). Cette dernière information est utile pour concevoir des amorces PCR pour l’amplification d’un site cible situé dans le premier exon.
5. De retour sur le site Web d’Ensembl, faites défiler vers le haut jusqu’à l’aperçu du fichier et cliquez sur Retour. Maintenant, changez le format de fichier en RTF. Dans Paramètres - Séquences incluses, désélectionnez tout sauf Exons. Dans Afficher les variantes, sélectionnez Non. Cliquez sur Télécharger en haut de la page.
6. Ouvrez le fichier téléchargé (avec Word), qui contient la séquence des exons et affiche la séquence de codage en bleu, en commençant par l’ATG initial. Choisissez l’exon à cibler par l’édition dirigée par CRISPR-Cas9 (voir ci-dessous pour les recommandations), sélectionnez-le et copiez-le (Ctrl+C).
   1. L’exon ciblé est soit un exon précoce, soit un exon codant pour un domaine fonctionnellement important de la protéine. Il convient de noter que l’établissement d’une PTC dans un exon tardif proche de l’UTR 3' ne provoquera probablement pas de NMD, conduisant à l’expression d’une protéine tronquée C-terminale. À l’inverse, l’introduction d’un PTC dans un exon précoce proximal au site d’initiation natif est associée à un risque de traduction illégitime (ITL, alias initiation de traduction alternative (ATI)), produisant l’expression inattendue d’une protéine tronquée N-terminale qui commence à un site d’initiation de traduction (TIS) en aval du premier codon ATG. Pour atténuer ce dernier risque, il est conseillé d’évaluer l’occurrence d’autres TIS à l’aide d’ATGpr²⁷ (atgpr.dbcls.jp) et/ou de NetStart 1.0²⁸ (services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/).
   2. Assurez-vous que l’exon cible contient une séquence codante. Cependant, il peut s’avérer utile de choisir un recuit d’ARNsg avec la région 5'UTR en amont de l’ATG initial pour l’inclure dans le fragment supprimé.
   3. Idéalement, l’exon ciblé devrait être commun à toutes les variantes de transcription codant pour les protéines du gène. Vérifiez si c’est le cas sur le Genome Data Viewer (www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/) du NCBI en recherchant le gène d’intérêt.
      En cliquant sur le nom du gène (en vert) dans la fenêtre d’affichage, les variantes de transcription (en violet) s’afficheront. Les exons sont représentés par un rectangle.
7. Dans SnapGene Viewer, appuyez sur Ctrl+F, Ctrl+V, puis sur Entrée pour rechercher la séquence de l’exon. Appuyez sur Ctrl+T pour ajouter une nouvelle fonctionnalité, nommez-la, changez le type en « exon » et cliquez sur OK.
8. Allez sur le site Web de CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/) et collez la séquence d’exons à l’étape 1. Tout d’abord, sélectionnez un génome de référence à l’étape 2 , puis le type de PAM à cibler à l’étape 3, généralement 20bp-NGG pour SpCas9. Cliquez sur SOUMETTRE.
9. Sélectionnez deux ARNsg de manière à ce qu’ils soient séparés jusqu’à 150 pb, puis sélectionnez un troisième ARNsg entre les deux. Voici quelques directives pour la sélection de l’ARNsg :
   1. Le score de spécificité du MIT est lié aux effets hors cible. Un score plus élevé indique qu’il y a moins de hors-cibles potentiels. La colonne de droite affiche trois sites hors cible prédits, classés du plus probable au moins probable, ainsi que leur emplacement (dans un exon, un intron ou une région intergénique). La liste complète des sites hors cible prévus est accessible en cliquant sur Afficher tout. Si possible, sélectionnez des ARNsg avec un score MIT >80, en donnant la priorité à ceux qui n’ont pas de cibles externes pour 0, 1 ou 2 mésappariements. De plus, les ARNsg avec des cibles secondaires dans un exon, qui ont le plus grand potentiel d’affecter le phénotype, doivent être évités.
   2. Pour l’efficacité prévue, reportez-vous au score Doench '16. Notez qu’un score élevé de Doench '16 indique simplement que l’ARNsg est plus susceptible d’être efficace. L’efficacité réelle doit être déterminée expérimentalement. Pour cette raison, il est toujours utile de sélectionner plusieurs ARNsg, même s’ils ne sont pas destinés à être utilisés ensemble.
   3. Une teneur en GC trop élevée ou trop faible, ainsi que certains motifs, peuvent nuire à l’efficacité de l’ARNsg et doivent être évités. Ces paramètres sont mis en évidence par CRISPOR.
10. Répétez l’étape 1.7 pour ajouter la séquence d’ARNsg et la séquence PAM associée à la séquence de gène dans SnapGene Viewer. En même temps, collez la séquence d’ARNsg (sans le PAM) dans un fichier texte ou Excel pour conserver l’orientation 5'-3' requise lors de la commande de l’oligonucléotide.
11. Pour l’amplification du site cible par PCR, concevez quelques amorces autour de celui-ci. La taille de l’amplicon doit être comprise entre 800 et 1000 pb. PrimerQuest a été utilisé pour concevoir les amorces de ce protocole (https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest). Alternativement, CRISPOR fournit une liste d’amorces pour amplifier la région génomique ciblée ainsi que les sites hors cible. Après avoir affiché la liste complète des sites hors cible potentiels (étape 1.9.1), cliquez sur Amorces hors cible dans le coin inférieur droit.

2. Préparation du réactif et de la cellule pour l’électroporation (Figure 1.2)

1. Préparez une plaque de culture à 24 puits pour récupérer les cellules après électroporation en remplissant les puits avec 500 μL de milieu RPMI 1640 complété par 20 % de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé à la chaleur (56 °C, 30 min), filtré (0,20 μm). N’ajoutez pas d’antibiotiques. Maintenir la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h jusqu’à l’électroporation.
2. Si les ARNsg sont expédiés secs, réhydratez-les avec un tampon TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) jusqu’à une concentration finale de 100 μM (c’est-à-dire 10 μL de tampon TE pour 1 nmol d’ARNsg). Agiter pendant 30 s, incuber à 4 °C pendant la nuit pour permettre une réhydratation complète et, après une brève homogénéisation à la pipette, conserver la solution mère d’ARNsg à -20 °C. Selon le volume final, faites des aliquotes pour éviter plusieurs cycles de gel-dégel.
3. Préparez une solution fonctionnelle d’ARNsg à une concentration finale de 30 μM en diluant la solution mère de 100 μM dans de l’eau exempte de nucléases. Agiter pendant 30 s et incuber 5 min à température ambiante.
4. Assemblez les RNP Cas9 :sgRNA à un rapport molaire de 1:9 en diluant simultanément 1 μL de chacun des trois sgRNA de 30 μM et 0,5 μL de solutions Cas9 de 20 μM dans 3,5 μL de tampon de résuspension R, inclus dans le kit d’électroporation (volume final de 7 μL, pour une condition expérimentale ; mise à l’échelle en conséquence). Agitez brièvement et laissez incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
5. Entre-temps, préparez un contrôle non édité en ajoutant 0,5 μL de 20 μM de Cas9 à 6,5 μL de tampon de remise en suspension R. Vortex brièvement et incubez pendant 5 min à température ambiante.
6. Ajouter 5 μL de tampon de remise en suspension R à tous les échantillons pour un volume final de 12 μL par condition d’électroporation.
7. Préparez les cellules THP-1 pour l’électroporation.
   1. Évaluer la concentration et la viabilité par le test d’exclusion au bleu de trypan. Diluez les cellules 1:2 dans une solution de coloration au bleu de trypan à 0,4 %. Après 30 s d’incubation, bien homogénéiser et ajouter 10 μL dans une paroi d’une chambre de comptage avec un style de grille amélioré par Neubauer. Comptez trois grands carrés et divisez le nombre par 100 pour obtenir la concentration cellulaire (x10,⁶ cellules/ml).
      REMARQUE : La santé des cellules influence leur sensibilité à l’électroporation. Des précautions doivent être prises pour réaliser la culture cellulaire dans des conditions optimales. Le temps passé à l’extérieur de l’incubateur doit être limité, et tous les réactifs et solutions doivent être préparés et réchauffés à l’avance.
   2. Pour chaque condition, prélever un volume équivalent à 0,2 x 10⁶ cellules et centrifuger (336 x g, 5 min, 20 °C).
   3. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre la pastille en suspension dans 500 μL de PBS. Centrifuger à nouveau (336 x g, 5 min, 20 °C).
   4. Aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette et mettez en suspension la pastille de cellule THP-1 avec les 12 μL de solution RNP (étape 2.6).

3. Configuration du système d’électroporation et nucléofection (Figure 1.3)

1. Placez la station de pipette sous une armoire de biosécurité, placez un tube d’électroporation dans le support et ajoutez 3 ml de tampon E, inclus dans le kit d’électroporation.
2. Après avoir allumé l’appareil d’électroporation, utilisez l’écran tactile pour régler les paramètres d’électroporation suivants : Tension = 1 500 V, Durée = 10 ms, Nombre = 3.
3. Équiper la pipette d’électroporation d’une pointe et aspirer 10 μL de la solution RNP/THP-1 (étape 2.7.4). Insérez la pipette dans le tube d’électroporation et appuyez sur Start sur l’écran de l’appareil d’électroporation. Attendez que le message Terminé s’affiche et retirez la pipette du tube.
4. Transférez les cellules dans un puits de la plaque préchauffée à 24 puits et homogénéisez doucement. Remettez la plaque dans l’incubateur humidifié et laissez-les reposer sans être dérangés pendant 72 h.
   REMARQUE : Veillez à ne pas faire de bulles lors du pipetage de la suspension RNP/THP-1, car elles interféreraient avec la procédure d’électroporation. Si un message d’erreur s’affiche en l’absence d’un arc électrique visible, retirez la pipette d’électroporation du tube et appuyez à nouveau sur Démarrer . Cependant, si un arc électrique sous la forme d’une brève étincelle brillante est observé, cela pourrait indiquer la présence de bulles. La procédure d’électroporation échouera probablement, même en l’absence d’un message d’erreur.

4. Récupération du THP-1 72 h après l’électroporation (Figure 1.4)

1. Compter les cellules pour évaluer la concentration (étape 2.7.1) 72 h après l’électroporation.
2. S’il y a suffisamment de cellules (c.-à-d. ≥0,6 x 10⁶ cellules/mL), diluez-les au moins un facteur 2 avec du RPMI complété par 20 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine et portez la concentration entre 0,3 et 0,5 x 10⁶ cellules par mL. Sinon, laissez la cellule récupérer pendant 72 heures supplémentaires.
3. Passez et amplifiez les cellules jusqu’à ce qu’il y en ait assez pour la validation KO. Entre-temps, l’isolement de clones unicellulaires peut être initié (étape 7).

5. Validation de l’édition génomique par test de mésappariement T7EI (Figure 1.5)

REMARQUE : Le test peut sous-estimer l’efficacité de l’édition étant donné que T7EI reconnaît les discordances supérieures à 1 pb. Par conséquent, le test T7EI n’est pas utile pour le criblage de populations de cellules homozygotes (c.-à-d. des clones unicellulaires), à moins qu’il ne soit modifié de manière appropriée (étape 5.7).

1. Évaluer la concentration cellulaire (étape 2.7.1) et prélever un volume équivalent à 0,1 x 10⁶ cellules dans un tube de 1,5 mL. Centrifuger (336 x g, 5 min, 20 °C), aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 μL de PBS. Centrifugez à nouveau et, à l’aide d’une pipette, aspirez autant de surnageant que possible sans perturber la pastille. Congelez l’échantillon et conservez-le à -20 °C.
2. Extraire l’ADN génomique pour servir de matrice pour l’amplification par PCR.
   1. Remettez la pastille en suspension avec 50 μL de solution d’extraction d’ADN, homogénéisez et transférez tout le volume dans un tube PCR de 0,2 mL. Vortex et centrifugeuse brièvement (impulsion pendant 3 s).
   2. Placez le tube dans un thermocycleur et chauffez-le à 65 °C pendant 15 min, puis à 98 °C pendant 10 min.
   3. Diluez l’ADN extrait avec 90 μL d’eau ultrapure. Vortex et centrifugeuse brièvement (5 000 x g, 3 s).
3. Diluer l’amorce de PCR (voir le tableau des matériaux) dans de l’eau ultrapure pour une concentration finale de 10 μM (c’est-à-dire 10 pmol/μL).
4. Préparez le mélange PCR (en suivant la REMARQUE ci-dessous) dans un tube PCR de 0,2 mL (volume final = 50 μL, pour une condition). Habituellement, il y aura au moins deux conditions : le KO et le contrôle non édité avec Cas9 uniquement.
   REMARQUE : ADN génomique purifié : 10 μL ; Amorce directe et inverse (10 μM) : 2,5 μL chacune, la concentration finale étant de 500 nM ; Tampon de réaction (5x) : 10 μL. Bien vortex avant d’ajouter. Mélanger le dNTP (25 mM de chaque) : 0,6 μL, concentration finale de 0,3 mM pour chaque dNTP. ADN polymérase : 0,5 μL ; Eau ultrapure : 23,9 μL. Vortex et centrifugeuse brièvement (impulsion pendant 3 s).
5. Placez les tubes dans le thermocycleur et exécutez le programme PCR avec les paramètres suivants :
   REMARQUE : Un cycle à 95 °C pendant 5 min, suivi de 30 cycles [98 °C pendant 20 s (étape de dénaturation), X °C pendant 15 s (étape de recuit), 72 °C pendant 45 s (étape d’allongement)], puis un dernier cycle à 72 °C pendant 2 min. À la fin de l’amplification, retirez brièvement les tubes, le vortex et la centrifugeuse (impulsion pendant 3 s). La température de recuit (X) est la température de fusion (Tm) des amorces moins 5 °C.
6. Pour une population polyclonale modifiée : dans un nouveau tube de 0,2 mL, ajouter 17,5 μL de l’amplicon PCR et 2 μL de NEBuffer 2 (10x) pour un volume final de 19,5 μL. Vortex et centrifugeuse brièvement (impulsion pendant 3 s). Alternativement, pour cribler des clones unicellulaires, mélanger 1:1 des produits PCR à partir des cellules de contrôle modifiées et non modifiées (étape 5.6) (figure supplémentaire 1).
7. Pour la formation hétéroduplex, placez les tubes dans le thermocycleur et exécutez le programme suivant : un cycle à 95 °C pendant 10 min, un avec une rampe de -2 °C/s de 95 à 85 °C, un avec une rampe de -0,3 °C/s de 85 à 25 °C et un dernier cycle de refroidissement à 10 °C en HOLD.
8. Après la formation de l’hétéroduplex, ajoutez 0,5 μL de solution T7EI dans le tube. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
9. Préparez un gel d’agarose à 1,2 % :
   1. Pesez l’agarose dans une bouteille en verre et ajoutez le volume approprié de 1 tampon TAE (40 mM de tris-acétate, 1 mM d’EDTA, pH 8,3). Placez-le au micro-ondes en faisant attention à ne pas visser fermement le bouchon. Chauffer plusieurs fois jusqu’à ce que les cristaux d’agarose soient complètement dissous.
      REMARQUE : Si nécessaire, mélangez la solution. Ne le laissez pas bouillir, sinon le volume diminuera, modifiant la concentration d’agarose.
   2. Ajouter la coloration gel ADN diluée à 1/20 000 et bien mélanger.
   3. Versez la solution d’agarose dans un moule, ajoutez un peigne et laissez se solidifier à température ambiante.
10. Préparez les échantillons pour l’électrophorèse sur gel en mélangeant 5 μL des produits de digestion T7EI (étape 5.9) ou le produit PCR non digéré avec 5 μL d’eau et 2 μL de colorant de charge d’ADN 6x. Chargez les échantillons et dimensionnez l’échelle et migrez à 80 V pendant 45 min (le temps peut être adapté en fonction de la taille attendue des fragments d’ADN). Une fois la migration terminée, acquérez une image du gel avec un système d’imagerie approprié.

6. Validation de l’édition génomique par analyse de séquençage de Sanger (Figure 1.6)

1. Pour caractériser la modification génétique, purifier les produits de PCR (étape 5.4) et, après séquençage de Sanger, analyser les résultats avec l’outil ICE (https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis).
2. Contrôler si une protéine peut être produite malgré les modifications.
   1. Téléchargez les résultats de l’ICE et ouvrez le fichier contribs.txt.
   2. Comparez les séquences éditées avec l’homologue WT. Cartographiez les indels et vérifiez qu’ils sont apparus dans la région génomique ciblée. Évaluez leur taille. Si la longueur indel n’est pas un multiple de trois, un décalage d’image se produira et un PTC sera éventuellement introduit. L’ARNm muté subira probablement une dégradation médiée par NMD.

7. Isolement d’un clone unicellulaire par dilution limitée (Figure 1.7)

REMARQUE : L’isolement des clones unicellulaires n’est pas obligatoire. Cependant, si vous choisissez de le faire, il est important de caractériser plusieurs clones et de comparer leur phénotype avec la population polyclonale d’origine.

1. Prélever un échantillon de suspension cellulaire, le diluer 1/2 avec un milieu de culture et évaluer la concentration (étape 2.7.1). La dilution augmente la précision du comptage.
2. Effectuer 2 à 3 étapes de dilution en série pour atteindre une concentration de 7 cellules/mL. Distribuer 100 μL de suspension cellulaire par puits dans une plaque à fond rond de 96 puits (c.-à-d. 0,7 cellule par puits). Laissez la cellule décanter pendant quelques heures avant d’observer les plaques au microscope pour identifier les puits contenant une cellule.
3. Surveillez régulièrement la formation et la croissance des colonies et transférez les cellules dans une plaque ou un flacon de culture plus grand au besoin.

8. Caractérisation fonctionnelle des cellules THP-1 KO SAMHD1 par test de restriction du VIH-1

1. Semez le THP-1 dans une plaque de culture à 24 puits avec 0,25 x 10⁶ cellules par puits dans 300 μL de RPMI complété par 10 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine (RPMI complet) et contenant 300 ng/mL de PMA pour la différenciation. Conservez la plaque dans un incubateur humidifié (37 °C, 5 % CO₂) pendant 24 h.
2. Remplacez le milieu par un milieu RPMI complet exempt de PMA et remettez la plaque dans l’incubateur pendant encore 24 heures.
3. À l’aide d’une pompe à vide, aspirez tout le milieu de culture. Ajouter 250 μL de solution virale contenant du VIH-1-GFP pseudotypé VSVg (MOI = 0,5 IFU/cellule). Incluez un témoin non infecté. Placez la plaque à 4 °C pendant 2 h pour synchroniser l’infection.
4. Lavez les cellules une fois avec du RPMI. Ajouter 500 μL de RPMI complet dans chaque puits et incuber pendant 48 h dans des conditions standard (le temps peut être ajusté).
5. Après avoir retiré le milieu de culture, lavez une fois les cellules avec du PBS froid. Ensuite, ajoutez 100 μL de trypsine-EDTA à 0,05 % dans chaque puits. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C jusqu’à ce que les cellules soient complètement détachées (5 min devraient suffire) avant d’ajouter 200 μL de RPMI complet pour inactiver l’enzyme. Transvaser 250 μL de chaque puits dans une plaque à fond rond de 96 puits (s’assurer que le cytomètre en flux accepte les plaques de culture).
6. Centrifuger la plaque (757 x g, 3 min, décélération = 6, 20 °C) et aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette multicanaux. Remettre la pastille en suspension avec 100 μL de PFA à 4 % et incuber à 4 °C pendant 10 min. Ajouter 100 μL de PBS froid.
7. Analyser le taux d’infection, représenté par les cellules GFP positives, par cytométrie en flux (voir la figure supplémentaire 2 pour une stratégie de contrôle suggérée).

Résultats

Une lignée cellulaire THP-1 a été générée exprimant de manière stable la protéine rapporteure GFP (THP-1_GFP) (Figure 2A) et utilisée comme outil pour établir un protocole pour une édition efficace du gène médiée par CRISPR-Cas9. Dans ce but, 3 sgRNA ciblant le gène EGFP ont été conçus avec l’outil web^{CRISPOR 29} (Figure 2B), qui ont été simultanément complexés avec Cas9 à...

Discussion

Ici, un protocole est décrit pour obtenir une édition réussie de la lignée cellulaire THP-1 médiée par CRISPR. L’approche repose sur le transfert de sgRNA/Cas9 RNP pré-assemblés par électroporation/nucléofection. Cette stratégie a été choisie pour limiter les effets hors cible qui peuvent survenir lors de l’intégration lentivirale de la cassette sgRNA/Cas9, produisant une expression persistante de la nucléase. Plusieurs ARNsg ciblant le gène d’intérêt ont été s?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm syringe filter	ClearLine	146560	_
0.4 % trypan blue	Beckman Coulter	383200	_
1.5 mL tube	Eppendorf	3810X	_
24-well plate	Corning	353047	_
6x TriTrack DNA Loading Dye	Thermo scientific	R1161	_
75 cm² Culture Flask Vented Cap	Corning	353136	_
8-Strip PCR Tubes with Caps	Life technologies	AM12230	_
96-well plates Flat bottom	Corning	353072	_
96-well plates Round bottom	Corning	353077	_
Agarose	Euromedex	D5	_
ATGpr	_	_	https://atgpr.dbcls.jp/
ChemiDoc Imaging System	BIO-RAD	12003153	_
Counting slide	NanoEntek	DHC-N04	_
CRISPOR	_	_	http://crispor.gi.ucsc.edu/
DPBS	Gibco	14190094	_
Ensembl	EMBL-EBI	_	https://www.ensembl.org/index.html
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524	_
FlowJo	BD Life Sciences	v10.10	_
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo scientific	SM0323	_
Genome Data Viewer	NCBI	_	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/
GraphPad Prism	Dotmatics	_	Version 9.3.1
Herculase II Fusion DNA Polymerases	Agilent	600679	_
ICE CRISPR Analysis Tool	Synthego	_	https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis
Image Lab Touch	BIO-RAD	_	Version 2.4.0.03
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with T7EI M0302S
Neon Kit, 10 µL	Invitrogen	MPK1025K	Electroporation kit containing tips, tubes, buffer R and E
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	_
NetStart 1.0	_	_	https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/
Nuclease-free Water	Synthego	_	_
PCR primer (EGFP)	Eurofins	_	Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT
PCR primer (SAMHD1)	Eurofins	_	Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	_
PFA	Electron Microscopy Sciences	15714	_
PMA	Sigma-Aldrich	P8139	_
PrimerQuest	IDT	_	https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	_
QuickExtract DNA Extraction Solution	Biosearch Technologies	QE09050	_
RPMI 1640, GlutaMAX	Gibco	61870010	_
SnapGene Viewer	Dotmatics	_	Version 7
SpCas9 2NLS Nuclease	Synthego	_	_
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102	_
Synthetic sgRNA (EGFP)	Synthego	_	#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG
Synthetic sgRNA (SAMHD1)	Synthego	_	#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU
Syringe Plastipak Luer Lock	BD	301229	_
T100 Thermal Cycler	BIO-RAD	1861096	_
T7 endonuclease I	New England Biolabs	M0302S	_
TAE buffer UltraPure, 10x	Invitrogen	15558026	400 mM Tris-Acetate, 10 mM EDTA
THP-1 cells	ATCC	TIB-202	_
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Gibco	25300054	_
ZE5 Cell Analyzer	BIO-RAD	12014135	_