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Resumo

A linhagem celular THP-1 é amplamente utilizada como modelo para investigar as funções de monócitos/macrófagos humanos em várias áreas de pesquisa relacionadas à biologia. Este artigo descreve um protocolo para engenharia eficiente baseada em CRISPR-Cas9 e isolamento de clone de célula única, permitindo a produção de dados fenotípicos robustos e reprodutíveis.

Resumo

A linhagem celular THP-1 de leucemia monocítica aguda humana (LMA) é amplamente utilizada como modelo para estudar as funções de macrófagos derivados de monócitos humanos, incluindo sua interação com patógenos humanos significativos, como o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Em comparação com outras linhagens celulares imortalizadas de origem mieloide, as células THP-1 retêm muitas vias de sinalização inflamatória intactas e exibem características fenotípicas que se assemelham mais às dos monócitos primários, incluindo a capacidade de se diferenciar em macrófagos quando tratadas com forbol-12-miristato 13-acetato (PMA). O uso da tecnologia CRISPR-Cas9 para projetar células THP-1 por meio de nocaute genético direcionado (KO) fornece uma abordagem poderosa para caracterizar melhor os mecanismos relacionados ao sistema imunológico, incluindo interações vírus-hospedeiro. Este artigo descreve um protocolo para engenharia eficiente baseada em CRISPR-Cas9 usando eletroporação para fornecer ribonucleoproteínas Cas9:sgRNA pré-montadas no núcleo da célula. O uso de vários sgRNAs direcionados ao mesmo locus em posições ligeiramente diferentes resulta na deleção de grandes fragmentos de DNA, aumentando assim a eficiência da edição, conforme avaliado pelo ensaio de endonuclease I T7. A edição mediada por CRISPR-Cas9 no nível genético foi validada por sequenciamento de Sanger seguido de análise de inferência de edições CRISPR (ICE). A depleção de proteínas foi confirmada por immunoblotting acoplado a um ensaio funcional. Usando este protocolo, foram alcançados até 100% de indels no locus alvo e uma diminuição de mais de 95% na expressão da proteína. A alta eficiência de edição torna conveniente isolar clones de célula única, limitando a diluição.

Introdução

O THP-1 é uma linhagem celular derivada de monócitos humanos isolada de um paciente que sofre de leucemia aguda (LMA), que apresenta características fenotípicas muito semelhantes às dos monócitos primários1. Em comparação com os macrófagos primários derivados de monócitos, que não se dividem e exibem vida útil limitada e variabilidade inter/intradoador no fenótipo, as células THP-1 podem ser cultivadas virtualmente para sempre e ter um comportamento mais homogêneo que favorece a reprodutibilidade dos resultados 2,3,4,5,6 . Notavelmente, as células THP-1 podem ser diferenciadas em direção a um fenótipo semelhante a macrófagos com forbol-12-miristato 13-acetato (PMA), tornando-as um modelo in vitro amplamente utilizado para investigar as respostas de monócitos / macrófagos a sinais inflamatórios 7,8,9,10,11,12,13 ou infecção por patógenos humanos clinicamente relevantes, incluindo HIV 14,15,16. A possibilidade de projetar geneticamente células THP-1 é de interesse em muitas áreas de pesquisa relacionadas à biologia.

A proteína 9 associada a CRISPR (CRISPR-Cas9) é um sistema imunológico adaptativo procariótico que retransmite nuclease guiada por RNA para degradar genomas virais invasores, que foi reprogramado como uma ferramenta de engenharia genética17. O processo de edição do genoma prossegue em três etapas: reconhecimento, clivagem e reparo. Um RNA de guia único (sgRNA) recruta a nuclease Cas9 para um locus genômico específico por meio do emparelhamento de bases com sua sequência guia de 20 pb. A presença de uma sequência de Motivo Adjacente ao Protoespaçador (PAM) diretamente 3 'da sequência alvo genômica de 20 pb desencadeia o desenrolamento e a clivagem mediados por Cas9 em ambas as fitas de DNA entre as posições 17 e 18 (3 pb 5' do PAM). A quebra de fita dupla (DSB) resultante é processada por duas vias principais de reparo. Na ausência de um modelo de reparo com homologia com o locus danificado, a via de junção final não homóloga (NHEJ) propensa a erros introduzirá inserções e/ou deleções aleatórias de nucleotídeos (indels), potencialmente levando a mutações frameshift e/ou a introdução de códons de terminação prematura (PTC). Por sua vez, os mRNAs contendo PTC são alvo de degradação pela via de decaimento de mRNA mediada por nonsense (NMD), interrompendo a expressão / função da proteína18 , 19 , 20 . Alternativamente, a via de reparo dirigido por homologia (HDR) dependente do modelo pode operar e reparar fielmente o DSB. Esse mecanismo foi aproveitado para obter uma edição precisa de genes, incluindo knock-ins e substituições de bases. Vale ressaltar que o status do ciclo celular é um fator importante que influencia a escolha da via de reparo do DSB. De fato, o NHEJ é ativo em todos os estágios do ciclo celular, enquanto o HDR é restrito principalmente às fases S / G221.

As células THP-1 crescem em suspensão e são notoriamente difíceis de transfectar com DNA plasmidial, procedimento que possivelmente também altera sua viabilidade e/ou capacidade de diferenciação22,23. A transdução com vetores lentivirais baseados em HIV-1 que codificam Cas9 e o sgRNA é frequentemente empregada para nocautear (KO) um gene de interesse24. A integração do Cas9 / sgRNA no genoma celular garante expressão prolongada e KO eficiente, mas também é uma fonte persistente de efeitos fora do alvo25. Alternativamente, as ribonucleoproteínas Cas9:sgRNA (RNPs) pré-montadas são entregues por eletroporação, um método que envolve a formação temporária de poros nas membranas plasmática e nuclear após a aplicação de impulsos elétricos. Preservar a viabilidade celular é um desafio importante ao empreender essa abordagem.

Aqui, uma linhagem celular THP-1 expressando GFP (THP-1_GFP) de forma estável foi produzida para servir como uma ferramenta para estabelecer um protocolo para obter uma edição eficiente baseada em CRISPR-Cas9. Depois de projetar uma estratégia para inativar o gene EGFP usando três sgRNAs simultaneamente (abordagem multiguia), a eficiência do KO entre várias condições de eletroporação foi determinada usando a expressão de GFP como leitura. A proliferação celular foi monitorada em paralelo. A edição gênica foi confirmada por um ensaio de endonuclease T7 I (T7EI) e sequenciamento de Sanger, seguido de análise com o algoritmo Inference of CRISPR Edits (ICE)26. Parâmetros que produziram até 95% de redução na expressão de GFP, com células THP-1 recuperando taxas de crescimento normais após eletroporação, foram empregados com sucesso para inativar um gene endógeno (SAMHD1) e produzir clones de THP-1 de célula única.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Desenho do guia com CRISPOR (Figura 1.1)

NOTA: O software SnapGene Viewer pode ser usado nas etapas 4, 7 e 10 para anotar o local de destino de edição e a localização da hibridização do primer de PCR dentro do gene de interesse.

  1. Acesse o site da Ensembl (www.ensembl.org). Na caixa Pesquisar , selecione uma espécie e digite o nome do gene de interesse. Clique em Ir. Selecione o resultado que corresponde ao gene (não um transcrito).
  2. Clique em Mostrar tabela de transcrição e selecione o ID de transcrição que corresponde ao código de proteína rotulado em ouro na coluna Biotipo . Uma vez na página de transcrição, clique em Exons no menu à esquerda.
  3. Role para baixo e clique em Baixar sequência. Certifique-se de que o formato do arquivo seja FASTA. Em Configurações - Sequências incluídas, desmarque tudo, exceto Sequência genômica.
    Digite o número "500" em Sequência de flanqueamento em cada extremidade da caixa de transcrição . Clique em Visualizar, selecione toda a sequência (apenas os nucleotídeos sem o cabeçalho) e copie-a (Ctrl+C).
  4. Abra o SnapGene Viewer e clique em Novo > arquivo de DNA. Cole a sequência (Ctrl+V) na caixa Criar uma sequência . Desmarque Detectar recursos comuns e selecione Linear na topologia.
    Renomeie o arquivo e clique em Criar. No menu à esquerda, desmarque Mostrar enzimas (primeiro ícone). Na parte inferior da janela, selecione a guia Sequência .
    NOTA: Esta etapa permite a recuperação da sequência completa do gene, incluindo éxons, íntrons e sequências flanqueadoras de 500 pb (opcional). Esta última informação é útil para projetar primers de PCR para a amplificação de um local alvo localizado dentro do primeiro éxon.
  5. De volta ao site do Ensembl, role para cima na visualização do arquivo e clique em Voltar. Agora, altere o formato do arquivo para RTF. Em Configurações - Sequências incluídas, desmarque tudo, exceto Exons. Em Mostrar variantes, selecione Não. Clique em Download na parte superior da página.
  6. Abra o arquivo baixado (com o Word), que contém a sequência de éxons e mostra a sequência de codificação em azul, começando com o ATG inicial. Escolha o éxon a ser direcionado pela edição direcionada ao CRISPR-Cas9 (veja abaixo as recomendações), selecione-o e copie-o (Ctrl+C).
    1. O éxon alvo é um éxon inicial ou um éxon que codifica um domínio funcionalmente importante da proteína. Vale a pena notar que o estabelecimento de um PTC em um éxon tardio próximo ao 3 'UTR provavelmente não conseguirá eliciar NMD, levando à expressão de uma proteína truncada C-terminalmente. Por outro lado, a introdução de um PTC em um éxon inicial proximal ao local de iniciação nativo está associada a um risco de tradução ilegítima (ITL, também conhecida como iniciação de tradução alternativa (ATI)), produzindo a expressão inesperada de uma proteína truncada N-terminal que começa em um local de iniciação de tradução (TIS) a jusante do primeiro códon ATG. Para mitigar este último risco, recomenda-se avaliar a ocorrência de TIS alternativo usando ATGpr27 (atgpr.dbcls.jp) e/ou NetStart 1.028 (services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/).
    2. Certifique-se de que o éxon de destino contenha uma sequência de codificação. No entanto, pode ser útil escolher um recozimento de sgRNA com a região 5'UTR a montante do ATG inicial para incluí-lo no fragmento excluído.
    3. Idealmente, o éxon alvo deve ser comum a todas as variantes de transcrição codificadoras de proteínas do gene. Verifique se esse é o caso no Genome Data Viewer (www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/) do NCBI pesquisando o gene de interesse.
      Clicar no nome do gene (em verde) na janela de exibição mostrará as variantes de transcrição (em roxo). Os éxons são representados por um retângulo.
  7. No SnapGene Viewer, pressione Ctrl+F, Ctrl+V e Enter para pesquisar a sequência do éxon. Pressione Ctrl+T para adicionar um novo recurso, nomeie-o, altere o tipo para "exon" e clique em OK.
  8. Acesse o site do CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/) e cole a sequência de exons na Etapa 1. Primeiro, selecione um genoma de referência na Etapa 2 e, em seguida, o tipo de PAM a ser direcionado na Etapa 3, normalmente 20bp-NGG para SpCas9. Clique em ENVIAR.
  9. Selecione dois sgRNAs para que fiquem separados por até 150 pb e, em seguida, selecione um terceiro sgRNA entre eles. Aqui estão algumas diretrizes para a seleção de sgRNA:
    1. O escore de especificidade do MIT está relacionado a efeitos fora do alvo. Uma pontuação mais alta indica menos potenciais fora dos alvos. A coluna da direita exibe três locais fora do alvo previstos classificados do mais para o menos provável, juntamente com suas localizações (em um éxon, um íntron ou uma região intergênica). A lista completa de sites fora do alvo previstos pode ser acessada clicando em mostrar tudo. Se possível, selecione sgRNAs com uma pontuação MIT >80, priorizando aqueles sem alvos para 0, 1 ou 2 incompatibilidades. Além disso, sgRNAs com alvos fora de um éxon, que têm o maior potencial de afetar o fenótipo, devem ser evitados.
    2. Para eficácia prevista, consulte a pontuação Doench '16. Observe que uma pontuação alta de Doench '16 simplesmente indica que o sgRNA tem maior probabilidade de ser eficaz. A eficácia real deve ser determinada experimentalmente. Por esse motivo, é sempre útil selecionar vários sgRNAs, mesmo que não se destinem a ser usados juntos.
    3. Um conteúdo de GC muito alto ou muito baixo, bem como certos motivos, podem ser prejudiciais à eficiência do sgRNA e devem ser evitados. Esses parâmetros são destacados pelo CRISPOR.
  10. Repita a etapa 1.7 para adicionar a sequência de sgRNA e a sequência PAM associada à sequência do gene no SnapGene Viewer. Ao mesmo tempo, cole a sequência de sgRNA (sem o PAM) em um arquivo de texto ou Excel para manter a orientação 5'-3' necessária ao solicitar o oligonucleotídeo.
  11. Para amplificação baseada em PCR do local alvo, projete alguns primers ao redor dele. O tamanho do amplicon deve estar entre 800 e 1000 bp. O PrimerQuest foi usado para projetar os primers para este protocolo (https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest). Como alternativa, o CRISPOR fornece uma lista de primers para amplificar a região genômica alvo, bem como os locais fora do alvo. Depois de exibir a lista completa de possíveis locais fora do alvo (etapa 1.9.1), clique em Primers fora do alvo no canto inferior direito.

2. Reagente e preparação de células para eletroporação (Figura 1.2)

  1. Prepare uma placa de cultura de 24 poços para recuperar as células após a eletroporação, enchendo os poços com 500 μL de meio RPMI 1640 suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS) inativado por calor (56 ° C, 30 min) filtrado (0,20 μm). Não adicione antibióticos. Mantenha a placa em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% de CO2 por 24 h até a eletroporação.
  2. Se os sgRNAs forem enviados secos, reidrateie-os com tampão TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) até uma concentração final de 100 μM (ou seja, 10 μL de tampão TE por 1 nmol de sgRNA). Vortex por 30 s, incubar a 4 ° C durante a noite para permitir a reidratação completa e, após uma breve homogeneização da pipeta, armazenar a solução estoque de sgRNA a -20 ° C. Dependendo do volume final, faça alíquotas para evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento.
  3. Preparar uma solução de sgRNA funcional a uma concentração final de 30 μM, diluindo a solução-mãe de 100 μM em água isenta de nuclease. Vortex por 30 s e incubar 5 min em temperatura ambiente.
  4. Monte os RNPs Cas9:sgRNA em uma proporção molar de 1:9 diluindo simultaneamente 1 μL de cada um dos três sgRNAs de 30 μM e 0,5 μL de soluções Cas9 de 20 μM em 3,5 μL de tampão de ressuspensão R, incluído no kit de eletroporação (volume final de 7 μL, para uma condição experimental; dimensione de acordo). Vortex brevemente e incubar por 5 min em temperatura ambiente.
  5. Enquanto isso, prepare um controle não editado adicionando 0,5 μL de 20 μM Cas9 a 6,5 μL de tampão de ressuspensão R. Vórtice brevemente e incube por 5 min em temperatura ambiente.
  6. Adicione 5 μL de tampão de ressuspensão R a todas as amostras para um volume final de 12 μL por condição de eletroporação.
  7. Prepare as células THP-1 para eletroporação.
    1. Avaliar a concentração e a viabilidade pelo teste de exclusão do azul de tripano. Dilua as células 1:2 em uma solução de coloração azul de tripano a 0,4%. Após 30 s de incubação, homogeneizar bem e adicionar 10 μL em uma parede de uma câmara de contagem com um estilo de grade aprimorado por Neubauer. Conte três quadrados grandes e divida a contagem por 100 para obter a concentração celular (x106 células/mL).
      NOTA: A saúde das células influencia sua sensibilidade à eletroporação. Deve-se ter cuidado para realizar a cultura de células em condições ideais. O tempo fora da incubadora deve ser limitado e todos os reagentes e soluções devem ser preparados e aquecidos com antecedência.
    2. Para cada condição, colete um volume equivalente a 0,2 x 106 células e centrifugue (336 x g, 5 min, 20 ° C).
    3. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender o sedimento em 500 μL de PBS. Centrifugue novamente (336 x g, 5 min, 20 °C).
    4. Aspire o sobrenadante cuidadosamente usando uma pipeta e ressuspenda o pellet de células THP-1 com 12 μL de solução RNP (etapa 2.6).

3. Configuração do sistema de eletroporação e nucleofecção (Figura 1.3)

  1. Coloque a estação de pipeta sob um gabinete de biossegurança, coloque um tubo de eletroporação no suporte e adicione 3 mL de tampão E, incluído no kit de eletroporação.
  2. Depois de ligar o dispositivo de eletroporação, use a tela sensível ao toque para definir os seguintes parâmetros de eletroporação: Voltage = 1 500 V, Duração = 10 ms, Número = 3.
  3. Equipar a pipeta de eletroporação com uma ponteira e aspirar 10 μL da solução RNP/THP-1 (passo 2.7.4). Insira a pipeta no tubo de eletroporação e pressione Iniciar na tela do dispositivo de eletroporação. Aguarde até que a mensagem Concluído apareça e remova a pipeta do tubo.
  4. Transfira as células para um poço da placa pré-aquecida de 24 poços e homogeneize suavemente. Coloque a placa de volta na incubadora umidificada e deixe-a descansar sem ser perturbada por 72 h.
    NOTA: Tome cuidado para não fazer bolhas ao pipetar a suspensão RNP/THP-1, pois elas interferirão no procedimento de eletroporação. Se uma mensagem de erro aparecer na ausência de um arco elétrico visível, remova a pipeta de eletroporação do tubo e pressione Iniciar novamente. No entanto, se um arco elétrico na forma de uma breve faísca brilhante for observado, isso pode indicar a presença de bolhas. O procedimento de eletroporação provavelmente falhará, mesmo na ausência de uma mensagem de erro.

4. Recuperação de THP-1 72 h após a eletroporação (Figura 1.4)

  1. Contar as células para avaliar a concentração (passo 2.7.1) 72 h após a electroporação.
  2. Se houver células suficientes (ou seja, ≥0,6 x 106 células/mL), dilua-as pelo menos um fator 2 com RPMI suplementado com 20% de FBS e 1% de Penicilina-Estreptomicina e traga a concentração entre 0,3-0,5 x 106 células por mL. Caso contrário, permita que a célula se recupere por mais 72 h.
  3. Passe e amplifique as células até que haja o suficiente para a validação do KO. Enquanto isso, o isolamento de clones de célula única pode ser iniciado (etapa 7).

5. Validação da edição gênica pelo ensaio de incompatibilidade T7EI (Figura 1.5)

NOTA: O ensaio pode subestimar a eficiência de edição, uma vez que o T7EI reconhece incompatibilidades maiores que 1 pb. Assim, o ensaio T7EI não é útil para rastrear populações de células homozigóticas (ou seja, clones de células únicas), a menos que seja modificado adequadamente (etapa 5.7).

  1. Avalie a concentração celular (etapa 2.7.1) e retire um volume equivalente a 0,1 x 106 células em um tubo de 1,5 mL. Centrifugar (336 x g, 5 min, 20 °C), aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 μL de PBS. Centrifugar novamente e, com uma pipeta, aspirar o máximo de sobrenadante possível sem perturbar o sedimento. Congelar rapidamente a amostra e conservá-la a -20 °C.
  2. Extraia o DNA genômico para servir como matriz para amplificação por PCR.
    1. Ressuspenda o pellet com 50 μL de solução de extração de DNA, homogeneize e transfira todo o volume em um tubo de PCR de 0,2 mL. Vórtice e centrífuga brevemente (pulsar por 3 s).
    2. Coloque o tubo em um termociclador e aqueça-o a 65 °C por 15 min, seguido de 98 °C por 10 min.
    3. Diluir o ADN extraído com 90 μL de água ultrapura. Vórtice e centrífuga brevemente (5.000 x g, 3 s).
  3. Dilua o primer de PCR (consulte a Tabela de Materiais) em água ultrapura para uma concentração final de 10 μM (ou seja, 10 pmol/μL).
  4. Prepare a mistura de PCR (seguindo a NOTA abaixo) em um tubo de PCR de 0,2 mL (volume final = 50 μL, para uma condição). Normalmente, haverá pelo menos duas condições: o KO e o controle não editado apenas com Cas9.
    NOTA: DNA genômico purificado: 10 μL; Primer direto e reverso (10 μM): 2,5 μL cada, a concentração final de 500 nM; Tampão de reação (5x): 10 μL. Vórtice bem antes de adicionar. Misture dNTP (25 mM de cada): 0,6 μL, concentração final de 0,3 mM para cada dNTP. DNA polimerase: 0,5 μL; Água ultrapura: 23,9 μL. Vórtice e centrífuga brevemente (pulso por 3 s).
  5. Coloque os tubos no termociclador e execute o programa de PCR com as seguintes configurações:
    NOTA: Um ciclo a 95 °C durante 5 min, seguido de 30 ciclos [98 °C durante 20 s (fase de desnaturação), X °C durante 15 s (etapa de recozimento), 72 °C durante 45 s (etapa de alongamento)] e, em seguida, um ciclo final a 72 °C durante 2 min. No final da amplificação, remova os tubos, o vórtice e a centrífuga brevemente (pulso por 3 s). A temperatura de recozimento (X) é a temperatura de fusão (Tm) dos primers menos 5 °C.
  6. Para uma população policlonal editada: em um novo tubo de 0,2 mL, adicione 17,5 μL do amplicon de PCR e 2 μL de NEBuffer 2 (10x) para um volume final de 19,5 μL. Vórtice e centrifugue brevemente (pulso por 3 s). Alternativamente, para rastrear clones de célula única, misture 1:1 dos produtos de PCR das células de controle editadas e não editadas (etapa 5.6) (Figura Suplementar 1).
  7. Para a formação heteroduplex, coloque os tubos no termociclador e execute o seguinte programa: um ciclo a 95 °C por 10 min, um com rampa de -2 °C/s de 95 a 85 °C, um com rampa de -0,3 °C/s de 85 a 25 °C e um ciclo final de resfriamento a 10 °C em HOLD.
  8. Após a formação do heteroduplex, adicione 0,5 μL de solução de T7EI no tubo. Incubar a 37 °C durante 30 min.
  9. Prepare um gel de agarose a 1,2%:
    1. Pese a agarose em um frasco de vidro e adicione o volume apropriado de 1x tampão TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 8,3). Coloque-o no micro-ondas prestando atenção para não enroscar a tampa com firmeza. Aqueça várias vezes até que os cristais de agarose estejam completamente dissolvidos.
      NOTA: Se necessário, misture a solução. Não deixe ferver, ou o volume diminuirá, alterando a concentração de agarose.
    2. Adicione a mancha de gel de DNA diluída a 1/20.000 e misture bem.
    3. Despeje a solução de agarose em um molde, adicione um pente e deixe solidificar em temperatura ambiente.
  10. Prepare amostras para eletroforese em gel misturando 5 μL dos produtos de digestão T7EI (etapa 5.9) ou o produto de PCR não digerido com 5 μL de água e 2 μL de corante de carga de DNA 6x. Carregue as amostras e a escada de tamanho e migre a 80 V por 45 min (o tempo pode ser adaptado dependendo do tamanho esperado dos fragmentos de DNA). Terminada a migração, adquira uma imagem do gel com um sistema de imagem apropriado.

6. Validação da edição gênica por análise de sequenciamento de Sanger (Figura 1.6)

  1. Para caracterizar a modificação genética, purificar os produtos da PCR (etapa 5.4) e, após o sequenciamento de Sanger, analisar os resultados com a ferramenta ICE (https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis).
  2. Controle se uma proteína pode ser produzida apesar das modificações.
    1. Baixe os resultados do ICE e abra o arquivo contribs.txt.
    2. Compare as sequências editadas com a contraparte WT. Mapeie os indels e verifique se eles surgiram na região genômica alvo. Avalie seu tamanho. Se o comprimento indel não for um múltiplo de três, ocorrerá um frameshift e um PTC possivelmente será introduzido. Espera-se que o mRNA mutado sofra degradação mediada por NMD.

7. Isolamento de clone de célula única limitando a diluição (Figura 1.7)

NOTA: O isolamento de clones de célula única não é obrigatório. No entanto, se optar por fazê-lo, é importante caracterizar vários clones e comparar seu fenótipo com a população policlonal original.

  1. Colher uma amostra da suspensão celular, diluir 1/2 com meio de cultura e avaliar a concentração (passo 2.7.1). A diluição aumenta a precisão da contagem.
  2. Execute 2 a 3 etapas de diluição em série para atingir uma concentração de 7 células / mL. Dispense 100 μL da suspensão celular por poço em uma placa de fundo redondo de 96 poços (ou seja, 0,7 células por poço). Deixe a célula decantar por algumas horas antes de observar as placas no microscópio para identificar poços contendo uma célula.
  3. Monitore regularmente a formação e o crescimento de colônias e transfira células para uma placa ou frasco de cultura maior quando necessário.

8. Caracterização funcional de células THP-1 KO SAMHD1 por ensaio de restrição de HIV-1

  1. Semear THP-1 em uma placa de cultura de 24 poços com 0,25 x 106 células por poço em 300 μL de RPMI suplementado com 10% de FBS, 1% de Penicilina-Estreptomicina (RPMI completo) e contendo 300 ng/mL de PMA para diferenciação. Mantenha a placa em uma incubadora umidificada (37 °C, 5% CO2) por 24 h.
  2. Substitua o meio por um meio RPMI completo sem PMA e coloque a placa de volta na incubadora por mais 24 horas.
  3. Usando uma bomba de vácuo, aspire todo o meio de cultura. Adicione 250 μL de solução contendo estoque viral HIV-1-GFP pseudotipada com VSVg (MOI = 0,5 IFU / célula). Inclua um controle não infectado. Coloque a placa a 4 °C por 2 h para sincronizar a infecção.
  4. Lave as células uma vez com RPMI. Adicione 500 μL de RPMI completo a cada poço e incube por 48 h em condições padrão (o tempo pode ser ajustado).
  5. Depois de remover o meio de cultura, lave as células uma vez com PBS 1x frio. Em seguida, adicione 100 μL de tripsina-EDTA a 0,05% em cada poço. Colocar a placa numa incubadora a 37 °C até que as células estejam completamente separadas (5 min devem ser suficientes) antes de adicionar 200 μL de RPMI completo para inativar a enzima. Transfira 250 μL de cada poço para uma placa de fundo redondo de 96 poços (certifique-se de que o citômetro de fluxo aceite placas de cultura).
  6. Centrifugar a placa (757 x g, 3 min, desaceleração = 6, 20 °C) e aspirar o sobrenadante com uma pipeta multicanal. Ressuspenda o pellet com 100 μL de PFA a 4% e incube a 4 °C por 10 min. Adicione 100 μL de PBS 1X frio.
  7. Analise a taxa de infecção, representada por células positivas para GFP, por citometria de fluxo (consulte a Figura 2 suplementar para uma estratégia de gating sugerida).

Resultados

Uma linhagem celular THP-1 foi gerada expressando de forma estável a proteína repórter GFP (THP-1_GFP) (Figura 2A) e usada como ferramenta para estabelecer um protocolo para uma edição eficiente do gene mediada por CRISPR-Cas9. Para este objetivo, 3 sgRNA direcionados ao gene EGFP foram projetados com a ferramenta CRISPOR web29 (Figura 2B), que foram simultaneamente complexados com Cas9 em u...

Discussão

Aqui, um protocolo é descrito para obter uma edição mediada por CRISPR bem-sucedida da linha celular THP-1. A abordagem baseia-se na transferência de RNPs sgRNA/Cas9 pré-montados por eletroporação/nucleofecção. Essa estratégia foi escolhida para limitar os efeitos fora do alvo que potencialmente surgem na integração mediada por lentivírus do sgRNA/Cas9, produzindo expressão persistente da nuclease. Vários sgRNAs direcionados ao gene de interesse foram selecionados para obt...

Divulgações

Todos os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos ao JP Concordet (MNHN, U1154/UMR7196, Paris), G. Bossis (IGMM, Montpellier) e D. Schlüter (Hannover Medical School, Alemanha) pelo compartilhamento de protocolos e pela discussão. Este projeto recebeu financiamento do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia (acordo de subvenção n.º 101017572 à AZ) e da ANRS (subvenção ECTZ162721 à AZ). A infraestrutura de investigação do Modelo de Doenças Infecciosas e Terapias Inovadoras (IDMIT) é apoiada pelo "programa investissement d'avenir (PIA)" sob a referência ANR_11_INSB_0008.

Materiais

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0.2 µm syringe filterClearLine146560_
0.4 % trypan blueBeckman Coulter383200_
1.5 mL tubeEppendorf3810X_
24-well plateCorning353047_
6x TriTrack DNA Loading DyeThermo scientificR1161_
75 cm² Culture Flask Vented CapCorning353136_
8-Strip PCR Tubes with CapsLife technologiesAM12230_
96-well plates Flat bottomCorning353072_
96-well plates Round bottomCorning353077_
AgaroseEuromedexD5_
ATGpr__https://atgpr.dbcls.jp/
ChemiDoc Imaging SystemBIO-RAD12003153_
Counting slideNanoEntekDHC-N04_
CRISPOR__http://crispor.gi.ucsc.edu/
DPBSGibco14190094_
EnsemblEMBL-EBI_https://www.ensembl.org/index.html
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF7524_
FlowJoBD Life Sciencesv10.10_
GeneRuler 100 bp Plus DNA LadderThermo scientificSM0323_
Genome Data ViewerNCBI_https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/
GraphPad PrismDotmatics_Version 9.3.1
Herculase II Fusion DNA PolymerasesAgilent600679_
ICE CRISPR Analysis ToolSynthego_https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis
Image Lab TouchBIO-RAD_Version 2.4.0.03
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SIncluded with T7EI M0302S
Neon Kit, 10 µLInvitrogenMPK1025KElectroporation kit containing tips, tubes, buffer R and E
Neon Transfection SystemInvitrogenMPK5000_
NetStart 1.0__https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/
Nuclease-free WaterSynthego__
PCR primer (EGFP)Eurofins_Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT
PCR primer (SAMHD1)Eurofins_Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122_
PFAElectron Microscopy Sciences15714_
PMASigma-AldrichP8139_
PrimerQuestIDT_https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104_
QuickExtract DNA Extraction SolutionBiosearch TechnologiesQE09050_
RPMI 1640, GlutaMAXGibco61870010_
SnapGene ViewerDotmatics_Version 7
SpCas9 2NLS NucleaseSynthego__
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102_
Synthetic sgRNA (EGFP)Synthego_#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG
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Syringe Plastipak Luer LockBD301229_
T100 Thermal CyclerBIO-RAD1861096_
T7 endonuclease INew England BiolabsM0302S_
TAE buffer UltraPure, 10xInvitrogen15558026400 mM Tris-Acetate, 10 mM EDTA
THP-1 cellsATCCTIB-202_
Trypsin-EDTA (0,05 %)Gibco25300054_
ZE5 Cell AnalyzerBIO-RAD12014135_

Referências

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