免疫荧光检测哺乳动物细胞中的核泡和 DNA 泄漏

摘要

椎板瘤病疾病常导致核膜改变，这可能导致核起泡和渗漏。本研究提出了一种免疫荧光方法，可以可视化核层和双链 DNA （dsDNA），提供了一种评估哺乳动物细胞核结构和完整性的方法。

摘要

核层是核膜下方的细丝网络，由核纤层蛋白和核纤层蛋白相关蛋白组成。它在细胞核结构、细胞核孔定位、基因表达调控、染色质组织、DNA 复制和 DNA 修复中起关键作用。参与核纤层蛋白表达或翻译后加工的基因突变会导致称为核纤层蛋白病的遗传疾病。具体来说， LMNA 或 ZMPSTE24 基因的突变可导致未完全加工形式的层粘连蛋白 A 的积累，这些形式保留了法呢基和甲基，而法呢基和甲基在完全加工的层粘连蛋白 A 中不存在。这些未完全加工的核纤层蛋白 A 位于核内膜，而不是成熟核纤层蛋白 A 所在的核层。错位的核纤层蛋白会严重破坏核功能和结构，通常会导致核起泡。在严重的情况下，会发生核破裂，导致区室化缺失和基因组 DNA 泄漏到胞质溶胶中。异常的核结构和区室化丢失可以通过对固定细胞的间接免疫荧光 （IF） 来识别。本研究概述了这种方法，采用针对核纤层蛋白和双链 DNA （dsDNA） 的特异性抗体同时可视化核膜和 DNA。这种方法能够快速评估核结构完整性和核 DNA 泄漏到胞质溶胶中的可能性。

引言

核层是位于核膜基础上的细丝网络，由称为核纤层蛋白的蛋白质组成。核层在核结构、核孔定位、基因表达调控、染色质组织、DNA 复制和 DNA 修复中起着重要作用 ^1,2,3。在核纤层蛋白表达中发挥作用的基因突变会导致称为 核纤层蛋白病³.

限制性皮肤病 （RD） 是一种严重的椎间板病疾病，主要由复合杂合突变引起，这些突变在 ZMPSTE24 基因⁴ 中产生过早终止密码子，导致金属蛋白酶ZMPSTE24缺失。这种椎板病的特征是宫内生长迟缓、皮肤紧绷、僵硬、嘴小、头发稀疏和骨矿化缺陷¹。由于肺功能不全¹ （pulmonary insuffency），RD 患者通常活不过出生后的第一周。另外两种称为非典型 Hutchinson-Gilford 早衰综合症 （AT-HGPS） 和 B 型下颌骶部发育不良 （MAD-B） 的疾病涉及 ZMPSTE24 表达降低，与寿命缩短有关，并显示出与早衰疾病的相似性⁵。在这些椎板病中受影响的 ZMPSTE24蛋白酶在核纤层蛋白 A 的翻译后修饰中至关重要，核纤层蛋白 A 是核纤层的关键成分。ZMPSTE24缺陷导致未完全加工的法尼基化形式的层粘连蛋白 A 的积累，称为 prelamin A²。

图 1：正常 Lamin A 加工与 RD 细胞。正常细胞中的 Lamin A 加工途径（左）和 RD 或 ZMPSTE 缺陷细胞中改变的 Lamin A 加工（右）。图示法呢基 （Fa） 和甲基 （Me）。请单击此处查看此图的较大版本。

如图 1 所示，在正常的核纤层蛋白 A 加工中，法呢基（脂质）基团连接到 C 端附近的半胱氨酸残基上，然后三个 C 端氨基酸的蛋白水解裂解 ^3,6。然后将半胱氨酸残基甲基化。这两种修饰使 prelamin A 能够靶向内核膜²。然后 ZMPSTE24 进行切割反应，其中最后 15 个 C 末端氨基酸以及法呢基和甲基被去除，以产生成熟的核纤层蛋白 A 蛋白，该蛋白被递送到核层 ^6,7,8。在 RD、AT-HGPS 和 MAD-B 中，由于 ZMPSTE24 金属蛋白酶缺乏或功能不全，因此加工的最后一步无法有效进行 ^8,9。这导致 prelamin A 的积累，其保持永久的法尼基化和甲基化⁹。后一组导致前核纤层蛋白 A 粘附在核内膜上，而不是定位于核层，成熟的核纤层蛋白 A 最终应该驻留在核层中，如图 1 所示。因此，ZMPSTE 缺陷对多种核功能以及核结构^{10,11,12,13,14,15} 具有深远影响。核结构的这些改变可能包括核起泡甚至核破裂，这可能导致 DNA 泄漏到胞质溶胶中以及胞质溶胶进入细胞核。形状异常的细胞核确实是椎板病疾病的标志，以及由前纤层蛋白 A 加工缺陷引起的许多其他表型^16,17。核层缺陷会导致多种有害影响，包括核蛋白质量控制和 DNA 修复蛋白在核质中的错误定位，这反过来又会导致核功能的许多缺陷¹⁸。重要的是要有一种简单的技术可以帮助识别和监测椎板病的这些标志，以促进对旨在改善椎板病表型的治疗方法开发的研究。对于患有椎板病的小鼠，已经表明核起泡的消除与椎板病表型的普遍消除相关¹⁶。一种允许监测人类细胞中核完整性的技术可以加强对消除或显着改善疾病表型的潜在治疗方法的研究。

间接免疫荧光 （IF） 是一种灵敏且广泛使用的技术，它同时使用未标记的一抗和识别一抗的荧光团标记的二抗来检测目标靶标¹⁹。IF 方法可以为可视化特定的细胞内成分和结构提供强大的方法。也可能有多个二抗分子与一抗相互作用，从而导致信号放大¹⁹。间接 IF 是一种多功能技术，还允许使用相对较少的二抗组检测多种一抗，因为二抗是针对一抗的 Fc 结构域产生的，而该结构域在物种¹⁹ 中是保守的。

本文介绍了一种间接 （IF） 方法，用于评估 ZMPSTE24 缺陷细胞中的核起泡和 DNA 泄漏，使用针对双链 DNA （dsDNA） 和核纤层蛋白 B1 的抗体分别检测 DNA 和核层。为了证明这种方法的实用性，将该程序应用于ZMPSTE24表达敲除的 HeLa 细胞系以及表达 ZMPSTE24 的 HeLa 细胞系，并比较了两种细胞系的结果。

研究方案

材料表中列出了所用试剂和所用设备的详细信息。

1. 准备材料

1. 在将细胞接种到盖玻片上之前，将至少 10 个 22 mm x 22 mm 方形玻璃盖玻片和镊子高压灭菌。

2. 溶液的制备

1. 补充培养基：制备 500 mL Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM），其中含有 10% 胎牛血清 （FBS）、100 单位/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素。
2. 抗体稀释缓冲液 （ADB）：将 2 g 牛血清白蛋白 （BSA） 和 1 g 鱼明胶溶于 80 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。BSA 和鱼明胶溶解后，用 PBS 加入 100 mL。
3. 1x PBS-Tween （PBS-T）：准备 500 mL 的 PBS 和 0.5 mL 的 Tween。置于 37 °C 水浴中，直到 Tween 可以很容易地混合到溶液中。

3. 培养所需的细胞

注：HeLa 细胞在该方案中生长以在 T75 培养瓶内汇合。

1. 用 70% 乙醇喷洒六个盖玻片，并在无绒抹布上风干。使用镊子将盖玻片放入无菌 6 孔板中，每孔一个盖玻片。
2. 向 6 孔板中的每个孔中加入 2 mL 补充的 DMEM。
3. 从细胞中吸出培养基，并向培养瓶中加入 15 mL PBS 洗涤细胞，轻轻旋转。吸出 PBS 并加入 2 mL 胰蛋白酶-EDTA（胰蛋白酶）。
   1. 用胰蛋白酶包被细胞，并将培养瓶放回 37 °C 和 5% CO₂ 加湿培养箱中 2 分钟，以使细胞从培养瓶中分离。
4. 向培养瓶中加入 8 mL 补充的 DMEM，以收集胰蛋白酶消化的细胞。上下移液几次以分离聚集的细胞。将细胞悬液收集在培养瓶中，并将其放入 15 mL 聚苯乙烯管中。
5. 使用血细胞计数器计数细胞。
6. 将 500,000 个细胞逐滴直接添加到 6 孔板的每个盖玻片上。让细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下在加湿培养箱中生长过夜。

4. 细胞固定和透化

1. 使用前准备新鲜的 4% 甲醛溶液：将 2 mL 37.5% 甲醛溶液加入 18 mL PBS 中。充分混合。
2. 使用前准备新鲜的透化溶液：将 100 μL Triton-X 添加到 20 mL PBS 中。在 37 °C 水浴中孵育几分钟，直到 Triton-X 溶解到溶液中。充分混合。
3. 吸出板孔中的培养基。用 2 mL PBS 洗涤细胞一次。从孔中吸出所有 PBS。
4. 向每个孔中加入 2 mL 4% 甲醛溶液。在室温 （RT） 下静置 10 分钟。从孔中完全吸出 4% 的甲醛。
5. 用 2 mL PBS 洗涤细胞 3 次。每次洗涤后从孔中完全去除 PBS。
6. 向每个孔中加入 2 mL 透化溶液。在 RT 下静置 10 分钟。完全吸出透化溶液。
7. 用 2 mL PBS 洗涤细胞 3 次。前两次洗涤后完全吸出 PBS，第三次洗涤后将 PBS 留在孔中。
   注意：在此步骤后，细胞可以在 4 °C 的最后一次 PBS 洗涤液中储存数周，确保板用石蜡膜密封以避免液体蒸发。如果可以继续该过程，则可以跳过此步骤。

5. 免疫荧光染色

1. 从孔中取出所有 PBS。通过向每个孔中加入 2 mL ADB 来封闭细胞，并在 RT 下孵育，摇动 30 分钟。
2. 在 30 分钟封闭时间结束时，在 ADB 中混合一抗稀释液（Lamin B1 和 dsDNA 抗体的稀释度均为 1：1,000， 表 1）。每个盖玻片需要 75 μL，因此应混合 600 μL ADB、0.6 μL Lamin B 一抗和 0.6 μL dsDNA 抗体，用于 6 个盖玻片。彻底涡旋。
3. 从孔中取出 ADB。在平坦的表面上，用胶带粘住一块面积足够大的石蜡薄膜，以放置所有正在处理的盖玻片。
4. 对于每个盖玻片，在石蜡膜上加入 75 μL 一抗稀释液，确保 ADB 中没有气泡移液。然后，使用镊子将盖玻片细胞面朝下放在 ADB 的液滴上。
5. 用孔板盖住孵育盖玻片，并在 RT 下孵育 1 小时。
6. 使用镊子从石蜡膜上取下盖玻片，然后将盖玻片放回 6 孔板中，细胞面朝上。
7. 用 2 mL PBS-T 洗涤盖玻片 3 次，每次摇动 3-5 分钟。每次洗涤后从孔中取出所有 PBS-T。
8. 在最后一次洗涤期间，准备二抗稀释液（两种二抗的比例为 1：1,000， 表 1）。每个盖玻片需要 75 μL，因此应混合 600 μL ADB 和 0.6 μL 两种二抗 Alexa Fluor 标记的抗体，用于 6 个盖玻片。彻底涡旋。尽可能遮光覆盖二抗稀释液。

抗体			源	公司	参考
dsDNA 标记抗体 （HYB331-01）			小鼠单克隆抗体	圣克鲁斯	编号 SC-58749
山羊抗小鼠 IgG （H+L） 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488			山羊	赛默飞世尔	编号 A32723
山羊抗小鼠 IgG （H+L） 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 405			山羊	Invitrogen 公司	编号 A31553
Lamin B1 多克隆抗体			兔	蛋白质科技	12987-1-美联社
山羊抗兔 IgG （H+L） 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594			山羊	Invitrogen 公司	编号 A11037

表 1：抗体。 本协议中使用的所有抗体列表。

9. 从最后一次洗涤中去除所有 PBS-T。如步骤 5 所示，将盖玻片在石蜡膜上的二抗稀释液中在 RT 下孵育 30 分钟。此步骤和所有其余步骤避光。可以使用一个小盒子来遮光。确保在需要时快速工作，从孔中添加或移除溶液。
10. 使用镊子从石蜡膜上取下盖玻片，然后将盖玻片放回 6 孔板中，细胞面朝上。
11. 用 2 mL PBS-T 洗涤盖玻片 3 次。每次洗涤后从孔中取出所有 PBS-T。
12. 用乙醇系列（70%、90%、100%）脱水载玻片。首先向每个孔中加入 2 mL 的 70% 乙醇。静置 1-2 分钟，然后从孔中去除所有乙醇。对剩余的乙醇百分比重复。
13. 使用镊子从孔中取出盖玻片，让它们在避光的情况下用无绒抹布风干。
14. 将盖玻片的细胞面朝下安装在玻璃显微镜载玻片上，每个盖玻片使用 20 μL 封固剂。避光晾干一夜。

6. 图像采集

1. 成像前，在盖玻片的边缘涂上一层薄薄的透明指甲油（任何品牌或类型都足够）。避光风干。
   注意：使用显微镜成像的说明会有所不同，具体取决于所使用的显微镜。此处使用的显微镜上相机的分辨率为 1280 x 960 像素。相似或更好的分辨率就足够了。
2. 在将载玻片放在显微镜载物台上之前，必须调整文件保存设置。打开显微镜并插入 USB 驱动器。在显微镜设置中调整保存设置，并确保所有通道（GFP 和 RFP）将单独保存，并且图像将转到 USB 驱动器上的正确位置。
   注意：在 USB 驱动器上创建一个文件夹，并为每个盖玻片命名以备将来参考。
3. 成像前，用 70% 乙醇喷洒无绒抹布，然后轻轻清洁载玻片背面。轻轻清洁载玻片的前部，确保施加的压力非常小。
4. 将干净的载玻片放在显微镜上，盖玻片朝下。盖上遮光罩。
5. 使用 40 倍物镜，使用适当的通道（此处使用的核纤层蛋白 B1 抗体的 RFP）在显微镜屏幕上定位细胞核。将光照强度调整到 50% 左右以开始。
6. 要检查过饱和区域，请选择 Color Off（颜色关闭）选项，并确保盖玻片上没有区域在黑白设置中具有红色信号。如果红色信号很多，请降低光照强度，直到显示最小的红色信号。
   注意： 红色信号表示过度饱和。如果细胞核几乎不可见，则以 10% 的增量增加强度，直到达到适当的强度而不会过度饱和。
7. 检查具有相同强度的所有其他盖玻片，以确保它们没有过度饱和。使用与上述相同的过程（此处使用的 dsDNA 抗体的 GFP）检查另一个通道的所有盖玻片。
8. 记录每个通道的光照强度。确保每个通道的所有光强度在整个成像过程中保持不变。
9. 单独对每个盖玻片进行成像。从第一个通道开始，聚焦细胞核，然后捕获图像。
10. 小心切换通道并再次聚焦细胞。聚焦后，捕获图像。
11. 在必要的通道（GFP 和 RFP）中捕捉图像后，选择 叠加 以观察合并的图像，并确保幻灯片在拍摄图像时不会移动。如果通道不重叠，请重做必要的通道，直到图像对齐。
12. 通过单击 闪存驱动器 图标保存图像。移动到盖玻片上的其他位置以继续成像。
    注意：确保每次对盖玻片的不同区域进行成像，以避免重复捕获同一区域。建议从盖玻片的左上角开始成像，并沿 “S ”模式移动，以确保完全覆盖而不会重复。

7. 数据分析

1. 使用此方法获得的数据是可视化的。检查图像是否有 DNA 泄漏或核起泡的迹象。起泡和泄漏的示例显示在代表性结果部分。

结果

本研究介绍了一种结合双链 DNA （dsDNA） 可视化核层的 IF 方法。进行 IF 后，可以检查捕获的图像是否有核起泡和 DNA 泄漏的迹象。

图 2：HeLa CT 和 ZMPSTE24 KO 细胞 中的核泡...

讨论

所提出的方案包含几个关键步骤，其中最重要的是用一抗和二抗处理固定细胞。确保在所用显微镜范围内使用针对目标靶标的高质量一抗和正确的相应二抗和荧光团，将产生最佳结果¹⁹。抗体的质量会极大地影响该技术的结果，因为有缺陷的抗体会与非特异性靶标相互作用或无法识别感兴趣的靶标^19,20。此外，...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 mm Square Glass Coverslips	Propper Manufacturing Company	M8710	Any size or shape can be used as long as they can be fixed to a standard microscope slide.
36.5% Formaldehyde	Sigma Aldrich	F8775	Fixation Reagent.
75 cm 2 Flasks	Corning	430725U	For cell culture.
Bovine Serum Albinum (BSA)	Fisher Scientific	9048-46-8	Antibody dilution buffer.
DMEM with 1 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-014-CV	For cell culture.
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2701	For dehydration of samples before mounting, diluted to make multiple concentrations.
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope	Fisher Scientific	12-563-460	Imaging.
Fish Gelatin	Sigma Aldrich	G7041	Antibody dilution buffer.
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Mounting medium to prevent photobleaching.
Parafilm (4 in)	Fisher Scientific	13-374-12	Any size can be substituted, as long as the coverslips being used can fit.
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15-140-122	For cell culture.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	N/A	N/A	Made and sterilized in the lab for tissue culture and solutions.
Premium Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	For cell culture.
Superfrost Premium Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7	Any standard microscope slides can be used.
Tissue Culture Treated 6-well Flat Bottom Plates	Falcon	353046	For cell culture.
TritonX-100	Thermofisher Scientific	A16046.AP	For washing.
Trypsin-EDTA (0.5%)	Gibco	15-400-054	For cell culture.
Tween 20	Fisher Scientific	9005-64-5	Cell Permeation reagent.