Обнаружение ядерного блеббинга и утечки ДНК в клетках млекопитающих с помощью иммунофлюоресценции

Резюме

Ламинопатические расстройства часто приводят к изменениям в ядерной оболочке, что может привести к образованию ядерного пузыря и утечке. В этом исследовании представлен иммунофлуоресцентный метод визуализации ядерной пластинки вместе с двухцепочечной ДНК (дцДНК), обеспечивающий средства для оценки ядерной структуры и целостности в клетках млекопитающих.

Аннотация

Ядерная пластинка представляет собой сеть нитей, лежащих в основе ядерной мембраны, состоящую из ламинов и белков, связанных с ними. Он играет важнейшую роль в ядерной архитектуре, позиционировании ядерных пор, регуляции экспрессии генов, организации хроматина, репликации ДНК и репарации ДНК. Мутации в генах, участвующих в экспрессии или посттрансляционной обработке белков ламина, приводят к генетическим нарушениям, известным как ламинопатии. В частности, мутации в генах LMNA или ZMPSTE24 могут привести к накоплению не полностью переработанных форм ламина А, которые сохраняют фарнезиловые и метильные группы, отсутствующие в полностью переработанном ламине А. Эти не полностью обработанные белки ламина А локализуются во внутренней ядерной мембране, а не в ядерной пластинке, где находится зрелый ламин А. Неправильно локализованные ламинные белки глубоко нарушают ядерную функцию и структуру, что часто приводит к ядерному блеббингу. В тяжелых случаях может произойти разрыв ядра, вызывающий потерю компартментализации и утечку геномной ДНК в цитозоль. Аномальная структура ядра и потеря компартментализации могут быть идентифицированы с помощью непрямой иммунофлюоресценции (ИФ) на фиксированных клетках. В этом исследовании описывается такой метод, использующий специфические антитела против белка ламина и двухцепочечной ДНК (дцДНК) для одновременной визуализации ядерной оболочки и ДНК. Такой подход позволяет быстро оценить структурную целостность ядра и потенциальную утечку ядерной ДНК в цитозоль.

Введение

Ядерная пластинка представляет собой сеть нитей, которая лежит в основе ядерной мембраны и состоит из белков, называемых ламинами. Ядерная пластинка играет важную роль в ядерной архитектуре, позиционировании ядерных пор, регуляции экспрессии генов, организации хроматина, репликации ДНК и репарации ДНК ^1,2,3. Мутации в генах, которые играют роль в экспрессии белков ламина, приводят к генетическим нарушениям, называемым ламинопатиями^.

Рестриктивная дермопатия (РД) — это тяжелое заболевание ламинопатии, вызванное преимущественно сложными гетерозиготными мутациями, которые создают преждевременные терминирующие кодоны в гене^{ZMPSTE24 4}, что приводит к отсутствию металлопротеазы ZMPSTE24. Эта ламинопатия характеризуется задержкой внутриутробного развития, плотной, жесткой кожей, маленьким размером рта, тонкими волосами и дефектами минерализации костей¹. Пациенты с ПД обычно не доживают до первой недели жизни из-за легочной недостаточности¹. Два других расстройства ламинопатии, известные как атипичный синдром прогерии Хатчинсона-Гилфорда (AT-HGPS) и мандибулоакральная дисплазия типа B (MAD-B), связаны со сниженной экспрессией ZMPSTE24 и связаны с уменьшением продолжительности жизни и демонстрируют сходство с расстройствами преждевременного старения⁵. Протеаза ZMPSTE24, которая воздействует при этих ламинопатиях, жизненно важна для посттрансляционной модификации ламины А, которая является критическим компонентом ядерной пластинки. ZMPSTE24 дефицит приводит к накоплению не полностью переработанной фарнезилированной формы ламина А, известной как преламин^А2.

Рисунок 1: Обработка ламина А в норме и . RD-клетки. Процессинговый путь ламина А в нормальных клетках (слева) и процессинг измененного ламина А в RD, или клетки с дефицитом ZMPSTE (справа). Указаны фарнезиловые (Fa) и метильные (Me) группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Как видно на рисунке 1, при нормальном процессинге ламина А фарнезильная (липидная) группа присоединяется к остатку цистеина вблизи С-конца, после чего происходит протеолитическое расщепление трех С-концевых аминокислот ^3,6. Затем остаток цистеина метилируется. Эти две модификации позволяют нацелить преламин А на внутреннюю ядерную мембрану². Затем ZMPSTE24 проводит реакцию расщепления, в ходе которой последние 15 С-концевых аминокислот вместе с фарнезильными и метильными группами удаляются с образованием зрелого белка Ламина А, который доставляется в ядерную пластинку ^6,7,8. В RD, AT-HGPS и MAD-B заключительная стадия процессинга не происходит эффективно, поскольку ZMPSTE24 металлопротеиназа отсутствует или не^{полностью функциональна.} Это приводит к накоплению преламина А, который остается постоянно фарнезилированным и метилированным⁹. Эти последние группы приводят к тому, что преламин А прилипает к внутренней ядерной мембране вместо того, чтобы локализоваться в ядерной пластинке, где в конечном итоге должен находиться зрелый ламин А, как показано на рисунке 1. Таким образом, дефицит ZMPSTE оказывает глубокое воздействие на различные ядерные функции, наряду со структурой ядра ^{10,11,12,13,14,15}. Эти изменения в структуре ядра могут включать в себя ядерное блеббинг и даже разрыв ядра, что может привести к утечке ДНК в цитозоль, а также к проникновению цитозоля в ядро. Ядра аберрантной формы действительно являются отличительной чертой ламинопатийных расстройств, наряду со многими другими фенотипами, которые вызваны дефектным процессингом преламина А^16,17. Дефекты в ядерной пластинке приводят к множеству пагубных последствий, включая неправильную локализацию контроля качества ядерных белков и белков репарации ДНК в нуклеоплазме, что, в свою очередь, приводит к многочисленным дефектам в ядерной функции^. Важно иметь простую методику, которая может помочь идентифицировать и контролировать эти признаки ламинопатий, чтобы облегчить исследования по разработке терапевтических подходов, направленных на улучшение фенотипов ламинопатии. Для мышей с ламинопатиями было показано, что элиминация ядерного блеббинга коррелирует с общей элиминацией фенотипов ламинопатии¹⁶. Метод, позволяющий осуществлять мониторинг ядерной целостности в клетках человека, может улучшить изучение потенциальных методов лечения для устранения или значительного улучшения фенотипов заболеваний.

Непрямая иммунофлуоресценция (ИФ) является чувствительным и широко используемым методом, в котором используется как первичное немеченое антитело, так и меченное флуорофором вторичное антитело, которое распознает первичное антитело для обнаружения интересующей^{мишени 19}. Методы ПЧ могут предоставить мощные средства для визуализации конкретных внутриклеточных компонентов и структур. Также возможно, что более одной молекулы вторичного антитела могут взаимодействовать с первичным антителом, что приводит к усилению сигнала¹⁹. Непрямая ПЧ является универсальным методом, который также позволяет обнаруживать множественные первичные антитела с относительно небольшим набором вторичных антител, поскольку вторичные антитела поднимаются против Fc-домена первичного антитела, который консервативен в пределах вида¹⁹.

В данной статье описывается метод косвенного (ЕСЛИ) для оценки ядерного блеббинга и утечки ДНК в клетках с дефицитом ZMPSTE24 с использованием антител против двухцепочечной ДНК (дцДНК) и ламина B1 для обнаружения ДНК и ядерной пластинки соответственно. Чтобы продемонстрировать полезность этого подхода, процедура была применена к клеточной линии HeLa с нокаутированной экспрессией ZMPSTE24, а также к клеточной линии HeLa, экспрессирующей ZMPSTE24, и результаты для двух клеточных линий были сравнены.

протокол

Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка материалов

1. Автоклав не менее десяти квадратных стеклянных покровных колпачков и щипцов размером 22 мм x 22 мм перед нанесением ячеек на покровные стекла.

2. Приготовление растворов

1. Дополнительные среды: Приготовьте 500 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) от Dulbecco с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
2. Буфер для разведения антител (ADB): Растворите 2 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 1 г рыбьего желатина в 80 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS). Доведите до 100 мл PBS после растворения BSA и рыбьего желатина.
3. 1x PBS-Tween (PBS-T): Приготовьте 500 мл PBS и 0,5 мл Tween. Поместите на водяную баню при температуре 37 °C до тех пор, пока Tween не сможет легко смешаться с раствором.

3. Выращивание нужных клеток

Примечание: Клетки HeLa выращивали по этому протоколу до конфлюенции в колбе T75.

1. Сбрызните шесть покровных стекол 70% этанолом и дайте им высохнуть на воздухе на безворсовой салфетке. Поместите покровные листы в стерильный 6-луночный планшет с помощью щипцов, по одному покровному листу на лунку.
2. Добавьте по 2 мл дополненного DMEM в каждую лунку в 6-луночном планшете.
3. Отсадите среду из клеток и промойте клетки, добавив в колбу 15 мл PBS, аккуратно взбалтывая. Аспирируйте PBS и добавьте 2 мл трипсина-ЭДТА (трипсина).
   1. Смажьте клетки трипсином и поместите колбу обратно в инкубатор, увлажненный при температуре 37 °C и 5%_CO2 , на 2 минуты, чтобы клетки могли отсоединиться от колбы.
4. Добавьте в колбу 8 мл дополненного DMEM для сбора трипсинизированных клеток. Проведите пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы отделить комкующиеся ячейки. Соберите клеточную суспензию в колбу и поместите ее в полистирольную пробирку объемом 15 мл.
5. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
6. Добавляйте 500 000 ячеек, капля за каплей, непосредственно на каждый из покровных стекол в 6-луночном планшете. Дайте клеткам вырасти в течение ночи при 37 °C и 5%_CO2 в увлажненном инкубаторе.

4. Фиксация и пермеабилизация клеток

1. Перед применением приготовьте 4% раствор формальдегида в свежем виде: Добавьте 2 мл 37,5% раствора формальдегида в 18 мл PBS. Тщательно перемешиваем.
2. Приготовьте свежий раствор для пермеабилизации перед использованием: добавьте 100 μл Triton-X в 20 мл PBS. Дайте поинкубироваться на водяной бане при температуре 37 °C в течение нескольких минут, пока Triton-X не растворится в растворе. Тщательно перемешиваем.
3. Отсасывайте среду в лунки пластины. Промойте ячейки один раз 2 мл PBS. Отсасывайте все PBS из лунок.
4. Добавьте в каждую лунку по 2 мл 4% раствора формальдегида. Оставьте на 10 минут при комнатной температуре (RT). Полностью отасывайте 4% формальдегида из лунок.
5. Промойте ячейки 3 раза 2 мл PBS. Полностью удаляйте PBS из лунок после каждой промывки.
6. Добавьте по 2 мл раствора для пермеабилизации в каждую лунку. Оставьте на 10 минут на RT. Полностью аспирируйте раствор для пермеабилизации.
7. Промойте ячейки 3 раза 2 мл PBS. Полностью аспирируйте PBS после первых двух промывок, оставляя PBS в лунках после третьей промывки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Элементы можно хранить в последней промывке PBS при температуре 4 °C в течение нескольких недель после этого этапа, обеспечивая герметичность пластины парафиновой пленкой во избежание испарения жидкости. Если процедуру можно продолжить, этот шаг можно пропустить.

5. Иммунофлюоресцентное окрашивание

1. Удалите все PBS из лунок. Заблокируйте ячейки, добавив 2 мл ADB в каждую лунку, и инкубируйте при RT, покачивая в течение 30 минут.
2. К концу 30-минутного времени блокировки смешайте первичное разведение антител в ADB (разведение 1:1000 для антител к Lamin B1 и dsDNA, Таблица 1). Для каждого покровного стекла необходимо 75 μл, поэтому для шести покровных покрытий следует смешать 600 μл ADB, 0,6 μл первичного антитела Lamin B и 0,6 μL антитела к дцДНК. Вортекс тщательно.
3. Удалите ADB из скважин. На плоскую поверхность приклейте скотчем кусок парафиновой пленки, площадь которого достаточно велика, чтобы уложить все обрабатываемые покровные стекла.
4. Для каждого покровного стекла добавьте 75 мкл первичного разведения антител на парафиновую пленку, следя за тем, чтобы в ADB не образовывались пузырьки. Затем положите покровную ячейку вниз на каплю ADB с помощью щипцов.
5. Накройте инкубационные крышки крышкой луночного планшета и дайте инкубироваться в течение 1 часа при RT.
6. Снимите покровные стекла с парафиновой пленки с помощью щипцов и поместите их обратно в 6-луночный планшет стороной ячейки вверх.
7. Промойте покровные стекла 3 раза 2 мл PBS-T, каждый раз покачиваясь в течение 3-5 минут. Удаляйте все PBS-T из лунок после каждой промывки.
8. Во время последней промывки приготовьте разведение вторичных антител (1:1000 для обоих соответствующих вторичных антител, Таблица 1). Для каждого покровного стекла необходимо 75 μл, поэтому для шести покровных покрытий следует смешать 600 μл ADB и 0,6 μл обоих вторичных антител, меченных Alexa Fluor. Вортекс тщательно. Максимально прикрывайте вторичное разведение антител от света.

Антитело			Источник	Компания	Ссылка
Антитела к маркерам дцДНК (HYB331-01)			Мышь моноклональная	Санта-Крус	СК-58749
Козье антимышиное антитело IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции, Alexa Fluor Plus 488			Коза	ТермоФишер	А32723
Козье антимышиное антитело IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции, Alexa Fluor Plus 405			Коза	Инвитроген	А31553
Поликлональное антитело к ламину B1			Кролик	Протеинтек	12987-1-АП
Козье антитело против кролика IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции, Alexa Fluor 594			Коза	Инвитроген	А11037

Таблица 1: Антитела. Список всех антител, используемых в этом протоколе.

9. Удалите все PBS-T с последней стирки. Инкубируйте покровные стекла во вторичном разведении антител на парафиновой пленке, как на этапе 5, в течение 30 минут при RT. Защищайте от света на этом этапе и на всех остальных этапах. Для экранирования света можно использовать небольшой ящик. Убедитесь, что вы работаете быстро, когда это необходимо, чтобы добавить или удалить растворы из скважин.
10. Снимите покровные стекла с парафиновой пленки с помощью щипцов и поместите их обратно в 6-луночный планшет ячейкой вверх.
11. Промойте покровные стекла 3 раза 2 мл PBS-T. Удаляйте все PBS-T из лунок после каждой промывки.
12. Обезвоживайте предметные стекла с помощью этанола (70%, 90%, 100%). Начните с добавления 2 мл 70% этанола в каждую лунку. Дайте постоять 1-2 минуты и удалите весь этанол из лунок. Повторите то же самое с оставшимся процентом этанола.
13. Снимите покровные стекла с лунок с помощью щипцов и дайте им высохнуть на воздухе, защищенном от света, на безворсовой салфетке.
14. Установите покровное стекло клеточной стороной вниз на предметное стекло микроскопа, используя 20 мкл монтажного материала на каждое покровное стекло. Дайте высохнуть в течение ночи, защищенное от света место.

6. Получение изображения

1. Перед нанесением изображения покройте края покровных лаков тонким слоем прозрачного лака для ногтей (подойдет любая марка или тип). Дайте высохнуть на воздухе в защищенном от света месте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по использованию микроскопа для получения изображений могут различаться в зависимости от используемого микроскопа. Разрешение камеры на используемом здесь микроскопе составляет 1280 x 960 пикселей. Будет достаточно аналогичного или лучшего разрешения.
2. Перед тем, как поставить предметное стекло на предметный столик микроскопа, необходимо отрегулировать параметры сохранения файлов. Включите микроскоп и вставьте USB-накопитель. Отрегулируйте параметры сохранения в настройках микроскопа и убедитесь, что все каналы (GFP и RFP) будут сохраняться отдельно, а изображения будут отправляться в правильное место на USB-накопителе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Создайте папку на USB-накопителе и присвойте каждой обложке собственное имя для дальнейшего использования.
3. Перед визуализацией распылите на безворсовую салфетку с 70% этанолом и аккуратно очистите обратную сторону предметных стекол. Аккуратно очистите переднюю часть слайдов, обеспечивая минимальное давление.
4. Положите на микроскоп чистое предметное стекло покровными стеклами вниз. Накройте световым щитом коробку.
5. Используя объектив с 40-кратным увеличением, используйте соответствующий канал (RFP для используемого здесь антитела к ламину B1) для определения местоположения ядер на экране микроскопа. Для начала отрегулируйте интенсивность света примерно до 50%.
6. Чтобы проверить наличие перенасыщенных областей, выберите опцию «Выключить цвет» и убедитесь, что ни на одной области покровного стекла нет красного сигнала в черно-белом режиме. Если красного сигнала много, уменьшите интенсивность света до тех пор, пока не появится минимальный красный сигнал.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Красный сигнал указывает на перенасыщение. Если ядра кажутся едва заметными, увеличивайте интенсивность с шагом 10% до тех пор, пока не будет достигнута соответствующая интенсивность без пересыщения.
7. Проверьте все остальные покровные стекла с той же интенсивностью, чтобы убедиться, что они не перенасыщены. Проверьте все покровные листы с помощью другого канала, используя тот же процесс, что и выше (GFP для антител к дцДНК, используемый здесь).
8. Запишите интенсивность света для каждого канала. Убедитесь, что интенсивность света для каждого канала остается постоянной на протяжении всего процесса визуализации.
9. Сфотографируйте каждый покровный лист по отдельности. Начните с первого канала, сфокусируйте ядра и сделайте снимок.
10. Осторожно переключайте каналы и снова сфокусируйте клетки. Когда вы сфокусированы, сделайте снимок.
11. После захвата изображений в необходимых каналах (GFP и RFP) выберите Наложение , чтобы наблюдать за объединенным изображением и убедиться, что слайд не двигался во время съемки. Если каналы не перекрываются, повторяйте нужный канал до тех пор, пока изображения не выровняются.
12. Сохраните изображение, нажав на иконку флешки . Перейдите в другое место на покровном листе, чтобы продолжить съемку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что каждый раз визуализируется новая область покровного стекла, чтобы избежать повторного захвата одной и той же области. Рекомендуется начинать съемку с верхнего левого угла покровного стекла и двигаться по S-образной схеме, чтобы обеспечить полное покрытие без дублирования.

7. Анализ данных

1. Данные, полученные с помощью этого метода, являются визуальными. Изучите изображения на наличие признаков утечки ДНК или ядерного блекбинга. Примеры блеббинга и утечки показаны в разделе репрезентативных результатов.

Результаты

В этом исследовании представлен метод ПЧ для визуализации ядерной пластинки в сочетании с двухцепочечной ДНК (дцДНК). После проведения ПЧ полученные изображения могут быть исследованы на наличие признаков ядерного блеббинга и утечки ДНК.

Обсуждение

Представленный протокол содержит несколько критических этапов, наиболее важным из которых является лечение фиксированных клеток первичными и вторичными антителами. Обеспечение использования первичного антитела хорошего качества против исследуемой мишени с прави...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 mm Square Glass Coverslips	Propper Manufacturing Company	M8710	Any size or shape can be used as long as they can be fixed to a standard microscope slide.
36.5% Formaldehyde	Sigma Aldrich	F8775	Fixation Reagent.
75 cm 2 Flasks	Corning	430725U	For cell culture.
Bovine Serum Albinum (BSA)	Fisher Scientific	9048-46-8	Antibody dilution buffer.
DMEM with 1 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-014-CV	For cell culture.
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2701	For dehydration of samples before mounting, diluted to make multiple concentrations.
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope	Fisher Scientific	12-563-460	Imaging.
Fish Gelatin	Sigma Aldrich	G7041	Antibody dilution buffer.
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Mounting medium to prevent photobleaching.
Parafilm (4 in)	Fisher Scientific	13-374-12	Any size can be substituted, as long as the coverslips being used can fit.
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15-140-122	For cell culture.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	N/A	N/A	Made and sterilized in the lab for tissue culture and solutions.
Premium Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	For cell culture.
Superfrost Premium Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7	Any standard microscope slides can be used.
Tissue Culture Treated 6-well Flat Bottom Plates	Falcon	353046	For cell culture.
TritonX-100	Thermofisher Scientific	A16046.AP	For washing.
Trypsin-EDTA (0.5%)	Gibco	15-400-054	For cell culture.
Tween 20	Fisher Scientific	9005-64-5	Cell Permeation reagent.