使用超声定位显微镜对大鼠脑微血管系统进行二维超分辨率可视化

摘要

在这里，我们描述了一种超声定位显微镜 （ULM） 协议，该协议实现了 12.5 μm 的空间分辨率，可以对大鼠的脑微血管系统进行成像。它能够详细地可视化血流方向和速度，为推进脑循环和血管疾病的研究提供了强大的工具。

摘要

脑微血管系统形成一个复杂的血管网络，对维持大脑功能至关重要。中风、阿尔茨海默病、神经胶质瘤和血管性痴呆等疾病会严重破坏微血管系统。不幸的是，目前的医学成像模式仅提供这种规模的间接观察。受光学显微镜的启发，超声定位显微镜 （ULM） 克服了穿透深度和空间分辨率之间的经典权衡。通过以亚波长精度定位和跟踪单个注射的微泡 （MB），可以生成微米级的血管和速度图。在这里，我们提出了一种强大的协议，用于使用商业超声平台对大鼠 体内 的脑微血管系统进行超分辨率成像。这种方法实现了 12.5 μm 的空间分辨率，重建了微血管结构并提供了有关血流方向和速度的详细信息，大大增强了我们对脑微循环的理解。该方案可以扩展到大鼠疾病模型，为神经血管疾病的早期诊断和治疗提供了强大的工具。

引言

脑微血管系统由毛细血管、小动脉和小静脉组成，通过促进营养输送、氧气交换和废物清除，对维持大脑功能至关重要 ^1,2。该网络的破坏与神经系统疾病有关，例如中风³、阿尔茨海默病⁴、神经胶质瘤⁵ 和血管性痴呆⁶，导致大脑生理学受损。微血管变化经常在临床症状出现之前出现，使其成为诊断和治疗干预的关键目标 ^7,8。全面了解结构和功能水平的血管改变是推进研究和治疗策略的关键。

然而，由于脑微血管系统体积小且部分位于大脑内较深的位置，因此对脑微血管系统进行成像特别具有挑战性。磁共振成像 （MRI）⁹ 和计算机断层扫描 （CT）¹⁰ 等传统成像方式虽然足以捕捉大规模血管变化，但提供的空间分辨率 （~100 μm） 对于小血管的可视化来说太粗糙了。双光子显微镜¹¹ 等光学方法为单个毛细管成像提供了出色的空间分辨率（低至 1 μm），但受到视野和穿透深度（小于 1 mm）的阻碍，限制了它们对大脑深部区域进行成像的能力。作为一种基于超声的技术，Doppler¹² 虽然提供实时血流评估，但仍然受到 50-200 μm 分辨率的限制，不足以获得微血管细节。总体而言，目前没有一种方法可以满足脑微血管成像所需的高空间分辨率和足够的脑渗透率的双重要求。

受光学显微镜^13,14 的启发，超声定位显微镜 （ULM） 通过定位单个注入的微气泡 （MB） 并以亚波长分辨率跟踪其位移，实现微米级精细结构的可视化¹⁵。它绕过了超声成像中穿透力和分辨率之间的经典折衷^{方案 16}。本研究详细介绍了一种在活大鼠模型中实施 ULM 的稳健方案，从而通过市售超声平台实现脑微血管系统的超分辨率成像。该协议不仅提供了微血管结构的全面重建，而且还提供了有关血流方向和速度的详细信息，这是传统成像技术无法实现的。尽管该方案已在正常大鼠中得到验证，但它可扩展到大鼠疾病模型，为不同病理条件下的定制研究提供了可能性。

研究方案

本工作中进行的所有动物实验均经复旦大学伦理委员会批准（批准号：2022JS-004）。该协议严格遵循复旦大学的动物护理指南，以确保对动物的人道待遇。在实验开始之前，必须允许大鼠有 1 周的环境适应期，在此期间为它们提供足够的饲料和水。光周期根据它们的生物节律受到仔细调节，以确保维持正常的生理状态。在实验结束时，使用过量的吸入异氟醚进行安乐死。

注意：实验设置如图 1A-H 所示。

1. 用于 ULM 成像的动物准备

1. 麻醉
   1. 通过以 3 L/min 的流速施用 3.5% 异氟醚和 100% 氧气的混合物在大鼠中诱导麻醉。大约 4 分钟后，将动物从腔室中取出，并将其俯卧在预热至 37 °C 的成像平台上。 通过在大鼠后肢的坚硬脚趾捏住时没有撤退反射来确认麻醉深度。
   2. 将大鼠的鼻子放在连接到麻醉系统的呼吸面罩中。以 1.5 L/min 的流速施用 1.5% 异氟醚和 100% 氧气的混合物，保持稳定的镇静。
      注意：麻醉方法和剂量严格遵循制造商的指南。
2. 术前动物准备
   1. 将大鼠的上切牙固定在门牙杆的凹槽中，将下颌置于门牙杆下方。使用耳杆将大鼠的头部放置在略微前方和耳道上方的骨凹处（可以用手触及），确保整个颅面保持水平（图 1A）。
   2. 通过对头部的不同部位施加少量压力，轻轻探查固定的稳定性。确保没有移动或从原始位置滑落。
   3. 微调成像平台的高度，通过升高或降低门牙条缺口来精心调整大鼠头部的角度，以确保呼吸畅通。
   4. 将红霉素软膏或 30% 甘油溶液涂抹在大鼠的眼睛上，以防止长时间暴露在手术灯下造成伤害，并在麻醉下保持眼睛湿润。此外，使用圆尖镊子轻轻将大鼠的舌头拉到口腔的一侧，以防止手术过程中窒息。
   5. 使用手持式电动剪刀，逆着毛发生长的方向（从后到前）剃掉大鼠的头部，通常是在耳朵之间，从眼睛到脖子的起点（图 1B）。用 1% 碘溶液清洁剃须区域，为手术切口做准备。
3. 大鼠开颅手术
   1. 沿着大鼠颅骨的矢状缝线切开，从枕骨后面开始，向前延伸约 4 厘米。使用止血钳收缩两侧的皮肤（图 1C）。或者，完全切除颅骨上方的皮肤以提供更大的手术通路，但这可能会增加感染的风险。
   2. 用小剪刀从颅骨上去除骨膜，完全露出坚硬的骨层。
   3. 使用配备有球形钻头的手持式微型颅钻进行开颅手术（图 1D）。从粗钻头（直径 2.5 毫米）开始，轻轻敲击以研磨骨头，一次应用钻头 2-3 秒。从中央区域开始，然后向两侧较厚的区域前进。
      注意：开颅手术期间出血过多会影响血液循环，导致皮质区域缺乏血管重建（图 1H）。
   4. 每 2-3 秒暂停一次以防止过热，每 2 分钟，使用注射器向钻孔区域注入大约 1 mL 的 0.9% NaCl 以冷却并冲洗掉碎屑。
   5. 一旦白色骨组织不再始终连接，请改用更细的钻头（直径 1 毫米）。继续钻孔，直到中央主要血管清晰可见为深棕色，周围区域呈粉红色，微血管可见为略带红色（图 1F）。
      注意：最终开颅手术范围是从前囟 +3 毫米到前后 Lambda，沿颅骨中线每侧 7 毫米（图 1E）。完成手术后，让大鼠休息约 10 分钟，以确保生理状况相对稳定，然后再开始数据收集。

2. 数据收集前设置

1. 造影剂制备和注射
   1. 根据官方指南，将造影剂（一个小瓶含有 59 mg SF₆ 气体和 25 mg 冻干粉）溶解在 5 mL 0.9% NaCl 中。剧烈摇晃混合物以形成 MB 悬浮液。悬浮液中 SF₆ 的最终浓度为 8 μL/mL。
   2. 将 0.8 mL MB 悬浮液吸入 1 mL 注射器中，并将其固定到编程为 100 μL/min 输注的显微注射泵上。
   3. 将带有导管的 26 G 留置针插入大鼠的尾静脉（图 1G）。
2. 选择成像平面
   1. 将中心频率为 15.625 MHz 的探头安装在脑立体定位仪的机械臂上，配备夹子（移动范围：垂直、水平和前后可达 80 毫米;读数精度：0.1 毫米）。
   2. 将超声探头直接放置在暴露的大鼠大脑上方。将偶联凝胶涂抹在裸露的大脑表面，以确保最佳信号传输。
   3. 打开软件的主界面，该界面将大鼠脑图谱与运动控制程序集成在一起。
   4. 将 Pregma 点设置为原点。软件界面可实时显示探针的轨迹和相应的大鼠脑切片位置。选择目标成像平面;例如，前囟 -1 mm。

3. 数据收集 （Timing ~ 20 min）

注意：Verasonics（超声系统）提供用于 Vantage 系统的原始 MATLAB 脚本，尚未修改。

1. 软件启动
   1. 启动 MATLAB 2021a 软件。
   2. 在 MATLAB 2021a 中输入数据采集脚本。
   3. 在根目录中，在命令行窗口中键入 activate 以激活运行时环境。
2. 参数配置和 RF 信号采集
   1. 将数据收集开始和结束深度分别设置为 5 和 120 个波长，以有效捕获感兴趣区域。
      注意：应根据成像平面和所研究的特定动物进行调整。
   2. 以 2.5° 为增量，将平面波透射转向角设置为 -5° 到 5°，以提高图像分辨率和对比度。
      注意：根据特定的成像要求和目标特性调整这些设置。
   3. 将发射电压设置为 20 V，以确保感兴趣区域具有足够的穿透力和最佳信噪比。
   4. 单击 Run 按钮开始数据收集，并将射频 （RF） 信号保存为 .mat 文件格式。
      注意：启动显微注射泵后 30 秒开始数据收集，以确保大鼠体内 MB 分布均匀稳定。

4. 数据处理和分析 （Timing ~ 8 h）

1. 数据处理
   1. 将射频数据导入 MATLAB 2021a 并解调以生成同相和正交 （I/Q） 数据（参见 材料表）。
   2. 单击 Run 按钮，利用 Delay-and-Sum （DAS） 算法对 I/Q 数据进行波束成形（参见 材料表）。
      注意：复合后帧速率为 800 Hz，总共 120,000 帧。
2. ULM 成像
   1. 将奇异值分解 （SVD） 时空过滤算法¹⁷ 应用于 IQ 数据，以消除背景噪声和杂波。每 800 帧存储为一个数据块，SVD 阈值设置为 [15， 800]。
   2. 使用高斯拟合算法¹⁸ 找到每个 MB 的中心。
   3. 利用 Kuhn-Munkres 算法根据 MB 的位置跟踪连续帧中的 MB 轨迹（请参阅 材料表）。
   4. 将 MB 轨迹映射到 8 倍上采样网格上，使用热颜色图显示 MB 轨迹的数量，使用射流颜色图通过映射微血管系统内每个位置的计算速度来编码流速。
   5. 应用自定义配色方案来区分向上和向下的流动方向，从而获得高分辨率图像以增强可视化效果。
   6. 将原始 MB 轨迹随机分成两组以创建两个子图像，对每个子图像执行傅里叶变换，并计算傅里叶环相关 （FRC） 作为其光谱的归一化相关性。将分辨率定义为 FRC 低于阈值¹⁹ 的空间频率的倒数。

结果

图 1 说明了大鼠 体内 脑微血管 ULM 成像的详细设置，每个元件都经过精心设计，以最大限度地减少实验变异性并确保准确的数据采集以获得可靠的超分辨率成像结果。

图 2A 显示了大鼠大脑中微血管系统的 ULM 重建结构，位于距前囟点 -1 毫米处，成像深度接近 12 毫米。整个成像平面的有效切片厚度?...

讨论

该协议成功地利用 ULM 对体内大鼠脑微血管系统进行超分辨率成像。与其他成像模式相比，ULM 同时适应空间分辨率和穿透深度。暴露的大鼠大脑是成像的，而不是通过颅骨成像的，避免了骨骼存在引起的衰减和变形。在中心频率为 15.625 MHz 的换能器下，捕获了深度约为 12 mm 的血管结构，空间分辨率高达 12.5 μm。血流方向促进了小动脉和静脉特定区域的分化。此外，该技?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol	DICHANG	https://www.dehsm.com/goods-17187.html	75%
Beamforming program	Institute of Biomedical Engineering at the University of Montreal	Matlab Ultrasound Toolbox 3.4 version
Body temperature maintenance device	RWD Life Science Co., Ltd.	69026
Brain stereotaxic instrument	RWD Life Science Co., Ltd.	71000-R	Adaptable to breathing mask
Cranial Microinjection Surgical Instrument Kit	RWD Life Science Co., Ltd.	SP0005-R
Digital microscope	RWD Life Science Co., Ltd.	DOM-1001
Drug delivery catheter	RWD Life Science Co., Ltd.	https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/administration/draw-blood
Erythromycin ointment	Renhe Pharma	H36020018	1% x 15 g
Gas anesthesia machine	RWD Life Science Co., Ltd.	R500IE	Includes breathing mask
Handheld electric clipper	GUAZHOUMU	MJD-DTJ02
Handheld mini cranial drill	RWD Life Science Co., Ltd.	78001
Indwelling needle	Kindly EnterpriseDevelopment Group Co., LTD	Positive Pressure Model	26 G
Iodine solution	HYNAUT	https://www.hainuocn.com/index/detail/524.html	4.5–5.5 g/L
IQ demodulation program	Institute of Biomedical Engineering at the University of Montreal	Matlab Ultrasound Toolbox 3.4 version
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	R510-22-10
MATLAB software	MathWorks	Version R2021a
Microinjection pump	RWD Life Science Co., Ltd.	R462
Sodium chloride injection	SHENG'AO animals pharmaceutical Co., Ltd.	270071460	0.90%
SonoVue	Bracco	https://www.bracco.com/en-se/product/sonovue
Spherical drill bit	RWD Life Science Co., Ltd.	HM1027/HM1010
Supporting Positioning Software	RWD Life Science Co., Ltd.	V2.0.0.30400
Syringe	Kindly EnterpriseDevelopment Group Co., Ltd.	RWLB	1 mL
Tracking program	Jean-Yves Tinevez	2016 version
Ultrasound gel	Junkang Medical Equipment Co., Ltd.	Model DS-1
Ultrasound probe	VERASONICS, INC.	L22-14vX LF
Verasonics Ultrasound System	VERASONICS, INC.	Vantage-256	ultrasound platform