Visualizzazione bidimensionale a super-risoluzione della microvascolarizzazione del cervello di ratto mediante microscopia di localizzazione ecografica

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo per la microscopia di localizzazione ecografica (ULM), che raggiunge una risoluzione spaziale di 12,5 μm per visualizzare la microvascolarizzazione cerebrale nei ratti. Consente la visualizzazione dettagliata della direzione e della velocità del flusso sanguigno, offrendo un potente strumento per far progredire gli studi sulla circolazione cerebrale e sui disturbi vascolari.

Abstract

La microvascolarizzazione cerebrale forma una complessa rete di vasi essenziali per il mantenimento della funzione cerebrale. Malattie come l'ictus, il morbo di Alzheimer, i gliomi e la demenza vascolare possono interrompere profondamente il sistema microvascolare. Sfortunatamente, le attuali modalità di imaging medico offrono solo osservazioni indirette su questa scala. Ispirata alla microscopia ottica, la microscopia di localizzazione a ultrasuoni (ULM) supera il classico compromesso tra profondità di penetrazione e risoluzione spaziale. Localizzando e tracciando le singole microbolle iniettate (MB) con precisione inferiore alla lunghezza d'onda, è possibile generare mappe vascolari e di velocità su scala micrometrica. Qui, presentiamo un robusto protocollo per l'imaging a super-risoluzione della microvascolarizzazione cerebrale in vivo nei ratti utilizzando una piattaforma ecografica commerciale. Questo metodo raggiunge una risoluzione spaziale di 12,5 μm, ricostruendo l'architettura microvascolare e fornendo informazioni dettagliate sulla direzione e la velocità del flusso sanguigno, migliorando notevolmente la nostra comprensione della microcircolazione cerebrale. Il protocollo può essere esteso ai modelli di malattia del ratto, offrendo un potente strumento per la diagnosi precoce e il trattamento delle malattie neurovascolari.

Introduzione

La microvascolarizzazione cerebrale, che comprende capillari, arteriole e venule, è essenziale per il mantenimento della funzione cerebrale facilitando l'apporto di nutrienti, lo scambio di ossigeno e la rimozione dei rifiuti ^1,2. Le interruzioni in questa rete sono implicate in disturbi neurologici come l'ictus³, il morbo di Alzheimer⁴, i gliomi⁵ e la demenza vascolare⁶, portando a menomazioni nella fisiologia del cervello. Le alterazioni microvascolari precedono frequentemente l'insorgenza dei sintomi clinici, rendendole un bersaglio critico per gli interventi diagnostici e terapeutici ^7,8. Una comprensione completa delle alterazioni vascolari sia a livello strutturale che funzionale è fondamentale per far progredire la ricerca e le strategie di trattamento.

Tuttavia, l'imaging della microvascolarizzazione cerebrale è particolarmente impegnativo a causa delle dimensioni ridotte e della posizione parzialmente profonda all'interno del cervello. Le modalità di imaging convenzionali come la risonanza magnetica (MRI)⁹ e la tomografia computerizzata (CT)¹⁰, sebbene adeguate per catturare i cambiamenti vascolari su larga scala, offrono una risoluzione spaziale (~100 μm) troppo grossolana per la visualizzazione di piccoli vasi. I metodi ottici come la microscopia a due fotoni¹¹ forniscono un'eccellente risoluzione spaziale (fino a 1 μm) per l'imaging dei singoli capillari, ma sono ostacolati da un campo visivo limitato e da una profondità di penetrazione (inferiore a 1 mm), limitando la loro capacità di visualizzare le regioni cerebrali profonde. Come tecnica basata sugli ultrasuoni, il Doppler¹², pur offrendo una valutazione del flusso sanguigno in tempo reale, rimane vincolato da una risoluzione di 50-200 μm, insufficiente per i dettagli microvascolari. Nel complesso, nessun singolo metodo soddisfa attualmente il duplice requisito di un'elevata risoluzione spaziale e di una sufficiente penetrazione cerebrale necessaria per l'imaging della microvascolarizzazione cerebrale.

Ispirata alla microscopia ottica^13,14, la microscopia di localizzazione ultrasonica (ULM) consente la visualizzazione di strutture fini su scala micron localizzando le singole microbolle iniettate (MB) e tracciando il loro spostamento con una risoluzione inferiore alla lunghezza d'onda¹⁵. Aggira il classico compromesso tra penetrazione e risoluzione nell'imaging ecografico¹⁶. Questo studio descrive in dettaglio un protocollo robusto per l'implementazione dell'ULM in un modello di ratto vivente e quindi per consentire l'imaging a super-risoluzione della microvascolarizzazione cerebrale attraverso la piattaforma ecografica disponibile in commercio. Il protocollo non solo fornisce una ricostruzione completa della struttura microvascolare, ma fornisce anche informazioni dettagliate sulla direzione e la velocità del flusso sanguigno, cosa che non è possibile con le tecniche di imaging convenzionali. Sebbene il protocollo sia stato convalidato in ratti normali, è estendibile a modelli di malattia del ratto, offrendo possibilità di studi personalizzati in diverse condizioni patologiche.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali eseguiti in questo lavoro sono approvati dal Comitato Etico dell'Università di Fudan (Numero di approvazione: 2022JS-004). Il protocollo segue rigorosamente le linee guida per la cura degli animali dell'Università Fudan per garantire il trattamento umano degli animali. Prima dell'inizio della sperimentazione, ai ratti deve essere concesso un periodo di 1 settimana per l'acclimatazione ambientale, durante il quale viene fornita loro alimentazione e acqua sufficienti. Il fotoperiodo viene attentamente regolato in base ai loro ritmi biologici per garantire il mantenimento di normali stati fisiologici. Al termine dell'esperimento, l'eutanasia viene eseguita utilizzando un sovradosaggio di isoflurano per via inalatoria.

NOTA: La configurazione sperimentale è mostrata nella Figura 1A-H.

1. Preparazione degli animali per l'imaging ULM

1. Anestesia
   1. Indurre l'anestesia nel ratto somministrando una miscela di isoflurano al 3,5% e ossigeno al 100% a una velocità di flusso di 3 L/min. Dopo circa 4 minuti, rimuovere l'animale dalla camera e posizionarlo prono su una piattaforma di imaging preriscaldata a 37 °C. Confermare la profondità dell'anestesia con l'assenza di un riflesso di ritiro sul fermo pizzicamento dell'arto posteriore del ratto.
   2. Posizionare il naso del ratto in una maschera respiratoria collegata al sistema di anestesia. Mantenere una sedazione stabile somministrando una miscela di isoflurano all'1,5% e ossigeno al 100% a una velocità di flusso di 1,5 L/min.
      NOTA: I metodi e i dosaggi dell'anestesia seguono rigorosamente le linee guida del produttore.
2. Preparazione pre-chirurgica degli animali
   1. Fissare gli incisivi superiori del ratto nella tacca della barra incisiva, posizionando la mascella inferiore sotto la barra. Utilizzare le barre auricolari per stabilizzare la testa del ratto posizionandole nella rientranza ossea leggermente anteriore e superiore al condotto uditivo (palpabile a mano), assicurandosi che l'intera superficie cranica rimanga orizzontale (Figura 1A).
   2. Sondare delicatamente la stabilità della fissazione applicando una piccola quantità di pressione su diverse parti della testa. Assicurarsi che non vi siano movimenti o scivolamenti dalla posizione originale.
   3. Regola con precisione l'altezza della piattaforma di imaging e regola meticolosamente l'angolo della testa del ratto alzando o abbassando la tacca della barra incisiva per garantire una respirazione senza ostacoli.
   4. Applicare unguento all'eritromicina o una soluzione di glicerina al 30% sugli occhi del ratto per prevenire danni dovuti all'esposizione prolungata alle luci chirurgiche e per mantenere gli occhi umidi sotto anestesia. Inoltre, usa una pinzetta a punta tonda per tirare delicatamente la lingua del ratto su un lato della bocca per prevenire l'asfissia durante l'intervento chirurgico.
   5. Utilizzare un tagliacapelli elettrico portatile e radere la testa del ratto contro la direzione di crescita dei peli (da dietro in avanti), tipicamente tra le orecchie, dagli occhi all'inizio del collo (Figura 1B). Pulire l'area rasata con una soluzione di iodio all'1% per prepararsi all'incisione chirurgica.
3. Craniotomia di ratto
   1. Praticare un'incisione lungo la sutura sagittale del cranio del ratto, partendo da appena dietro l'osso occipitale ed estendendosi di circa 4 cm anteriormente. Utilizzare gli emostatici per ritrarre la pelle su entrambi i lati (Figura 1C). Facoltativamente, asportare completamente la pelle sopra il cranio per fornire un maggiore accesso chirurgico, ma ciò può aumentare il rischio di infezione.
   2. Usa piccole forbici per rimuovere il periostio dal cranio, esponendo completamente lo strato di osso duro.
   3. Eseguire la craniotomia utilizzando un mini trapano cranico portatile dotato di una punta sferica (Figura 1D). Iniziare con una punta grossolana (2,5 mm di diametro) e picchiettare delicatamente per abradere l'osso, applicando il trapano per 2-3 secondi alla volta. Inizia dalla zona centrale e procedi verso le zone più spesse sui lati.
      NOTA: Un sanguinamento eccessivo durante la craniotomia influisce sulla circolazione sanguigna, con conseguente mancanza di ricostruzione vascolare nelle aree corticali (Figura 1H).
   4. Mettere in pausa ogni 2-3 s per evitare il surriscaldamento e, ogni 2 minuti, iniettare circa 1 mL di NaCl allo 0,9% nell'area di perforazione utilizzando una siringa per raffreddare e sciacquare via i detriti.
   5. Una volta che il tessuto osseo bianco non appare più collegato in modo coerente, passare a una punta più fine (1 mm di diametro). Continuare a perforare fino a quando i vasi sanguigni principali centrali sono chiaramente visibili in marrone scuro e l'area circostante appare rosa, con microvasi visibili leggermente rossastri (Figura 1F).
      NOTA: L'intervallo finale della craniotomia va da Bregma +3 mm a Lambda antero-posteriore e 7 mm su ciascun lato lungo la linea mediana del cranio (Figura 1E). Dopo aver completato l'intervento chirurgico, lasciare riposare il ratto per circa 10 minuti per garantire condizioni fisiologiche relativamente stabili prima di iniziare la raccolta dei dati.

2. Configurazione prima della raccolta dei dati

1. Preparazione e iniezione del mezzo di contrasto
   1. Sciogliere il mezzo di contrasto (un flaconcino contenente 59 mg di gas SF₆ e 25 mg di polvere liofilizzata), secondo le linee guida ufficiali, in 5 ml di NaCl allo 0,9%. Agitare energicamente il composto fino a formare una sospensione MB. La concentrazione finale di SF₆ nella sospensione è di 8 μL/mL.
   2. Aspirare 0,8 mL della sospensione MB in una siringa da 1 mL e fissarla a una pompa di microiniezione programmata per l'infusione a 100 μL/min.
   3. Inserire un ago a permanenza da 26 G con un catetere inserito nella vena caudale del ratto (Figura 1G).
2. Selezione del piano di imaging
   1. Montare una sonda con frequenza centrale di 15,625 MHz sul braccio manipolatore dello strumento stereotassico cerebrale, dotato di morsetto (campo di movimento: verticale, orizzontale e antero-posteriore fino a 80 mm; precisione di lettura: 0,1 mm).
   2. Posizionare la sonda ecografica direttamente sopra il cervello di ratto esposto. Applicare il gel di accoppiamento sulla superficie cerebrale esposta per garantire una trasmissione ottimale del segnale.
   3. Apri l'interfaccia principale del software, che integra un atlante del cervello di ratto con i programmi di controllo del movimento del motore.
   4. Impostate il punto Bregma come origine. L'interfaccia software fornisce una visualizzazione in tempo reale della traiettoria della sonda e della corrispondente posizione della fetta di cervello di ratto. Selezionare il piano di imaging di destinazione; ad esempio, Bregma -1 mm.

3. Raccolta dati (Timing ~ 20 min)

NOTA: Verasonics (sistema a ultrasuoni) fornisce gli script MATLAB originali da utilizzare con il sistema Vantage e non è stato modificato.

1. Avvio del software
   1. Avvia il software MATLAB 2021a.
   2. Inserisci lo script di acquisizione dati in MATLAB 2021a.
   3. Nella directory principale, digitare activate nella finestra della riga di comando per attivare l'ambiente di runtime.
2. Configurazione dei parametri e acquisizione dei segnali RF
   1. Imposta le profondità di inizio e fine della raccolta dei dati rispettivamente a 5 e 120 lunghezze d'onda, per catturare efficacemente la regione di interesse.
      NOTA: Le regolazioni devono essere effettuate in base al piano di imaging e all'animale specifico da studiare.
   2. Imposta gli angoli di sterzata della trasmissione dell'onda piana da -5° a 5° con incrementi di 2,5° per migliorare la risoluzione e il contrasto dell'immagine.
      NOTA: Regolare queste impostazioni in base ai requisiti di imaging specifici e alle caratteristiche del target.
   3. Impostare la tensione di trasmissione su 20 V per garantire un'adeguata penetrazione e un rapporto segnale/rumore ottimale per la regione di interesse.
   4. Fare clic sul pulsante Esegui per avviare la raccolta dei dati e salvare i segnali a radiofrequenza (RF) in formato file .mat.
      NOTA: Iniziare la raccolta dei dati 30 secondi dopo l'avvio della pompa di microiniezione per garantire una distribuzione uniforme e stabile dei MB all'interno del corpo del ratto.

4. Elaborazione e analisi dei dati (Timing ~ 8 h)

1. Elaborazione dati
   1. Importa i dati RF in MATLAB 2021a e demodulali per generare dati in fase e in quadratura (I/Q) (vedi Tabella dei materiali).
   2. Fare clic sul pulsante Esegui per utilizzare l'algoritmo DAS (Delay-and-Sum) per il beamforming sui dati I/Q (vedere la Tabella dei materiali).
      NOTA: frame rate post-compounding di 800 Hz, per un totale di 120.000 fotogrammi.
2. Imaging ULM
   1. Applica l'algoritmo di filtraggio spazio-temporale SVD (Singular Value Decomposition)¹⁷ ai dati IQ per rimuovere il rumore di fondo e il disordine. Ogni 800 fotogrammi viene memorizzato come blocco di dati e la soglia SVD è impostata su [15, 800].
   2. Individua il centro di ogni MB utilizzando l'algoritmo di adattamento gaussiano¹⁸.
   3. Utilizza l'algoritmo di Kuhn-Munkres per tracciare le traiettorie MB attraverso fotogrammi consecutivi in base alle loro posizioni (vedi Tabella dei materiali).
   4. Mappa le traiettorie MB su una griglia sovracampionata 8x, utilizzando una mappa a colori caldi per visualizzare il numero di traiettorie MB e una mappa a colori a getto per codificare la velocità del flusso mappando la velocità calcolata in ogni posizione all'interno della microvascolarizzazione.
   5. Applica una combinazione di colori personalizzata per distinguere le direzioni del flusso verso l'alto e verso il basso, ottenendo immagini ad alta risoluzione per una migliore visualizzazione.
   6. Dividi casualmente le traiettorie MB originali in due gruppi per creare due sottoimmagini, esegui una trasformata di Fourier su ciascuna e calcola la correlazione dell'anello di Fourier (FRC) come correlazione normalizzata dei loro spettri. Definisci la risoluzione come l'inverso della frequenza spaziale in cui l'FRC scende al di sotto della soglia¹⁹.

Risultati

La Figura 1 illustra la configurazione dettagliata per l'imaging ULM microvascolare cerebrale in vivo nei ratti, con ogni elemento accuratamente progettato per ridurre al minimo la variabilità sperimentale e garantire un'acquisizione accurata dei dati per risultati di imaging affidabili a super-risoluzione.

La Figura 2A mostra la struttura ricostruita ULM della microvascolarizzazione nel cer...

Discussione

Questo protocollo ha utilizzato con successo l'ULM per eseguire l'imaging a super-risoluzione della microvascolarizzazione cerebrale di ratto in vivo. Rispetto ad altre modalità di imaging, l'ULM si adatta contemporaneamente sia alla risoluzione spaziale che alla profondità di penetrazione. Il cervello di ratto esposto è stato ripreso piuttosto che attraverso il cranio, evitando l'attenuazione e la distorsione causate dalla presenza di osso. Sotto un trasduttore con una frequenza cent...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol	DICHANG	https://www.dehsm.com/goods-17187.html	75%
Beamforming program	Institute of Biomedical Engineering at the University of Montreal	Matlab Ultrasound Toolbox 3.4 version
Body temperature maintenance device	RWD Life Science Co., Ltd.	69026
Brain stereotaxic instrument	RWD Life Science Co., Ltd.	71000-R	Adaptable to breathing mask
Cranial Microinjection Surgical Instrument Kit	RWD Life Science Co., Ltd.	SP0005-R
Digital microscope	RWD Life Science Co., Ltd.	DOM-1001
Drug delivery catheter	RWD Life Science Co., Ltd.	https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/administration/draw-blood
Erythromycin ointment	Renhe Pharma	H36020018	1% x 15 g
Gas anesthesia machine	RWD Life Science Co., Ltd.	R500IE	Includes breathing mask
Handheld electric clipper	GUAZHOUMU	MJD-DTJ02
Handheld mini cranial drill	RWD Life Science Co., Ltd.	78001
Indwelling needle	Kindly EnterpriseDevelopment Group Co., LTD	Positive Pressure Model	26 G
Iodine solution	HYNAUT	https://www.hainuocn.com/index/detail/524.html	4.5–5.5 g/L
IQ demodulation program	Institute of Biomedical Engineering at the University of Montreal	Matlab Ultrasound Toolbox 3.4 version
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	R510-22-10
MATLAB software	MathWorks	Version R2021a
Microinjection pump	RWD Life Science Co., Ltd.	R462
Sodium chloride injection	SHENG'AO animals pharmaceutical Co., Ltd.	270071460	0.90%
SonoVue	Bracco	https://www.bracco.com/en-se/product/sonovue
Spherical drill bit	RWD Life Science Co., Ltd.	HM1027/HM1010
Supporting Positioning Software	RWD Life Science Co., Ltd.	V2.0.0.30400
Syringe	Kindly EnterpriseDevelopment Group Co., Ltd.	RWLB	1 mL
Tracking program	Jean-Yves Tinevez	2016 version
Ultrasound gel	Junkang Medical Equipment Co., Ltd.	Model DS-1
Ultrasound probe	VERASONICS, INC.	L22-14vX LF
Verasonics Ultrasound System	VERASONICS, INC.	Vantage-256	ultrasound platform