Visualização bidimensional de super-resolução da microvasculatura cerebral de ratos usando microscopia de localização por ultrassom

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para microscopia de localização por ultrassom (ULM), que atinge resolução espacial de 12,5 μm para obter imagens da microvasculatura cerebral em ratos. Ele permite a visualização detalhada da direção e velocidade do fluxo sanguíneo, oferecendo uma ferramenta poderosa para o avanço dos estudos da circulação cerebral e distúrbios vasculares.

Resumo

A microvasculatura cerebral forma uma rede complexa de vasos essenciais para manter a função cerebral. Doenças como acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer, gliomas e demência vascular podem perturbar profundamente o sistema microvascular. Infelizmente, as modalidades atuais de imagens médicas oferecem apenas observações indiretas nessa escala. Inspirada na microscopia óptica, a microscopia de localização por ultrassom (ULM) supera o trade-off clássico entre profundidade de penetração e resolução espacial. Ao localizar e rastrear microbolhas injetadas individuais (MBs) com precisão de subcomprimento de onda, mapas vasculares e de velocidade podem ser gerados na escala micrométrica. Aqui, apresentamos um protocolo robusto para imagens de super-resolução da microvasculatura cerebral in vivo em ratos usando uma plataforma de ultrassom comercial. Este método atinge resolução espacial de 12,5 μm, reconstruindo a arquitetura microvascular e fornecendo informações detalhadas sobre a direção e velocidade do fluxo sanguíneo, melhorando muito nossa compreensão da microcirculação cerebral. O protocolo pode ser estendido a modelos de doenças de ratos, oferecendo uma ferramenta poderosa para o diagnóstico precoce e tratamento de doenças neurovasculares.

Introdução

A microvasculatura cerebral, composta por capilares, arteríolas e vênulas, é essencial para manter a função cerebral, facilitando o fornecimento de nutrientes, a troca de oxigênio e a remoção de resíduos ^1,2. Interrupções nessa rede estão implicadas em distúrbios neurológicos, como acidente vascular cerebral³, doença de Alzheimer⁴, gliomas⁵ e demência vascular⁶, levando a deficiências na fisiologia cerebral. As alterações microvasculares frequentemente precedem o início dos sintomas clínicos, tornando-as um alvo crítico para intervenções diagnósticas e terapêuticas ^7,8. Uma compreensão abrangente das alterações vasculares nos níveis estrutural e funcional é fundamental para o avanço das estratégias de pesquisa e tratamento.

No entanto, a imagem da microvasculatura cerebral é particularmente desafiadora devido ao tamanho pequeno e à localização parcialmente profunda dentro do cérebro. As modalidades convencionais de imagem, como ressonância magnética (RM)⁹ e tomografia computadorizada (TC)¹⁰, embora adequadas para capturar alterações vasculares em grande escala, oferecem uma resolução espacial (~100 μm) que é muito grosseira para visualizar pequenos vasos. Métodos ópticos como a microscopia de dois fótons¹¹ fornecem excelente resolução espacial (até 1 μm) para obter imagens de capilares individuais, mas são prejudicados pelo campo de visão limitado e profundidade de penetração (menos de 1 mm), restringindo sua capacidade de obter imagens de regiões cerebrais profundas. Como uma técnica baseada em ultrassom, o Doppler¹², embora ofereça avaliação do fluxo sanguíneo em tempo real, permanece limitado por uma resolução de 50-200 μm, insuficiente para detalhes microvasculares. No geral, nenhum método único atende atualmente ao duplo requisito de alta resolução espacial e penetração cerebral suficiente necessária para imagens de microvasculatura cerebral.

Inspirada na microscopia óptica ^13,14, a microscopia de localização ultrassônica (ULM) permite a visualização de estruturas finas na escala de mícrons, localizando microbolhas (MBs) injetadas individualmente e rastreando seu deslocamento com resolução de comprimento de onda¹⁵. Ele ignora o compromisso clássico entre penetração e resolução na imagem de ultrassom¹⁶. Este estudo detalha um protocolo robusto para implementar o ULM em um modelo de rato vivo e, assim, permitir imagens de super-resolução da microvasculatura cerebral por meio da plataforma de ultrassom disponível comercialmente. O protocolo não apenas fornece uma reconstrução abrangente da estrutura microvascular, mas também fornece informações detalhadas sobre a direção e a velocidade do fluxo sanguíneo, o que não é possível com as técnicas convencionais de imagem. Embora o protocolo tenha sido validado em ratos normais, ele é extensível a modelos de doenças em ratos, oferecendo possibilidades para estudos personalizados em diferentes condições patológicas.

Protocolo

Todos os experimentos em animais realizados neste trabalho são aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Fudan (Número de Aprovação: 2022JS-004). O protocolo segue rigorosamente as diretrizes de cuidados com os animais da Universidade de Fudan para garantir o tratamento humano dos animais. Antes do início experimental, os ratos devem ter um período de 1 semana para aclimatação ambiental, durante o qual recebem ração e água suficientes. O fotoperíodo é cuidadosamente regulado de acordo com seus ritmos biológicos para garantir a manutenção de estados fisiológicos normais. No final do experimento, a eutanásia é realizada com uma overdose de isoflurano inalado.

NOTA: A configuração experimental é mostrada na Figura 1A-H.

1. Preparação animal para imagens ULM

1. Anestesia
   1. Induza a anestesia no rato administrando uma mistura de isoflurano a 3,5% e oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 3 L / min. Após aproximadamente 4 min, retire o animal da câmara e coloque-o de bruços sobre uma plataforma de imagem pré-aquecida a 37 °C. Confirme a profundidade da anestesia pela ausência de um reflexo de retirada na pinça firme do dedo do pé do membro posterior do rato.
   2. Coloque o nariz do rato em uma máscara respiratória conectada ao sistema de anestesia. Mantenha uma sedação estável administrando uma mistura de 1,5% de isoflurano e 100% de oxigênio a uma taxa de fluxo de 1,5 L / min.
      NOTA: Os métodos e dosagens de anestesia seguem rigorosamente as diretrizes do fabricante.
2. Preparação pré-cirúrgica do animal
   1. Prenda os incisivos superiores do rato no entalhe da barra incisiva, posicionando a mandíbula inferior abaixo da barra. Use barras auriculares para estabilizar a cabeça do rato, posicionando-as na reentrância óssea ligeiramente anterior e superior ao canal auditivo (palpável com a mão), garantindo que toda a superfície craniana permaneça horizontal (Figura 1A).
   2. Sonde suavemente a estabilidade da fixação aplicando uma pequena quantidade de pressão em diferentes partes da cabeça. Certifique-se de que não haja movimento ou deslizamento da posição original.
   3. Ajuste a altura da plataforma de imagem e ajuste meticulosamente o ângulo da cabeça do rato levantando ou abaixando o entalhe da barra incisiva para garantir uma respiração desobstruída.
   4. Aplique pomada de eritromicina ou solução de glicerina a 30% nos olhos do rato para evitar danos causados pela exposição prolongada a luzes cirúrgicas e para manter os olhos úmidos sob anestesia. Além disso, use uma pinça de ponta redonda para puxar suavemente a língua do rato para um lado da boca para evitar asfixia durante a cirurgia.
   5. Use um aparador elétrico portátil e raspe a cabeça do rato na direção contrária ao crescimento do cabelo (de trás para a frente), geralmente entre as orelhas, dos olhos até o início do pescoço (Figura 1B). Limpe a área raspada com solução de iodo a 1% para se preparar para a incisão cirúrgica.
3. Craniotomia de rato
   1. Faça uma incisão ao longo da sutura sagital do crânio do rato, começando logo atrás do osso occipital e estendendo-se aproximadamente 4 cm anteriormente. Use hemostáticos para retrair a pele em ambos os lados (Figura 1C). Opcionalmente, excise totalmente a pele sobre o crânio para fornecer maior acesso cirúrgico, mas isso pode aumentar o risco de infecção.
   2. Use uma tesoura pequena para remover o periósteo do crânio, expondo totalmente a camada óssea dura.
   3. Realize a craniotomia usando uma mini broca craniana portátil equipada com uma broca esférica (Figura 1D). Comece com uma broca grossa (2,5 mm de diâmetro) e bata suavemente para lixar o osso, aplicando a broca por 2-3 s de cada vez. Comece na área central e progrida em direção às áreas mais grossas nas laterais.
      NOTA: O sangramento excessivo durante a craniotomia afeta a circulação sanguínea, resultando em falta de reconstrução vascular nas áreas corticais (Figura 1H).
   4. Faça uma pausa a cada 2-3 s para evitar superaquecimento e, a cada 2 minutos, injete aproximadamente 1 mL de NaCl a 0,9% na área de perfuração usando uma seringa para resfriar e enxaguar os detritos.
   5. Quando o tecido ósseo branco não parecer mais conectado de forma consistente, mude para uma broca mais fina (1 mm de diâmetro). Continue perfurando até que os principais vasos sanguíneos centrais sejam claramente visíveis como marrom escuro e a área circundante pareça rosa, com microvasos visíveis ligeiramente avermelhados (Figura 1F).
      NOTA: A faixa final de craniotomia é de Bregma +3 mm a Lambda ântero-posterior e 7 mm de cada lado ao longo da linha média do crânio (Figura 1E). Após a conclusão da cirurgia, deixe o rato descansar por aproximadamente 10 minutos para garantir condições fisiológicas relativamente estáveis antes de iniciar a coleta de dados.

2. Configuração antes da coleta de dados

1. Preparação e injeção do agente de contraste
   1. Dissolva o agente de contraste (um frasco contendo 59 mg de gás SF₆ e 25 mg de pó liofilizado), de acordo com as diretrizes oficiais, em 5 mL de NaCl a 0,9%. Agite vigorosamente a mistura para formar uma suspensão MB. A concentração final de SF₆ na suspensão é de 8 μL/mL.
   2. Retire 0,8 mL da suspensão MB em uma seringa de 1 mL e prenda-a a uma bomba de microinjeção programada para infundir a 100 μL / min.
   3. Insira uma agulha de demora de 26 G com um cateter conectado à veia da cauda do rato (Figura 1G).
2. Selecionando o plano de imagem
   1. Monte uma sonda com frequência central de 15,625 MHz no braço manipulador do instrumento estereotáxico cerebral, equipada com uma pinça (faixa de movimento: vertical, horizontal e ântero-posterior até 80 mm; precisão de leitura: 0,1 mm).
   2. Posicione a sonda de ultrassom diretamente acima do cérebro do rato exposto. Aplique gel de acoplamento na superfície cerebral exposta para garantir a transmissão ideal do sinal.
   3. Abra a interface principal do software, que integra um atlas do cérebro de ratos com programas de controle de movimento motor.
   4. Defina o ponto Bregma como a origem. A interface do software fornece uma exibição em tempo real da trajetória da sonda e a localização correspondente da fatia do cérebro do rato. Selecione o plano de imagem alvo; por exemplo, Bregma -1 mm.

3. Coleta de dados (tempo ~ 20 min)

NOTA: Verasonics (sistema de ultrassom) fornece os scripts MATLAB originais para uso com o sistema Vantage e não foi modificado.

1. Inicialização do software
   1. Inicie o software MATLAB 2021a.
   2. Insira o script de aquisição de dados no MATLAB 2021a.
   3. No diretório raiz, digite activate na janela da linha de comando para ativar o ambiente de tempo de execução.
2. Configuração de parâmetros e aquisição de sinais de RF
   1. Defina as profundidades inicial e final da coleta de dados em 5 e 120 comprimentos de onda, respectivamente, para capturar efetivamente a região de interesse.
      NOTA: Os ajustes devem ser feitos com base no plano de imagem e no animal específico que está sendo estudado.
   2. Defina os ângulos de direção da transmissão de ondas planas de -5° a 5° em incrementos de 2.5° para melhorar a resolução e o contraste da imagem.
      NOTA: Ajuste essas configurações com base nos requisitos específicos de imagem e nas características do alvo.
   3. Defina a tensão de transmissão para 20 V para garantir uma penetração adequada e uma relação sinal-ruído ideal para a região de interesse.
   4. Clique no botão Executar para iniciar a coleta de dados e salvar os sinais de radiofrequência (RF) no formato de arquivo .mat.
      NOTA: Comece a coleta de dados 30 s após iniciar a bomba de microinjeção para garantir uma distribuição uniforme e estável de MB no corpo do rato.

4. Processamento e análise de dados (Tempo ~ 8 h)

1. Processamento de dados
   1. Importe os dados de RF para o MATLAB 2021a e demodule-os para gerar dados em fase e quadratura (I/Q) (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Clique no botão Executar para utilizar o algoritmo Delay-and-Sum (DAS) para beamforming nos dados I/Q (consulte Tabela de materiais).
      NOTA: Taxa de quadros pós-composição de 800 Hz, com um total de 120.000 quadros.
2. Imagem ULM
   1. Aplique o algoritmo de filtragem espaço-temporal de Decomposição de Valor Singular (SVD)¹⁷ aos dados de QI para remover o ruído de fundo e a desordem. Cada 800 quadros é armazenado como um bloco de dados e o limite de SVD é definido como [15, 800].
   2. Localize o centro de cada MB usando o algoritmo de ajuste gaussiano¹⁸.
   3. Utilize o algoritmo de Kuhn-Munkres para rastrear trajetórias de MB em quadros consecutivos com base em suas posições (consulte a Tabela de Materiais).
   4. Mapeie as trajetórias de MB em uma grade com aumento de amostragem de 8x, usando um mapa de cores quente para exibir o número de trajetórias de MB e um mapa de cores de jato para codificar a velocidade do fluxo, mapeando a velocidade calculada em cada posição dentro da microvasculatura.
   5. Aplique um esquema de cores personalizado para distinguir as direções do fluxo para cima e para baixo, resultando em imagens de alta resolução para visualização aprimorada.
   6. Divida aleatoriamente as trajetórias MB originais em dois grupos para criar duas subimagens, execute uma transformada de Fourier em cada uma e calcule a Correlação do Anel de Fourier (FRC) como a correlação normalizada de seus espectros. Defina a resolução como o inverso da frequência espacial em que o FRC cai abaixo do limite¹⁹.

Resultados

A Figura 1 ilustra a configuração detalhada para imagens ULM microvasculares cerebrais in vivo em ratos, com cada elemento cuidadosamente projetado para minimizar a variabilidade experimental e garantir a aquisição de dados precisos para resultados confiáveis de imagem de super-resolução.

A Figura 2A mostra a estrutura reconstruída pelo ULM da microvasculatura no cérebro do rato, pos...

Discussão

Este protocolo utilizou com sucesso o ULM para realizar imagens de super-resolução da microvasculatura cerebral de ratos in vivo. Em comparação com outras modalidades de imagem, o ULM acomoda simultaneamente a resolução espacial e a profundidade de penetração. O cérebro do rato exposto foi fotografado e não através do crânio, evitando atenuação e distorção causadas pela presença de osso. Sob um transdutor com frequência central de 15,625 MHz, foram captadas estruturas v...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol	DICHANG	https://www.dehsm.com/goods-17187.html	75%
Beamforming program	Institute of Biomedical Engineering at the University of Montreal	Matlab Ultrasound Toolbox 3.4 version
Body temperature maintenance device	RWD Life Science Co., Ltd.	69026
Brain stereotaxic instrument	RWD Life Science Co., Ltd.	71000-R	Adaptable to breathing mask
Cranial Microinjection Surgical Instrument Kit	RWD Life Science Co., Ltd.	SP0005-R
Digital microscope	RWD Life Science Co., Ltd.	DOM-1001
Drug delivery catheter	RWD Life Science Co., Ltd.	https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/administration/draw-blood
Erythromycin ointment	Renhe Pharma	H36020018	1% x 15 g
Gas anesthesia machine	RWD Life Science Co., Ltd.	R500IE	Includes breathing mask
Handheld electric clipper	GUAZHOUMU	MJD-DTJ02
Handheld mini cranial drill	RWD Life Science Co., Ltd.	78001
Indwelling needle	Kindly EnterpriseDevelopment Group Co., LTD	Positive Pressure Model	26 G
Iodine solution	HYNAUT	https://www.hainuocn.com/index/detail/524.html	4.5–5.5 g/L
IQ demodulation program	Institute of Biomedical Engineering at the University of Montreal	Matlab Ultrasound Toolbox 3.4 version
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	R510-22-10
MATLAB software	MathWorks	Version R2021a
Microinjection pump	RWD Life Science Co., Ltd.	R462
Sodium chloride injection	SHENG'AO animals pharmaceutical Co., Ltd.	270071460	0.90%
SonoVue	Bracco	https://www.bracco.com/en-se/product/sonovue
Spherical drill bit	RWD Life Science Co., Ltd.	HM1027/HM1010
Supporting Positioning Software	RWD Life Science Co., Ltd.	V2.0.0.30400
Syringe	Kindly EnterpriseDevelopment Group Co., Ltd.	RWLB	1 mL
Tracking program	Jean-Yves Tinevez	2016 version
Ultrasound gel	Junkang Medical Equipment Co., Ltd.	Model DS-1
Ultrasound probe	VERASONICS, INC.	L22-14vX LF
Verasonics Ultrasound System	VERASONICS, INC.	Vantage-256	ultrasound platform