Zweidimensionale superauflösende Visualisierung der Mikrovaskulatur des Gehirns von Ratten mittels Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Ultraschalllokalisationsmikroskopie (ULM), das eine räumliche Auflösung von 12,5 μm erreicht, um die Mikrovaskulatur des Gehirns bei Ratten abzubilden. Es ermöglicht eine detaillierte Visualisierung der Richtung und Geschwindigkeit des Blutflusses und bietet ein leistungsstarkes Werkzeug für die Weiterentwicklung von Studien zu zerebralen Durchblutungs- und Gefäßerkrankungen.

Zusammenfassung

Die zerebralen Mikrovaskulatur bildet ein komplexes Netzwerk von Gefäßen, die für die Aufrechterhaltung der Gehirnfunktion unerlässlich sind. Krankheiten wie Schlaganfall, Alzheimer, Gliome und vaskuläre Demenz können das mikrovaskuläre System tiefgreifend stören. Leider bieten die derzeitigen medizinischen Bildgebungsmodalitäten nur indirekte Beobachtungen in dieser Größenordnung. Inspiriert von der optischen Mikroskopie überwindet die Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie (ULM) den klassischen Kompromiss zwischen Eindringtiefe und räumlicher Auflösung. Durch die Lokalisierung und Verfolgung einzelner injizierter Mikrobläschen (MBs) mit Subwellenlängenpräzision können Gefäß- und Geschwindigkeitskarten auf der Mikrometerskala erstellt werden. Hier stellen wir ein robustes Protokoll für die hochauflösende Bildgebung der Mikrovaskulatur des Gehirns in vivo bei Ratten unter Verwendung einer kommerziellen Ultraschallplattform vor. Diese Methode erreicht eine räumliche Auflösung von 12,5 μm, rekonstruiert die mikrovaskuläre Architektur und liefert detaillierte Informationen über die Richtung und Geschwindigkeit des Blutflusses, was unser Verständnis der zerebralen Mikrozirkulation erheblich verbessert. Das Protokoll kann auf Rattenkrankheitsmodelle ausgeweitet werden und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Früherkennung und Behandlung von neurovaskulären Erkrankungen.

Einleitung

Das zerebrale Mikrogefäßsystem, bestehend aus Kapillaren, Arteriolen und Venolen, ist für die Aufrechterhaltung der Gehirnfunktion unerlässlich, indem es die Nährstoffzufuhr, den Sauerstoffaustausch und die Abfallbeseitigung erleichtert ^1,2. Störungen in diesem Netzwerk sind mit neurologischen Erkrankungen wie Schlaganfall³, Alzheimer⁴, Gliomen⁵ und vaskulärer Demenz⁶ verbunden, was zu Beeinträchtigungen der Gehirnphysiologie führt. Mikrovaskuläre Veränderungen gehen häufig dem Auftreten klinischer Symptome voraus, was sie zu einem kritischen Ziel für diagnostische und therapeutische Eingriffe macht ^7,8. Ein umfassendes Verständnis der vaskulären Veränderungen sowohl auf struktureller als auch auf funktioneller Ebene ist der Schlüssel zur Weiterentwicklung der Forschung und der Behandlungsstrategien.

Die Darstellung der zerebralen Mikrovaskulatur ist jedoch aufgrund der geringen Größe und der teilweise tiefen Lage im Gehirn eine besondere Herausforderung. Herkömmliche bildgebende Verfahren wie die Magnetresonanztomographie (MRT)⁹ und die Computertomographie (CT)¹⁰ sind zwar für die Erfassung großflächiger Gefäßveränderungen geeignet, bieten aber eine räumliche Auflösung (~100 μm), die für die Visualisierung kleiner Gefäße viel zu grob ist. Optische Methoden wie die Zwei-Photonen-Mikroskopie¹¹ bieten eine hervorragende räumliche Auflösung (bis zu 1 μm) für die Abbildung einzelner Kapillaren, werden jedoch durch ein begrenztes Sichtfeld und eine begrenzte Eindringtiefe (weniger als 1 mm) behindert, was ihre Fähigkeit, tiefe Hirnregionen abzubilden, einschränkt. Als ultraschallbasierte Technik bietet Doppler¹² zwar eine Echtzeit-Blutflussmessung, bleibt aber durch eine Auflösung von 50-200 μm eingeschränkt, die für mikrovaskuläre Details nicht ausreicht. Insgesamt erfüllt derzeit keine einzelne Methode die doppelte Anforderung an eine hohe räumliche Auflösung und eine ausreichende Hirnpenetration, die für die Bildgebung der zerebralen Mikrovaskulatur erforderlich ist.

Inspiriert von der optischen Mikroskopie^13,14 ermöglicht die Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie (ULM) die Visualisierung feiner Strukturen auf der Mikrometerskala, indem sie einzelne injizierte Mikrobläschen (MBs) lokalisiert und ihre Verschiebung mit einer Subwellenlängenauflösung^{verfolgt 15}. Sie umgeht den klassischen Kompromiss zwischen Penetration und Auflösung in der Ultraschallbildgebung¹⁶. Diese Studie beschreibt ein robustes Protokoll für die Implementierung von ULM in einem lebenden Rattenmodell, das eine hochauflösende Bildgebung der Mikrovaskulatur des Gehirns durch die kommerziell erhältliche Ultraschallplattform ermöglicht. Das Protokoll liefert nicht nur eine umfassende Rekonstruktion der mikrovaskulären Struktur, sondern auch detaillierte Informationen über die Richtung und Geschwindigkeit des Blutflusses, was mit herkömmlichen bildgebenden Verfahren nicht möglich ist. Obwohl das Protokoll an normalen Ratten validiert wurde, ist es auf Rattenkrankheitsmodelle erweiterbar und bietet Möglichkeiten für maßgeschneiderte Studien unter verschiedenen pathologischen Bedingungen.

Protokoll

Alle Tierversuche, die in dieser Arbeit durchgeführt werden, sind von der Ethikkommission der Fudan Universität genehmigt (Zulassungsnummer: 2022JS-004). Das Protokoll hält sich strikt an die Tierhaltungsrichtlinien der Fudan-Universität, um eine humane Behandlung der Tiere zu gewährleisten. Vor Beginn des Versuchs muss den Ratten eine einwöchige Periode zur Eingewöhnung in die Umgebung eingeräumt werden, in der sie ausreichend Futter und Wasser erhalten. Die Photoperiode wird sorgfältig in Übereinstimmung mit ihrem biologischen Rhythmus reguliert, um die Aufrechterhaltung normaler physiologischer Zustände zu gewährleisten. Am Ende des Experiments wird die Euthanasie mit einer Überdosis inhalativem Isofluran durchgeführt.

HINWEIS: Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 1A-H dargestellt.

1. Vorbereitung der Tiere für die ULM-Bildgebung

1. Anästhesie
   1. Induzieren Sie die Anästhesie bei der Ratte, indem Sie ein Gemisch aus 3,5 % Isofluran und 100 % Sauerstoff bei einer Flussrate von 3 l/min verabreichen. Nach ca. 4 Minuten wird das Tier aus der Kammer genommen und auf eine auf 37 °C vorgewärmte Bildgebungsplattform gelegt. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie feststellen, dass kein Rückzugsreflex an der festen Zehenklemme der Hintergliedmaße der Ratte vorhanden ist.
   2. Legen Sie die Nase der Ratte in eine Atemmaske, die mit dem Anästhesiesystem verbunden ist. Halten Sie eine stabile Sedierung aufrecht, indem Sie ein Gemisch aus 1,5 % Isofluran und 100 % Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1,5 l/min verabreichen.
      HINWEIS: Anästhesiemethoden und Dosierungen folgen streng den Richtlinien des Herstellers.
2. Präoperative Vorbereitung auf das Tier
   1. Befestigen Sie die oberen Schneidezähne der Ratte in der Kerbe der Schneidestange und positionieren Sie den Unterkiefer unter der Stange. Verwenden Sie Ohrstangen, um den Kopf der Ratte zu stabilisieren, indem Sie sie in der knöchernen Vertiefung etwas vor und oberhalb des Gehörgangs positionieren (mit der Hand tastbar), um sicherzustellen, dass die gesamte Schädeloberfläche horizontal bleibt (Abbildung 1A).
   2. Testen Sie vorsichtig die Stabilität der Fixierung, indem Sie einen kleinen Druck auf verschiedene Teile des Kopfes ausüben. Stellen Sie sicher, dass es zu keiner Bewegung oder einem Verrutschen aus der ursprünglichen Position kommt.
   3. Passen Sie die Höhe der Bildgebungsplattform an und passen Sie den Winkel des Rattenkopfes akribisch an, indem Sie die Kerbe der Schneideschneidestange anheben oder absenken, um eine ungehinderte Atmung zu gewährleisten.
   4. Tragen Sie Erythromycin-Salbe oder 30%ige Glycerinlösung auf die Augen der Ratte auf, um Schäden durch längere Exposition gegenüber OP-Leuchten zu vermeiden und die Augen unter Narkose feucht zu halten. Verwenden Sie außerdem eine Pinzette mit runder Spitze, um die Zunge der Ratte vorsichtig zu einer Seite des Mauls zu ziehen, um ein Ersticken während der Operation zu verhindern.
   5. Verwenden Sie eine elektrische Schermaschine und rasieren Sie den Kopf der Ratte gegen die Haarwuchsrichtung (von hinten nach vorne), typischerweise zwischen den Ohren, von den Augen bis zum Anfang des Halses (Abbildung 1B). Reinigen Sie den rasierten Bereich mit 1%iger Jodlösung, um den chirurgischen Schnitt vorzubereiten.
3. Rattenkraniotomie
   1. Machen Sie einen Schnitt entlang der sagittalen Naht des Schädels der Ratte, beginnend direkt hinter dem Hinterhauptbein und etwa 4 cm nach vorne. Verwenden Sie Hämostatika, um die Haut auf beiden Seiten zurückzuziehen (Abbildung 1C). Optional können Sie die Haut über dem Schädel vollständig entfernen, um einen besseren chirurgischen Zugang zu ermöglichen, aber dies kann das Infektionsrisiko erhöhen.
   2. Entfernen Sie mit einer kleinen Schere das Periost vom Schädel, wodurch die harte Knochenschicht vollständig freigelegt wird.
   3. Führen Sie die Kraniotomie mit einem tragbaren Mini-Schädelbohrer durch, der mit einem kugelförmigen Bohrer ausgestattet ist (Abbildung 1D). Beginnen Sie mit einem groben Bohrer (2,5 mm Durchmesser) und klopfen Sie vorsichtig auf den Knochen, um ihn abzuschleifen, indem Sie den Bohrer jeweils 2-3 s lang anwenden. Beginnen Sie im mittleren Bereich und gehen Sie zu den dickeren Bereichen an den Seiten vor.
      HINWEIS: Übermäßige Blutungen während der Kraniotomie beeinträchtigen die Durchblutung, was zu einer mangelnden Gefäßrekonstruktion in den kortikalen Bereichen führt (Abbildung 1H).
   4. Pausieren Sie alle 2-3 s, um eine Überhitzung zu vermeiden, und injizieren Sie alle 2 Minuten etwa 1 ml 0,9 % NaCl mit einer Spritze in den Bohrbereich, um Schmutz abzukühlen und abzuspülen.
   5. Sobald das weiße Knochengewebe nicht mehr durchgehend verbunden erscheint, wechseln Sie zu einem feineren Bohrer (1 mm Durchmesser). Die Bohrung wird fortgesetzt, bis die zentralen großen Blutgefäße deutlich dunkelbraun sichtbar sind und der umgebende Bereich rosa erscheint, wobei die Mikrogefäße leicht rötlich sichtbar sind (Abbildung 1F).
      HINWEIS: Der endgültige Kraniotomiebereich reicht von Bregma +3 mm bis Lambda anterior-posterior und 7 mm auf jeder Seite entlang der Mittellinie des Schädels (Abbildung 1E). Lassen Sie die Ratte nach Abschluss der Operation etwa 10 Minuten ruhen, um relativ stabile physiologische Bedingungen zu gewährleisten, bevor Sie mit der Datenerfassung beginnen.

2. Einrichtung vor der Datenerfassung

1. Kontrastmittelaufbereitung und Injektion
   1. Lösen Sie das Kontrastmittel (eine Durchstechflasche mit 59 mg SF_6-Gas und 25 mg lyophilisiertem Pulver) gemäß den offiziellen Richtlinien in 5 ml 0,9 % NaCl auf. Schütteln Sie die Mischung kräftig, um eine MB-Suspension zu bilden. Die Endkonzentration von SF₆ in der Suspension beträgt 8 μL/ml.
   2. Ziehen Sie 0,8 mL der MB-Suspension in eine 1-ml-Spritze und befestigen Sie sie an einer Mikroinjektionspumpe, die für eine Infusion mit 100 μl/min programmiert ist.
   3. Führen Sie eine 26-G-Verweilnadel mit einem Katheter in die Schwanzvene der Ratte ein (Abbildung 1G).
2. Auswählen der Bildebene
   1. Montieren Sie eine Sonde mit einer Zentralfrequenz von 15,625 MHz am Manipulatorarm des stereotaktischen Instruments des Gehirns, die mit einer Klemme ausgestattet ist (Bewegungsbereich: vertikal, horizontal und anterior-posterior bis 80 mm; Lesegenauigkeit: 0,1 mm).
   2. Positionieren Sie die Ultraschallsonde direkt über dem freiliegenden Rattengehirn. Tragen Sie das Kopplungsgel auf die freiliegende Gehirnoberfläche auf, um eine optimale Signalübertragung zu gewährleisten.
   3. Öffnen Sie die Hauptschnittstelle der Software, die einen Rattengehirnatlas mit Programmen zur Steuerung von Motorbewegungen integriert.
   4. Legen Sie den Bregma-Punkt als Ursprung fest. Die Softwareschnittstelle bietet eine Echtzeitanzeige der Flugbahn der Sonde und der entsprechenden Position der Rattenhirnschnitte. Wählen Sie die Ziel-Bildgebungsebene aus. zum Beispiel Bregma -1 mm.

3. Datenerfassung (Timing ~ 20 min)

HINWEIS: Verasonics (Ultraschallsystem) stellt die ursprünglichen MATLAB-Skripte für die Verwendung mit dem Vantage-System zur Verfügung und wurde nicht geändert.

1. Software-Inbetriebnahme
   1. Starten Sie die Software MATLAB 2021a.
   2. Geben Sie das Datenerfassungsskript in MATLAB 2021a ein.
   3. Geben Sie im Stammverzeichnis im Befehlszeilenfenster activate ein, um die Laufzeitumgebung zu aktivieren.
2. Parameterkonfiguration und Erfassung von HF-Signalen
   1. Legen Sie die Anfangs- und Endtiefe der Datenerfassung auf 5 bzw. 120 Wellenlängen fest, um den interessierenden Bereich effektiv zu erfassen.
      HINWEIS: Anpassungen sollten auf der Grundlage der Bildgebungsebene und des zu untersuchenden Tieres vorgenommen werden.
   2. Stellen Sie die Lenkwinkel der Plane-Wave-Übertragung von -5° bis 5° in Schritten von 2,5° ein, um die Bildauflösung und den Kontrast zu verbessern.
      HINWEIS: Passen Sie diese Einstellungen basierend auf den spezifischen Bildgebungsanforderungen und Zielmerkmalen an.
   3. Stellen Sie die Sendespannung auf 20 V ein, um eine ausreichende Durchdringung und ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis für den interessierenden Bereich zu gewährleisten.
   4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um die Datenerfassung zu starten und die Hochfrequenzsignale (RF) im .mat-Dateiformat zu speichern.
      HINWEIS: Beginnen Sie mit der Datenerfassung 30 s nach dem Starten der Mikroinjektionspumpe, um eine gleichmäßige und stabile MB-Verteilung im Körper der Ratte zu gewährleisten.

4. Datenverarbeitung und -analyse (Timing ~ 8 h)

1. Datenverarbeitung
   1. Importieren Sie die HF-Daten in MATLAB 2021a und demodulieren Sie sie, um In-Phase- und Quadratur-Daten (I/Q) zu generieren (siehe Materialtabelle).
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um den DAS-Algorithmus (Delay-and-Sum) für das Beamforming der I/Q-Daten zu verwenden (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Post-Compounding-Bildrate von 800 Hz mit insgesamt 120.000 Bildern.
2. ULM-Bildgebung
   1. Wenden Sie den raumzeitlichen Filteralgorithmus¹⁷ (Singular Value Decomposition, SVD) auf IQ-Daten an, um Hintergrundrauschen und Unordnung zu entfernen. Alle 800 Frames werden als Datenblock gespeichert, und der SVD-Schwellenwert wird auf [15, 800] festgelegt.
   2. Bestimmen Sie den Mittelpunkt jedes MB mit dem Gaußschen Anpassungsalgorithmus¹⁸.
   3. Verwenden Sie den Kuhn-Munkes-Algorithmus, um MB-Trajektorien über aufeinanderfolgende Frames basierend auf ihren Positionen zu verfolgen (siehe Materialtabelle).
   4. Ordnen Sie MB-Trajektorien auf ein 8x hochgerechnetes Gitter ab, indem Sie eine Hot-Colormap verwenden, um die Anzahl der MB-Trajektorien anzuzeigen, und eine Jet-Colormap, um die Strömungsgeschwindigkeit zu kodieren, indem Sie die berechnete Geschwindigkeit an jeder Position innerhalb des Mikrovaskulatursystems abbilden.
   5. Wenden Sie ein benutzerdefiniertes Farbschema an, um Aufwärts- und Abwärtsströmungsrichtungen zu unterscheiden, was zu hochauflösenden Bildern für eine verbesserte Visualisierung führt.
   6. Teilen Sie die ursprünglichen MB-Trajektorien nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen auf, um zwei Unterbilder zu erstellen, führen Sie für jedes eine Fourier-Transformation durch und berechnen Sie die Fourier-Ring-Korrelation (FRC) als normierte Korrelation ihrer Spektren. Definieren Sie die Auflösung als Kehrwert der Ortsfrequenz, bei der der FRC unter den Schwellenwert¹⁹ fällt.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt den detaillierten Aufbau für die mikrovaskuläre ULM-Bildgebung im Gehirn in vivo bei Ratten, wobei jedes Element sorgfältig entwickelt wurde, um die experimentelle Variabilität zu minimieren und eine genaue Datenerfassung für zuverlässige hochauflösende Bildgebungsergebnisse zu gewährleisten.

Abbildung 2A zeigt die ULM-rekonstruierte Struktur des Mikrovaskulatursyste...

Diskussion

Dieses Protokoll nutzte ULM erfolgreich, um eine hochauflösende Bildgebung von in vivo Mikrovaskulatur des Gehirns von Ratten durchzuführen. Im Vergleich zu anderen bildgebenden Verfahren berücksichtigt ULM gleichzeitig sowohl die räumliche Auflösung als auch die Eindringtiefe. Das freiliegende Rattengehirn wurde nicht durch den Schädel, sondern durch den Schädel abgebildet, um eine Abschwächung und Verzerrung durch das Vorhandensein von Knochen zu vermeiden. Unter einem Schallko...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol	DICHANG	https://www.dehsm.com/goods-17187.html	75%
Beamforming program	Institute of Biomedical Engineering at the University of Montreal	Matlab Ultrasound Toolbox 3.4 version
Body temperature maintenance device	RWD Life Science Co., Ltd.	69026
Brain stereotaxic instrument	RWD Life Science Co., Ltd.	71000-R	Adaptable to breathing mask
Cranial Microinjection Surgical Instrument Kit	RWD Life Science Co., Ltd.	SP0005-R
Digital microscope	RWD Life Science Co., Ltd.	DOM-1001
Drug delivery catheter	RWD Life Science Co., Ltd.	https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/administration/draw-blood
Erythromycin ointment	Renhe Pharma	H36020018	1% x 15 g
Gas anesthesia machine	RWD Life Science Co., Ltd.	R500IE	Includes breathing mask
Handheld electric clipper	GUAZHOUMU	MJD-DTJ02
Handheld mini cranial drill	RWD Life Science Co., Ltd.	78001
Indwelling needle	Kindly EnterpriseDevelopment Group Co., LTD	Positive Pressure Model	26 G
Iodine solution	HYNAUT	https://www.hainuocn.com/index/detail/524.html	4.5–5.5 g/L
IQ demodulation program	Institute of Biomedical Engineering at the University of Montreal	Matlab Ultrasound Toolbox 3.4 version
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	R510-22-10
MATLAB software	MathWorks	Version R2021a
Microinjection pump	RWD Life Science Co., Ltd.	R462
Sodium chloride injection	SHENG'AO animals pharmaceutical Co., Ltd.	270071460	0.90%
SonoVue	Bracco	https://www.bracco.com/en-se/product/sonovue
Spherical drill bit	RWD Life Science Co., Ltd.	HM1027/HM1010
Supporting Positioning Software	RWD Life Science Co., Ltd.	V2.0.0.30400
Syringe	Kindly EnterpriseDevelopment Group Co., Ltd.	RWLB	1 mL
Tracking program	Jean-Yves Tinevez	2016 version
Ultrasound gel	Junkang Medical Equipment Co., Ltd.	Model DS-1
Ultrasound probe	VERASONICS, INC.	L22-14vX LF
Verasonics Ultrasound System	VERASONICS, INC.	Vantage-256	ultrasound platform