Visualisation bidimensionnelle en super-résolution de la microvascularisation du cerveau de rat à l’aide de la microscopie de localisation par ultrasons

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole de microscopie de localisation par ultrasons (ULM), qui atteint une résolution spatiale de 12,5 μm pour imager la microvascularisation cérébrale chez le rat. Il permet une visualisation détaillée de la direction et de la vitesse du flux sanguin, offrant un outil puissant pour faire progresser les études sur la circulation cérébrale et les troubles vasculaires.

Résumé

La microvascularisation cérébrale forme un réseau complexe de vaisseaux essentiels au maintien de la fonction cérébrale. Des maladies telles que les accidents vasculaires cérébraux, la maladie d’Alzheimer, les gliomes et la démence vasculaire peuvent profondément perturber le système microvasculaire. Malheureusement, les modalités actuelles d’imagerie médicale n’offrent que des observations indirectes à cette échelle. Inspirée de la microscopie optique, la microscopie de localisation par ultrasons (ULM) surmonte le compromis classique entre la profondeur de pénétration et la résolution spatiale. En localisant et en suivant les microbulles injectées individuelles avec une précision inférieure à la longueur d’onde, des cartes vasculaires et de vitesse peuvent être générées à l’échelle micrométrique. Ici, nous présentons un protocole robuste pour l’imagerie à super-résolution de la microvascularisation cérébrale in vivo chez le rat à l’aide d’une plateforme d’échographie commerciale. Cette méthode atteint une résolution spatiale de 12,5 μm, reconstruisant l’architecture microvasculaire et fournissant des informations détaillées sur la direction et la vitesse du flux sanguin, améliorant considérablement notre compréhension de la microcirculation cérébrale. Le protocole peut être étendu à des modèles de maladies chez le rat, offrant ainsi un outil puissant pour le diagnostic précoce et le traitement des maladies neurovasculaires.

Introduction

La microvascularisation cérébrale, qui comprend les capillaires, les artérioles et les veinules, est essentielle au maintien de la fonction cérébrale en facilitant l’apport de nutriments, l’échange d’oxygène et l’élimination des déchets ^1,2. Les perturbations de ce réseau sont impliquées dans des troubles neurologiques tels que l’accident vasculaire cérébral³, la maladie d’Alzheimer⁴, les gliomes⁵ et la démence vasculaire⁶, entraînant des altérations de la physiologie cérébrale. Les modifications microvasculaires précèdent souvent l’apparition des symptômes cliniques, ce qui en fait une cible critique pour les interventions diagnostiques et thérapeutiques ^7,8. Une compréhension complète des altérations vasculaires aux niveaux structurel et fonctionnel est essentielle pour faire progresser la recherche et les stratégies de traitement.

Cependant, l’imagerie de la microvascularisation cérébrale est particulièrement difficile en raison de sa petite taille et de son emplacement partiellement profond dans le cerveau. Les modalités d’imagerie conventionnelles telles que l’imagerie par résonance magnétique (IRM)⁹ et la tomodensitométrie (TDM)¹⁰, bien qu’adéquates pour capturer des changements vasculaires à grande échelle, offrent une résolution spatiale (~100 μm) qui est beaucoup trop grossière pour visualiser de petits vaisseaux. Les méthodes optiques telles que la microscopie à deux photons¹¹ offrent une excellente résolution spatiale (jusqu’à 1 μm) pour imager des capillaires individuels, mais sont entravées par un champ de vision et une profondeur de pénétration limités (moins de 1 mm), ce qui limite leur capacité à imager les régions profondes du cerveau. En tant que technique basée sur l’échographie, le Doppler¹², tout en offrant une évaluation du flux sanguin en temps réel, reste limité par une résolution de 50-200 μm, insuffisante pour les détails microvasculaires. Dans l’ensemble, aucune méthode ne répond actuellement à la double exigence d’une résolution spatiale élevée et d’une pénétration cérébrale suffisante nécessaire à l’imagerie par microvascularisation cérébrale.

Inspirée de la microscopie optique ^13,14, la microscopie de localisation par ultrasons (ULM) permet de visualiser des structures fines à l’échelle du micron en localisant les microbulles injectées (MB) individuelles et en suivant leur déplacement avec une résolution inférieure à la longueur d’onde¹⁵. Il contourne le compromis classique entre pénétration et résolution en imagerie par ultrasons¹⁶. Cette étude détaille un protocole robuste pour mettre en œuvre l’ULM dans un modèle de rat vivant et permettre ainsi l’imagerie à super-résolution de la microvascularisation cérébrale grâce à la plate-forme d’échographie disponible dans le commerce. Le protocole fournit non seulement une reconstruction complète de la structure microvasculaire, mais fournit également des informations détaillées sur la direction et la vitesse du flux sanguin, ce qui n’est pas possible avec les techniques d’imagerie conventionnelles. Bien que le protocole ait été validé chez des rats normaux, il peut être étendu à des modèles de maladies chez le rat, offrant des possibilités d’études personnalisées dans différentes conditions pathologiques.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux effectuées dans le cadre de ce travail sont approuvées par le comité d’éthique de l’Université Fudan (numéro d’approbation : 2022JS-004). Le protocole suit strictement les directives de soins aux animaux de l’Université Fudan pour assurer le traitement humain des animaux. Avant le début de l’expérience, les rats doivent bénéficier d’une période d’acclimatation environnementale d’une semaine, au cours de laquelle ils reçoivent suffisamment de nourriture et d’eau. La photopériode est soigneusement régulée en fonction de leurs rythmes biologiques pour assurer le maintien d’états physiologiques normaux. À la fin de l’expérience, l’euthanasie est réalisée à l’aide d’une surdose d’isoflurane inhalé.

REMARQUE : La configuration expérimentale est illustrée à la figure 1A-H.

1. Préparation de l’animal pour l’imagerie ULM

1. Anesthésie
   1. Induire l’anesthésie chez le rat en administrant un mélange de 3,5 % d’isoflurane et de 100 % d’oxygène à un débit de 3 L/min. Après environ 4 minutes, retirez l’animal de la chambre et placez-le sur le ventre sur une plate-forme d’imagerie préchauffée à 37 °C. Confirmer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de retrait sur le pincement ferme de l’orteil de la patte postérieure du rat.
   2. Placez le nez du rat dans un masque respiratoire relié au système d’anesthésie. Maintenez une sédation stable en administrant un mélange de 1,5 % d’isoflurane et de 100 % d’oxygène à un débit de 1,5 L/min.
      REMARQUE : Les méthodes d’anesthésie et les dosages suivent strictement les directives du fabricant.
2. Préparation pré-chirurgicale de l’animal
   1. Fixez les incisives supérieures du rat dans l’encoche de la barre d’incisive, en positionnant la mâchoire inférieure sous la barre. À l’aide de barres auriculaires, stabilisez la tête du rat en les positionnant dans l’échancrure osseuse légèrement en avant et au-dessus du conduit auditif (palpable à la main), en veillant à ce que toute la surface crânienne reste horizontale (Figure 1A).
   2. Sondez doucement la stabilité de la fixation en appliquant une petite pression sur différentes parties de la tête. Assurez-vous qu’il n’y a pas de mouvement ou de glissement par rapport à la position d’origine.
   3. Ajustez avec précision la hauteur de la plateforme d’imagerie et ajustez méticuleusement l’angle de la tête du rat en levant ou en abaissant l’encoche de la barre incisive pour assurer une respiration sans obstruction.
   4. Appliquez une pommade à l’érythromycine ou une solution de glycérine à 30 % sur les yeux du rat pour prévenir les dommages causés par une exposition prolongée aux lumières chirurgicales et pour garder les yeux humides sous anesthésie. De plus, utilisez une pince à épiler à bout rond pour tirer doucement la langue du rat d’un côté de la bouche afin d’éviter l’asphyxie pendant la chirurgie.
   5. À l’aide d’une tondeuse électrique portative, rasez la tête du rat dans le sens inverse de la pousse des poils (de l’arrière vers l’avant), généralement entre les oreilles, des yeux jusqu’au début du cou (figure 1B). Nettoyez la zone rasée avec une solution d’iode à 1 % pour préparer l’incision chirurgicale.
3. craniotomie chez le rat
   1. Faites une incision le long de la suture sagittale du crâne du rat, en commençant juste derrière l’os occipital et en s’étendant sur environ 4 cm vers l’avant. Utilisez des hémostats pour rétracter la peau des deux côtés (Figure 1C). Si vous le souhaitez, excisez entièrement la peau du crâne pour faciliter l’accès chirurgical, mais cela peut augmenter le risque d’infection.
   2. Utilisez de petits ciseaux pour retirer le périoste du crâne, exposant complètement la couche osseuse dure.
   3. Effectuez la craniotomie à l’aide d’une mini-perceuse crânienne portative équipée d’un foret sphérique (Figure 1D). Commencez avec un foret grossier (2,5 mm de diamètre) et tapotez doucement pour abraser l’os, en appliquant la perceuse pendant 2 à 3 s à la fois. Commencez par la zone centrale et progressez vers les zones plus épaisses sur les côtés.
      REMARQUE : Les saignements excessifs pendant la craniotomie ont un impact sur la circulation sanguine, entraînant un manque de reconstruction vasculaire dans les zones corticales (Figure 1H).
   4. Faites une pause toutes les 2 à 3 s pour éviter la surchauffe et, toutes les 2 minutes, injectez environ 1 mL de NaCl à 0,9 % dans la zone de forage à l’aide d’une seringue pour refroidir et rincer les débris.
   5. Une fois que le tissu osseux blanc n’apparaît plus de manière constante, passez à un foret plus fin (1 mm de diamètre). Poursuivez le forage jusqu’à ce que les principaux vaisseaux sanguins centraux soient clairement visibles en brun foncé et que la zone environnante apparaisse rose, avec des microvaisseaux légèrement rougeâtres (figure 1F).
      REMARQUE : L’amplitude finale de la craniotomie va de Bregma +3 mm à Lambda antéro-postérieurement et 7 mm de chaque côté le long de la ligne médiane du crâne (Figure 1E). Une fois l’opération terminée, laissez le rat se reposer pendant environ 10 minutes pour assurer des conditions physiologiques relativement stables avant de commencer la collecte de données.

2. Configuration avant la collecte des données

1. Préparation et injection d’agent de contraste
   1. Dissoudre l’agent de contraste (un flacon contenant 59 mg de gaz SF₆ et 25 mg de poudre lyophilisée), conformément aux directives officielles, dans 5 mL de NaCl à 0,9 %. Agitez vigoureusement le mélange pour former une suspension MB. La concentration finale de SF₆ dans la suspension est de 8 μL/mL.
   2. Prélevez 0,8 mL de la suspension MB dans une seringue de 1 mL et fixez-la à une pompe de micro-injection programmée pour perfuser à 100 μL/min.
   3. Insérez une aiguille à demeure de 26 G avec un cathéter fixé dans la veine de la queue du rat (Figure 1G).
2. Sélection du plan d’imagerie
   1. Montez une sonde avec une fréquence centrale de 15,625 MHz sur le bras manipulateur de l’instrument stéréotaxique cérébral, équipé d’une pince (amplitude de mouvement : verticale, horizontale et antéro-postérieure jusqu’à 80 mm ; précision de lecture : 0,1 mm).
   2. Placez la sonde à ultrasons directement au-dessus du cerveau de rat exposé. Appliquez du gel de couplage sur la surface cérébrale exposée pour assurer une transmission optimale du signal.
   3. Ouvrez l’interface principale du logiciel, qui intègre un atlas de cerveau de rat avec des programmes de contrôle de mouvement moteur.
   4. Définissez le point Bregma comme origine. L’interface logicielle fournit un affichage en temps réel de la trajectoire de la sonde et de l’emplacement correspondant de la tranche de cerveau de rat. Sélectionnez le plan d’imagerie cible ; par exemple, Bregma -1 mm.

3. Collecte de données (Timing ~ 20 min)

REMARQUE : Verasonics (système d’échographie) fournit les scripts MATLAB originaux à utiliser avec le système Vantage et n’a pas été modifié.

1. Démarrage du logiciel
   1. Lancez le logiciel MATLAB 2021a.
   2. Entrez le script d’acquisition de données dans MATLAB 2021a.
   3. Dans le répertoire racine, tapez activate dans la fenêtre de ligne de commande pour activer l’environnement d’exécution.
2. Configuration des paramètres et acquisition des signaux RF
   1. Réglez les profondeurs de début et de fin de la collecte de données à 5 et 120 longueurs d’onde, respectivement, pour capturer efficacement la région d’intérêt.
      REMARQUE : Les ajustements doivent être effectués en fonction du plan d’imagerie et de l’animal spécifique étudié.
   2. Réglez les angles de braquage de transmission des ondes planes de -5° à 5° par incréments de 2,5° pour améliorer la résolution et le contraste de l’image.
      REMARQUE : Ajustez ces paramètres en fonction des exigences spécifiques en matière d’imagerie et des caractéristiques de la cible.
   3. Réglez la tension d’émission sur 20 V pour assurer une pénétration adéquate et un rapport signal/bruit optimal pour la région d’intérêt.
   4. Cliquez sur le bouton Exécuter pour démarrer la collecte de données et enregistrer les signaux de radiofréquence (RF) au format de fichier .mat.
      REMARQUE : Commencer la collecte des données 30 s après le démarrage de la pompe de micro-injection pour assurer une distribution uniforme et stable du MB dans le corps du rat.

4. Traitement et analyse des données (Timing ~ 8 h)

1. Traitement des données
   1. Importez les données RF dans MATLAB 2021a et démodulez-les pour générer des données en phase et en quadrature (I/Q) (voir le Tableau des matériaux).
   2. Cliquez sur le bouton Exécuter pour utiliser l’algorithme DAS (Delay-and-Sum) pour la formation de faisceaux sur les données I/Q (voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE : Fréquence d’images post-composition de 800 Hz, avec un total de 120 000 images.
2. Imagerie ULM
   1. Appliquez l’algorithme de filtrage spatio-temporel SVD (Singular Value Decomposition)¹⁷ aux données IQ pour supprimer le bruit de fond et l’encombrement. Chaque 800 trames est stockée sous la forme d’un bloc de données et le seuil SVD est défini sur [15, 800].
   2. Localisez le centre de chaque Mo à l’aide de l’algorithme d’ajustement gaussien¹⁸.
   3. Utilisez l’algorithme de Kuhn-Munkres pour suivre les trajectoires MB sur des images consécutives en fonction de leurs positions (voir Tableau des matériaux).
   4. Cartographiez les trajectoires MB sur une grille suréchantillonnée 8x, à l’aide d’une palette de couleurs chaudes pour afficher le nombre de trajectoires MB et d’une palette de couleurs de jet pour coder la vitesse d’écoulement en cartographiant la vitesse calculée à chaque position dans la microvascularisation.
   5. Appliquez une combinaison de couleurs personnalisée pour distinguer les directions d’écoulement vers le haut et vers le bas, ce qui permet d’obtenir des images haute résolution pour une visualisation améliorée.
   6. Divisez de manière aléatoire les trajectoires MB d’origine en deux groupes pour créer deux sous-images, effectuez une transformée de Fourier sur chacune d’elles et calculez la corrélation en anneau de Fourier (FRC) en tant que corrélation normalisée de leurs spectres. Définissez la résolution comme l’inverse de la fréquence spatiale où la FRC tombe en dessous du seuil¹⁹.

Résultats

La figure 1 illustre la configuration détaillée de l’imagerie microvasculaire microvasculaire cérébrale ULM in vivo chez le rat, chaque élément étant soigneusement conçu pour minimiser la variabilité expérimentale et assurer une acquisition de données précise pour des résultats d’imagerie fiables à super-résolution.

La figure 2A montre la structure reconstruite par ULM de l...

Discussion

Ce protocole a utilisé avec succès l’ULM pour effectuer une imagerie à super-résolution de la microvascularisation cérébrale in vivo du rat. Par rapport à d’autres modalités d’imagerie, l’ULM s’adapte simultanément à la fois à la résolution spatiale et à la profondeur de pénétration. Le cerveau de rat exposé a été imagé plutôt qu’à travers le crâne, évitant ainsi l’atténuation et la distorsion causées par la présence d’os. Sous un transducteur d?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol	DICHANG	https://www.dehsm.com/goods-17187.html	75%
Beamforming program	Institute of Biomedical Engineering at the University of Montreal	Matlab Ultrasound Toolbox 3.4 version
Body temperature maintenance device	RWD Life Science Co., Ltd.	69026
Brain stereotaxic instrument	RWD Life Science Co., Ltd.	71000-R	Adaptable to breathing mask
Cranial Microinjection Surgical Instrument Kit	RWD Life Science Co., Ltd.	SP0005-R
Digital microscope	RWD Life Science Co., Ltd.	DOM-1001
Drug delivery catheter	RWD Life Science Co., Ltd.	https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/administration/draw-blood
Erythromycin ointment	Renhe Pharma	H36020018	1% x 15 g
Gas anesthesia machine	RWD Life Science Co., Ltd.	R500IE	Includes breathing mask
Handheld electric clipper	GUAZHOUMU	MJD-DTJ02
Handheld mini cranial drill	RWD Life Science Co., Ltd.	78001
Indwelling needle	Kindly EnterpriseDevelopment Group Co., LTD	Positive Pressure Model	26 G
Iodine solution	HYNAUT	https://www.hainuocn.com/index/detail/524.html	4.5–5.5 g/L
IQ demodulation program	Institute of Biomedical Engineering at the University of Montreal	Matlab Ultrasound Toolbox 3.4 version
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	R510-22-10
MATLAB software	MathWorks	Version R2021a
Microinjection pump	RWD Life Science Co., Ltd.	R462
Sodium chloride injection	SHENG'AO animals pharmaceutical Co., Ltd.	270071460	0.90%
SonoVue	Bracco	https://www.bracco.com/en-se/product/sonovue
Spherical drill bit	RWD Life Science Co., Ltd.	HM1027/HM1010
Supporting Positioning Software	RWD Life Science Co., Ltd.	V2.0.0.30400
Syringe	Kindly EnterpriseDevelopment Group Co., Ltd.	RWLB	1 mL
Tracking program	Jean-Yves Tinevez	2016 version
Ultrasound gel	Junkang Medical Equipment Co., Ltd.	Model DS-1
Ultrasound probe	VERASONICS, INC.	L22-14vX LF
Verasonics Ultrasound System	VERASONICS, INC.	Vantage-256	ultrasound platform