Visualización bidimensional de superresolución de la microvasculatura cerebral de rata mediante microscopía de localización por ultrasonido

Resumen

En este trabajo, describimos un protocolo para la microscopía de localización por ultrasonido (ULM), que logra una resolución espacial de 12,5 μm para obtener imágenes de la microvasculatura cerebral en ratas. Permite una visualización detallada de la dirección y la velocidad del flujo sanguíneo, lo que ofrece una poderosa herramienta para avanzar en los estudios de la circulación cerebral y los trastornos vasculares.

Resumen

La microvasculatura cerebral forma una compleja red de vasos esenciales para mantener la función cerebral. Enfermedades como el accidente cerebrovascular, la enfermedad de Alzheimer, los gliomas y la demencia vascular pueden alterar profundamente el sistema microvascular. Desafortunadamente, las modalidades actuales de imágenes médicas solo ofrecen observaciones indirectas a esta escala. Inspirada en la microscopía óptica, la microscopía de localización por ultrasonido (ULM) supera el compromiso clásico entre la profundidad de penetración y la resolución espacial. Mediante la localización y el seguimiento de microburbujas inyectadas individuales (MB) con precisión de sublongitud de onda, se pueden generar mapas vasculares y de velocidad a escala micrométrica. Aquí, presentamos un protocolo robusto para la obtención de imágenes de superresolución de la microvasculatura cerebral in vivo en ratas utilizando una plataforma de ultrasonido comercial. Este método logra una resolución espacial de 12,5 μm, reconstruyendo la arquitectura microvascular y proporcionando información detallada sobre la dirección y la velocidad del flujo sanguíneo, mejorando en gran medida nuestra comprensión de la microcirculación cerebral. El protocolo puede extenderse a modelos de enfermedad de ratas, ofreciendo una poderosa herramienta para el diagnóstico temprano y el tratamiento de enfermedades neurovasculares.

Introducción

La microvasculatura cerebral, que comprende capilares, arteriolas y vénulas, es esencial para mantener la función cerebral al facilitar el suministro de nutrientes, el intercambio de oxígeno y la eliminación de desechos ^1,2. Las interrupciones en esta red están implicadas en trastornos neurológicos como el accidente cerebrovascular³, la enfermedad de Alzheimer⁴, los gliomas⁵ y la demencia vascular⁶, lo que conduce a deficiencias en la fisiología cerebral. Los cambios microvasculares frecuentemente preceden al inicio de los síntomas clínicos, lo que los convierte en un objetivo crítico para las intervenciones diagnósticas y terapéuticas ^7,8. Una comprensión integral de las alteraciones vasculares, tanto a nivel estructural como funcional, es clave para avanzar en la investigación y las estrategias de tratamiento.

Sin embargo, la obtención de imágenes de la microvasculatura cerebral es particularmente desafiante debido al pequeño tamaño y la ubicación parcialmente profunda dentro del cerebro. Las modalidades de imagen convencionales como la resonancia magnética (RM)⁹ y la tomografía computarizada (TC)¹⁰, aunque son adecuadas para capturar cambios vasculares a gran escala, ofrecen una resolución espacial (~100 μm) que es demasiado tosca para visualizar vasos pequeños. Los métodos ópticos, como la microscopía de dos fotones¹¹ , proporcionan una excelente resolución espacial (hasta 1 μm) para obtener imágenes de los capilares individuales, pero se ven obstaculizados por el limitado campo de visión y la profundidad de penetración (menos de 1 mm), lo que restringe su capacidad para obtener imágenes de regiones cerebrales profundas. Como técnica basada en ultrasonidos, el Doppler¹², si bien ofrece una evaluación del flujo sanguíneo en tiempo real, sigue limitado por una resolución de 50-200 μm, insuficiente para el detalle microvascular. En general, en la actualidad, ningún método cumple con el doble requisito de alta resolución espacial y suficiente penetración cerebral necesaria para la obtención de imágenes de microvasculatura cerebral.

Inspirada en la microscopía óptica^13,14, la microscopía ultrasónica de localización (ULM) permite la visualización de estructuras finas en la escala micrométrica mediante la localización de microburbujas inyectadas individuales (MB) y el seguimiento de su desplazamiento con una resolución de sublongitud de onda¹⁵. Evita el compromiso clásico entre penetración y resolución en las imágenes de ultrasonido¹⁶. Este estudio detalla un protocolo robusto para implementar ULM en un modelo de rata viva y, por lo tanto, permitir la obtención de imágenes de superresolución de la microvasculatura cerebral a través de la plataforma de ultrasonido disponible comercialmente. El protocolo no solo proporciona una reconstrucción completa de la estructura microvascular, sino que también proporciona información detallada sobre la dirección y la velocidad del flujo sanguíneo, lo que no es posible con las técnicas de imagen convencionales. Aunque el protocolo fue validado en ratas normales, es extensible a modelos de enfermedad de rata, ofreciendo posibilidades para estudios personalizados en diferentes condiciones patológicas.

Protocolo

Todos los experimentos con animales realizados en este trabajo están aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Fudan (Número de aprobación: 2022JS-004). El protocolo sigue estrictamente las pautas de cuidado animal de la Universidad de Fudan para garantizar el trato humanitario de los animales. Antes del inicio experimental, se debe permitir a las ratas un período de 1 semana para la aclimatación ambiental, durante el cual se les proporciona suficiente alimento y agua. El fotoperiodo se regula cuidadosamente de acuerdo con sus ritmos biológicos para garantizar el mantenimiento de los estados fisiológicos normales. Al final del experimento, la eutanasia se realiza utilizando una sobredosis de isoflurano inhalado.

NOTA: La configuración experimental se muestra en la Figura 1A-H.

1. Preparación animal para la obtención de imágenes ULM

1. Anestesia
   1. Inducir la anestesia en la rata administrando una mezcla de isoflurano al 3,5% y oxígeno al 100% a un caudal de 3 L/min. Después de aproximadamente 4 minutos, retire al animal de la cámara y colóquelo boca abajo sobre una plataforma de imágenes precalentada a 37 °C. Confirme la profundidad de la anestesia por la ausencia de un reflejo de retirada en el firme pellizco de la extremidad trasera de la rata.
   2. Coloque la nariz de la rata en una máscara de respiración conectada al sistema de anestesia. Mantener una sedación estable administrando una mezcla de isoflurano al 1,5% y oxígeno al 100% a un caudal de 1,5 L/min.
      NOTA: Los métodos y dosis de anestesia siguen estrictamente las pautas del fabricante.
2. Preparación prequirúrgica de los animales
   1. Asegure los incisivos superiores de la rata en la muesca de la barra de incisivos, colocando la mandíbula inferior debajo de la barra. Utilice barras para estabilizar la cabeza de la rata colocándolas en la hendidura ósea ligeramente anterior y superior al canal auditivo (palpable con la mano), asegurándose de que toda la superficie craneal permanezca horizontal (Figura 1A).
   2. Pruebe suavemente la estabilidad de la fijación aplicando una pequeña cantidad de presión en diferentes partes de la cabeza. Asegúrese de que no haya movimiento ni deslizamiento de la posición original.
   3. Ajuste la altura de la plataforma de imágenes y ajuste meticulosamente el ángulo de la cabeza de la rata subiendo o bajando la muesca de la barra incisiva para garantizar una respiración sin obstrucciones.
   4. Aplique ungüento de eritromicina o solución de glicerina al 30% en los ojos de la rata para prevenir el daño de la exposición prolongada a las luces quirúrgicas y para mantener los ojos húmedos bajo anestesia. Además, use pinzas de punta redonda para tirar suavemente de la lengua de la rata hacia un lado de la boca para evitar la asfixia durante la cirugía.
   5. Use una maquinilla eléctrica de mano y afeite la cabeza de la rata en contra de la dirección del crecimiento del vello (de atrás hacia adelante), generalmente entre las orejas, desde los ojos hasta el comienzo del cuello (Figura 1B). Limpie el área afeitada con una solución de yodo al 1% para prepararse para la incisión quirúrgica.
3. Craneotomía en ratas
   1. Haga una incisión a lo largo de la sutura sagital del cráneo de la rata, comenzando justo detrás del hueso occipital y extendiéndose aproximadamente 4 cm hacia atrás. Utilice hemostáticos para retraer la piel en ambos lados (Figura 1C). Opcionalmente, extirpe completamente la piel sobre el cráneo para proporcionar un mayor acceso quirúrgico, pero esto puede aumentar el riesgo de infección.
   2. Use tijeras pequeñas para quitar el periostio del cráneo, exponiendo completamente la capa de hueso duro.
   3. Realice la craneotomía utilizando un mini taladro craneal de mano equipado con una broca esférica (Figura 1D). Comience con una broca gruesa (2,5 mm de diámetro) y golpee suavemente para desgastar el hueso, aplicando la broca durante 2-3 segundos a la vez. Comienza en la zona central y avanza hacia las zonas más gruesas de los lados.
      NOTA: El sangrado excesivo durante la craneotomía afecta la circulación sanguínea, lo que resulta en una falta de reconstrucción vascular en las áreas corticales (Figura 1H).
   4. Haga una pausa cada 2-3 segundos para evitar el sobrecalentamiento y, cada 2 minutos, inyecte aproximadamente 1 ml de NaCl al 0,9 % en el área de perforación con una jeringa para enfriar y enjuagar los residuos.
   5. Una vez que el tejido óseo blanco ya no parezca conectado de manera consistente, cambie a una broca más fina (1 mm de diámetro). Continúe perforando hasta que los vasos sanguíneos principales centrales sean claramente visibles de color marrón oscuro, y el área circundante aparezca rosada, con microvasos visibles ligeramente rojizos (Figura 1F).
      NOTA: El rango final de craneotomía es de Bregma +3 mm a Lambda en antero-posterior y 7 mm a cada lado a lo largo de la línea media del cráneo (Figura 1E). Después de completar la cirugía, deje que la rata descanse durante aproximadamente 10 minutos para garantizar condiciones fisiológicas relativamente estables antes de comenzar la recopilación de datos.

2. Configuración antes de la recopilación de datos

1. Preparación e inyección de agentes de contraste
   1. Disuelva el agente de contraste (un vial que contenga 59 mg de gas SF₆ y 25 mg de polvo liofilizado), según las pautas oficiales, en 5 ml de NaCl al 0,9%. Agite vigorosamente la mezcla para formar una suspensión MB. La concentración final de SF₆ en la suspensión es de 8 μL/mL.
   2. Extraiga 0,8 ml de la suspensión MB en una jeringa de 1 ml y asegúrela a una bomba de microinyección programada para infundir a 100 μl/min.
   3. Inserte una aguja permanente de 26 G con un catéter conectado en la vena de la cola de la rata (Figura 1G).
2. Selección del plano de imagen
   1. Monta una sonda con una frecuencia central de 15,625 MHz en el brazo manipulador del instrumento estereotáxico cerebral, equipado con una pinza (rango de movimiento: vertical, horizontal y antero-posterior hasta 80 mm; precisión de lectura: 0,1 mm).
   2. Coloque la sonda de ultrasonido directamente sobre el cerebro de la rata expuesto. Aplique gel de acoplamiento a la superficie cerebral expuesta para garantizar una transmisión óptima de la señal.
   3. Abra la interfaz principal del software, que integra un atlas del cerebro de una rata con programas de control de movimiento motor.
   4. Establezca el punto Bregma como origen. La interfaz del software proporciona una visualización en tiempo real de la trayectoria de la sonda y la ubicación correspondiente del corte de cerebro de rata. Seleccione el plano de imagen de destino; por ejemplo, Bregma -1 mm.

3. Recopilación de datos (Tiempo ~ 20 min)

NOTA: Verasonics (sistema de ultrasonidos) proporciona los scripts originales de MATLAB para su uso con el sistema Vantage y no se ha modificado.

1. Puesta en marcha del software
   1. Inicie el software MATLAB 2021a.
   2. Introduzca el script de adquisición de datos en MATLAB 2021a.
   3. En el directorio raíz, escriba activate en la ventana de línea de comandos para activar el entorno de tiempo de ejecución.
2. Configuración de parámetros y adquisición de señales de RF
   1. Establezca las profundidades de inicio y fin de la recopilación de datos en 5 y 120 longitudes de onda, respectivamente, para capturar eficazmente la región de interés.
      NOTA: Los ajustes deben realizarse en función del plano de imagen y del animal específico que se esté estudiando.
   2. Ajuste los ángulos de dirección de la transmisión de onda plana de -5° a 5° en incrementos de 2,5° para mejorar la resolución y el contraste de la imagen.
      NOTA: Ajuste estos ajustes en función de los requisitos específicos de imagen y las características del objetivo.
   3. Ajuste el voltaje de transmisión a 20 V para garantizar una penetración adecuada y una relación señal-ruido óptima para la región de interés.
   4. Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar la recopilación de datos y guardar las señales de radiofrecuencia (RF) en formato de archivo .mat.
      NOTA: Comience la recolección de datos 30 s después de poner en marcha la bomba de microinyección para asegurar una distribución uniforme y estable de MB dentro del cuerpo de la rata.

4. Procesamiento y análisis de datos (Tiempo ~ 8 h)

1. Procesamiento de datos
   1. Importe los datos de RF en MATLAB 2021a y dedúzcalos para generar datos en fase y en cuadratura (I/Q) (consulte Tabla de materiales).
   2. Haga clic en el botón Ejecutar para utilizar el algoritmo de retardo y suma (DAS) para la formación de haces en los datos I/Q (consulte la tabla de materiales).
      NOTA: Velocidad de fotogramas posterior a la composición de 800 Hz, con un total de 120.000 fotogramas.
2. Obtención de imágenes ULM
   1. Aplique el algoritmo de filtrado espaciotemporal¹⁷ de descomposición de valores singulares (SVD) a los datos de IQ para eliminar el ruido de fondo y el desorden. Cada 800 fotogramas se almacena como un bloque de datos y el umbral SVD se establece en [15, 800].
   2. Localice el centro de cada MB utilizando el algoritmo de ajuste gaussiano¹⁸.
   3. Utilice el algoritmo de Kuhn-Munkres para realizar un seguimiento de las trayectorias de MB a través de fotogramas consecutivos en función de sus posiciones (consulte la Tabla de materiales).
   4. Mapee las trayectorias de MB en una cuadrícula muestreada 8x, utilizando un mapa de colores caliente para mostrar el número de trayectorias de MB y un mapa de colores de chorro para codificar la velocidad del flujo mediante el mapeo de la velocidad calculada en cada posición dentro de la microvasculatura.
   5. Aplique un esquema de color personalizado para distinguir las direcciones de flujo ascendente y descendente, lo que da como resultado imágenes de alta resolución para una visualización mejorada.
   6. Divida aleatoriamente las trayectorias originales de MB en dos grupos para crear dos subimágenes, realice una transformada de Fourier en cada una y calcule la correlación de anillos de Fourier (FRC) como la correlación normalizada de sus espectros. Defina la resolución como la inversa de la frecuencia espacial en la que el FRC cae por debajo del umbral¹⁹.

Resultados

La Figura 1 ilustra la configuración detallada de las imágenes microvasculares ULM cerebrales in vivo en ratas, con cada elemento cuidadosamente diseñado para minimizar la variabilidad experimental y garantizar una adquisición de datos precisa para obtener resultados fiables de imágenes de superresolución.

La Figura 2A muestra la estructura reconstruida por ULM de la microvasculatura en...

Discusión

Este protocolo utilizó con éxito ULM para realizar imágenes de superresolución de la microvasculatura cerebral de rata in vivo. En comparación con otras modalidades de obtención de imágenes, ULM se adapta simultáneamente a la resolución espacial y a la profundidad de penetración. Se tomaron imágenes del cerebro de rata expuesto en lugar de a través del cráneo, evitando la atenuación y la distorsión causadas por la presencia de hueso. Bajo un transductor con una frecuencia ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol	DICHANG	https://www.dehsm.com/goods-17187.html	75%
Beamforming program	Institute of Biomedical Engineering at the University of Montreal	Matlab Ultrasound Toolbox 3.4 version
Body temperature maintenance device	RWD Life Science Co., Ltd.	69026
Brain stereotaxic instrument	RWD Life Science Co., Ltd.	71000-R	Adaptable to breathing mask
Cranial Microinjection Surgical Instrument Kit	RWD Life Science Co., Ltd.	SP0005-R
Digital microscope	RWD Life Science Co., Ltd.	DOM-1001
Drug delivery catheter	RWD Life Science Co., Ltd.	https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/administration/draw-blood
Erythromycin ointment	Renhe Pharma	H36020018	1% x 15 g
Gas anesthesia machine	RWD Life Science Co., Ltd.	R500IE	Includes breathing mask
Handheld electric clipper	GUAZHOUMU	MJD-DTJ02
Handheld mini cranial drill	RWD Life Science Co., Ltd.	78001
Indwelling needle	Kindly EnterpriseDevelopment Group Co., LTD	Positive Pressure Model	26 G
Iodine solution	HYNAUT	https://www.hainuocn.com/index/detail/524.html	4.5–5.5 g/L
IQ demodulation program	Institute of Biomedical Engineering at the University of Montreal	Matlab Ultrasound Toolbox 3.4 version
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	R510-22-10
MATLAB software	MathWorks	Version R2021a
Microinjection pump	RWD Life Science Co., Ltd.	R462
Sodium chloride injection	SHENG'AO animals pharmaceutical Co., Ltd.	270071460	0.90%
SonoVue	Bracco	https://www.bracco.com/en-se/product/sonovue
Spherical drill bit	RWD Life Science Co., Ltd.	HM1027/HM1010
Supporting Positioning Software	RWD Life Science Co., Ltd.	V2.0.0.30400
Syringe	Kindly EnterpriseDevelopment Group Co., Ltd.	RWLB	1 mL
Tracking program	Jean-Yves Tinevez	2016 version
Ultrasound gel	Junkang Medical Equipment Co., Ltd.	Model DS-1
Ultrasound probe	VERASONICS, INC.	L22-14vX LF
Verasonics Ultrasound System	VERASONICS, INC.	Vantage-256	ultrasound platform