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요약

여기에서는 쥐의 뇌 미세혈관 구조를 이미지화하기 위해 12.5μm 공간 해상도를 달성하는 초음파 국소화 현미경(ULM)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이를 통해 혈류의 방향과 속도를 자세히 시각화할 수 있어 대뇌 순환 및 혈관 질환에 대한 연구를 발전시킬 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

초록

대뇌 미세혈관 구조는 뇌 기능을 유지하는 데 필수적인 복잡한 혈관 네트워크를 형성합니다. 뇌졸중, 알츠하이머병, 신경교종, 혈관성 치매와 같은 질병은 미세혈관계에 심각한 장애를 일으킬 수 있습니다. 불행히도 현재의 의료 영상 방식은 이 규모에서 간접 관찰만 제공합니다. 광학 현미경에서 영감을 받은 초음파 국소화 현미경(ULM)은 침투 깊이와 공간 해상도 사이의 고전적인 균형을 극복합니다. 서브 파장 정밀도로 주입된 개별 마이크로버블(MB)을 현지화하고 추적함으로써 마이크로미터 규모에서 혈관 및 속도 맵을 생성할 수 있습니다. 여기에서는 상업용 초음파 플랫폼을 사용하여 쥐의 생체 내에서 뇌 미세혈관 구조의 초고해상도 이미징을 위한 강력한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 12.5μm의 공간 해상도를 달성하여 미세혈관 구조를 재구성하고 혈류 방향 및 속도에 대한 자세한 정보를 제공하여 대뇌 미세순환에 대한 이해를 크게 향상시킵니다. 이 프로토콜은 쥐 질병 모델로 확장될 수 있으며, 신경 혈관 질환의 조기 진단 및 치료를 위한 강력한 도구를 제공합니다.

서문

모세혈관, 세동맥, 정맥으로 구성된 대뇌 미세혈관 구조는 영양분 전달, 산소 교환 및 노폐물 제거를 촉진하여 뇌 기능을 유지하는 데 필수적입니다 1,2. 이 네트워크의 붕괴는 뇌졸중3, 알츠하이머병4, 신경교종5, 혈관성 치매6와 같은 신경 장애와 관련이 있으며, 이는 뇌 생리학적 장애로 이어집니다. 미세혈관 변화는 임상 증상이 나타나기 전에 나타나는 경우가 많기 때문에 진단 및 치료 개입의 중요한 표적이 된다 7,8. 구조적 및 기능적 수준 모두에서 혈관 변화에 대한 포괄적인 이해는 연구 및 치료 전략을 발전시키는 데 중요합니다.

그러나 대뇌 미세혈관 구조를 영상화하는 것은 크기가 작고 뇌 내 부분적으로 깊은 위치로 인해 특히 어렵습니다. 자기공명영상(MRI)9 및 컴퓨터 단층촬영(CT)10과 같은 기존의 이미징 방식은 대규모 혈관 변화를 포착하는 데는 적합하지만 작은 혈관을 시각화하기에는 너무 거친 공간 해상도(~100μm)를 제공합니다. 이광자 현미경11 과 같은 광학 방법은 개별 모세혈관을 이미지화하는 데 뛰어난 공간 해상도(최소 1μm)를 제공하지만 제한된 시야와 침투 깊이(1mm 미만)로 인해 방해를 받아 뇌 심부 영역을 이미지화하는 능력이 제한됩니다. 초음파 기반 기술인 Doppler12는 실시간 혈류 평가를 제공하지만 50-200μm의 해상도로 제한되어 있어 미세혈관 세부 사항을 파악하기에는 충분하지 않습니다. 전반적으로, 현재 대뇌 미세혈관 이미징에 필요한 높은 공간 해상도와 충분한 뇌 침투라는 이중 요구 사항을 충족하는 단일 방법은 없습니다.

광학 현미경13,14에서 영감을 받은 초음파 국소화 현미경(ULM)은 개별 주입된 미세기포(MB)를 찾고 하위 파장 해상도15로 변위를 추적하여 미크론 규모에서 미세 구조를 시각화할 수 있습니다. 이는 초음파 영상에서 투과율과 해상도 사이의 고전적인 절충안을 우회합니다16. 이 연구는 살아있는 쥐 모델에서 ULM을 구현하고 상업적으로 이용 가능한 초음파 플랫폼을 통해 뇌 미세혈관 구조의 초고해상도 이미징을 가능하게 하는 강력한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 미세혈관 구조의 포괄적인 재구성을 제공할 뿐만 아니라 기존의 이미징 기술로는 불가능한 혈류의 방향과 속도에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 이 프로토콜은 정상 쥐에서 검증되었지만 쥐 질병 모델로 확장할 수 있어 다양한 병리학적 조건에서 맞춤형 연구의 가능성을 제공합니다.

프로토콜

본 연구에서 수행된 모든 동물실험은 푸단대학교 윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인번호: 2022JS-004). 이 프로토콜은 동물에 대한 인도적인 대우를 보장하기 위해 푸단 대학교의 동물 관리 지침을 엄격히 준수합니다. 실험을 시작하기 전에 쥐에게 환경 순응을 위한 1주일의 기간을 허용해야 하며, 이 기간 동안 충분한 사료와 물을 제공해야 합니다. 광주기는 정상적인 생리적 상태를 유지하기 위해 생체 리듬에 따라 신중하게 조절됩니다. 실험이 끝나면 흡입된 이소플루란을 과다 투여하여 안락사를 수행합니다.

알림: 실험 설정은 그림 1A-H에 나와 있습니다.

1. ULM 이미징을 위한 동물 준비

  1. 마취
    1. 3.5% 이소플루란과 100% 산소의 혼합물을 3L/min의 유속으로 투여하여 쥐에 마취를 유도합니다. 약 4분 후, 챔버에서 동물을 꺼내 37°C로 예열된 이미징 플랫폼에 엎드려 놓습니다. 쥐의 뒷다리의 단단한 발가락 꼬집음에 대한 금단 반사가 없음으로써 마취의 깊이를 확인하십시오.
    2. 마취 시스템에 연결된 호흡 마스크에 쥐의 코를 놓습니다. 1.5L/min의 유속으로 1.5% 이소플루란과 100% 산소의 혼합물을 투여하여 안정적인 진정을 유지합니다.
      참고: 마취 방법 및 복용량은 제조업체의 지침을 엄격히 따릅니다.
  2. 수술 전 동물 준비
    1. 쥐의 윗니를 앞니 막대의 노치에 고정하고 아래턱을 막대 아래에 위치시킵니다. 이어바를 사용하여 외이도보다 약간 앞쪽에 있고 위쪽(손으로 만질 수 있음)의 뼈 움푹 들어간 곳에 위치시켜 쥐의 머리를 안정시켜 전체 두개골 표면이 수평을 유지하도록 합니다(그림 1A).
    2. 머리의 다른 부분에 약간의 압력을 가하여 고정의 안정성을 부드럽게 조사합니다. 원래 위치에서 움직이거나 미끄러지지 않는지 확인하십시오.
    3. 이미징 플랫폼의 높이를 미세 조정하고 앞니 막대 노치를 올리거나 내려 쥐의 머리 각도를 세심하게 조정하여 호흡을 방해받지 않도록 합니다.
    4. 에리스로마이신 연고 또는 30% 글리세린 용액을 쥐의 눈에 바르면 수술용 조명에 장기간 노출되어 손상되는 것을 방지하고 마취 상태에서 눈을 촉촉하게 유지할 수 있습니다. 또한 둥근 핀셋을 사용하여 쥐의 혀를 입 한쪽으로 부드럽게 당겨 수술 중 질식을 방지합니다.
    5. 휴대용 전기 가위기를 사용하여 쥐의 머리를 털이 자라는 방향(뒤에서 앞으로), 일반적으로 귀 사이, 눈에서 목 시작 부분까지 면도합니다(그림 1B). 면도한 부위를 1% 요오드 용액으로 세척하여 외과적 절개를 준비합니다.
  3. 쥐 개두술
    1. 쥐 두개골의 시상 봉합선을 따라 후두골 바로 뒤에서 시작하여 전방으로 약 4cm 연장하여 절개합니다. 지혈기를 사용하여 양쪽 피부를 수축시킵니다(그림 1C). 선택적으로 두개골 위의 피부를 완전히 절제하여 수술에 더 잘 접근할 수 있지만 감염 위험이 증가할 수 있습니다.
    2. 작은 가위를 사용하여 두개골에서 골막을 제거하고 단단한 뼈층을 완전히 노출시킵니다.
    3. 구형 드릴 비트가 장착된 휴대용 미니 두개골 드릴을 사용하여 개두술을 수행합니다(그림 1D). 거친 드릴 비트(직경 2.5mm)로 시작하여 한 번에 2-3초 동안 드릴을 적용하여 뼈를 마모시키도록 부드럽게 두드립니다. 중앙 영역에서 시작하여 측면의 두꺼운 영역으로 진행합니다.
      참고: 개두술 중 과도한 출혈은 혈액 순환에 영향을 미쳐 피질 영역의 혈관 재건이 부족합니다(그림 1H).
    4. 과열을 방지하기 위해 2-3초마다 일시 중지하고 2분마다 주사기를 사용하여 약 1mL의 0.9% NaCl을 드릴링 영역에 주입하여 이물질을 식히고 헹굽니다.
    5. 백골 조직이 더 이상 일관되게 연결되어 있지 않은 것처럼 보이면 더 미세한 드릴 비트(직경 1mm)로 교체하십시오. 중앙 주요 혈관이 짙은 갈색으로 명확하게 보이고 주변 영역이 분홍색으로 나타나고 미세혈관이 약간 붉게 보일 때까지 시추를 계속합니다(그림 1F).
      참고: 최종 개두술 범위는 Bregma +3mm에서 Lambda 전후방까지, 두개골 정중선을 따라 양쪽으로 7mm입니다(그림 1E). 수술을 마친 후 데이터 수집을 시작하기 전에 비교적 안정적인 생리적 상태를 보장하기 위해 쥐를 약 10분 동안 쉬게 합니다.

2. 데이터 수집 전 설정

  1. 조영제 준비 및 주입
    1. 공식 지침에 따라 조영제(SF6 가스 59mg과 동결건조 분말 25mg이 들어 있는 바이알 1개)를 0.9% NaCl 5mL에 용해시킵니다. 혼합물을 세게 흔들어 MB 현탁액을 형성합니다. 현탁액 내 SF6 의 최종 농도는 8μL/mL입니다.
    2. 0.8mL의 MB 현탁액을 1mL 주사기에 주입하고 100μL/분으로 주입하도록 프로그래밍된 미세 주입 펌프에 고정합니다.
    3. 카테터가 부착된 26G 내주 바늘을 쥐의 꼬리 정맥에 삽입합니다(그림 1G).
  2. 이미징 평면 선택
    1. cl이 장착된 뇌 입체 기기의 매니퓰레이터 암에 중심 주파수가 15.625MHz인 프로브를 장착합니다.amp(이동 범위: 수직, 수평 및 전후 최대 80mm, 판독 정밀도: 0.1mm).
    2. 초음파 프로브를 노출된 쥐의 뇌 바로 위에 놓습니다. 최적의 신호 전달을 보장하기 위해 노출된 뇌 표면에 커플링 젤을 바르십시오.
    3. 쥐 뇌 아틀라스와 모터 모션 제어 프로그램을 통합하는 소프트웨어의 기본 인터페이스를 엽니다.
    4. Bregma 점을 원점으로 설정합니다. 소프트웨어 인터페이스는 프로브의 궤적과 해당 쥐 뇌 절편 위치를 실시간으로 표시합니다. 대상 이미징 평면을 선택합니다. 예를 들어, Bregma -1mm입니다.

3. 데이터 수집 (타이밍 ~ 20분)

참고: Verasonics(초음파 시스템)는 Vantage 시스템과 함께 사용할 수 있는 원본 MATLAB 스크립트를 제공하며 수정되지 않았습니다.

  1. 소프트웨어 시작
    1. MATLAB 2021a 소프트웨어를 실행합니다.
    2. MATLAB 2021a에서 데이터 수집 스크립트를 입력합니다.
    3. 루트 디렉토리에서 명령줄 창에 activate 를 입력하여 런타임 환경을 활성화합니다.
  2. 파라미터 구성 및 RF 신호 수집
    1. 데이터 수집 시작 및 종료 깊이를 각각 5 개 및 120 개 파장으로 설정하여 관심 영역을 효과적으로 캡처할 수 있습니다.
      참고: 이미징 평면과 연구 중인 특정 동물에 따라 조정해야 합니다.
    2. 평면파 투과 스티어링 각도를 -5°에서 5°까지 2.5° 단위로 설정하여 이미지 해상도와 대비를 향상시킵니다.
      참고: 특정 이미징 요구 사항 및 대상 특성에 따라 이러한 설정을 조정하십시오.
    3. 전송 전압을 20V로 설정하여 관심 영역에 대한 적절한 침투와 최적의 신호 대 잡음비를 보장하십시오.
    4. 실행 버튼을 클릭하여 데이터 수집을 시작하고 무선 주파수(RF) 신호를 .mat 파일 형식으로 저장합니다.
      참고: 쥐의 몸 내에서 균일하고 안정적인 MB 분포를 보장하기 위해 마이크로 주입 펌프를 시작한 후 30초 후에 데이터 수집을 시작하십시오.

4. 데이터 처리 및 분석 (타이밍 ~ 8 시간)

  1. 데이터 처리
    1. RF 데이터를 MATLAB 2021a로 가져오고 복조하여 동상 및 직교(I/Q) 데이터를 생성합니다( 재료 표 참조).
    2. Run(실행) 버튼을 클릭하여 I/Q 데이터의 빔포밍을 위한 DAS(Delay-and-Sum) 알고리즘을 활용합니다( 재료 표 참조).
      참고: 800Hz의 포스트 컴파운딩 프레임 속도, 총 120,000프레임.
  2. ULM 이미징
    1. SVD(Singular Value Decomposition) 시공간 필터링 알고리즘17 을 IQ 데이터에 적용하여 배경 소음과 클러터를 제거합니다. 각 800프레임은 데이터 블록으로 저장되고 SVD 임계값은 [15, 800]으로 설정됩니다.
    2. 가우스 피팅 알고리즘18을 사용하여 각 MB의 중심을 찾습니다.
    3. Kuhn-Munkres 알고리즘을 활용하여 위치를 기반으로 연속된 프레임에서 MB 궤적을 추적합니다( 재료 표 참조).
    4. 핫 컬러맵을 사용하여 MB 궤적 수를 표시하고, 제트 컬러맵을 사용하여 미세혈관 내 각 위치에서 계산된 속도를 매핑하여 유속을 인코딩하여 MB 궤적을 8x 업샘플링된 그리드에 매핑합니다.
    5. 사용자 지정 색 구성표를 적용하여 위쪽 및 아래쪽 흐름 방향을 구분하여 향상된 시각화를 위한 고해상도 이미지를 얻을 수 있습니다.
    6. 원래 MB 궤적을 두 그룹으로 무작위로 분할하여 두 개의 하위 이미지를 생성하고, 각각에 대해 푸리에 변환을 수행하고, 스펙트럼의 정규화된 상관관계로 푸리에 링 상관관계(FRC)를 계산합니다. 분해능을 FRC가 임계값19 아래로 떨어지는 공간 주파수의 역으로 정의합니다.

결과

그림 1은 쥐의 생체 내 뇌 미세혈관 ULM 이미징을 위한 세부 설정을 보여주며, 각 요소는 실험적 변동성을 최소화하고 신뢰할 수 있는 초고해상도 이미징 결과를 위해 정확한 데이터 수집을 보장하도록 신중하게 설계되었습니다.

그림 2A 는 쥐의 뇌에서 미세혈관 구조의 ULM으로 재구성한 구조를 보여?...

토론

이 프로토콜은 ULM을 성공적으로 활용하여 생체 내 쥐의 뇌 미세혈관 구조의 초고해상도 이미징을 수행했습니다. 다른 이미징 방식과 비교했을 때, ULM은 공간 해상도와 침투 깊이를 동시에 수용합니다. 노출된 쥐의 뇌는 두개골을 통해서가 아니라 영상화되어 뼈의 존재로 인한 감쇠와 왜곡을 피했습니다. 중심 주파수가 15.625MHz인 트랜스듀서 아래에서 최대 12.5μm의 공간 ?...

공개

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감사의 말

이 연구는 보조금 2023YFC2410903에 따른 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램, 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 12274092, 12034005), 상하이 탐험가 프로그램(보조금 21TS1400200), 상하이 국제 과학 기술 협력 프로그램(보조금 24490710400) 및 푸단대학교 AI 과학 재단(보조금 FudanX24AI016)의 일부 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AlcoholDICHANGhttps://www.dehsm.com/goods-17187.html75%
Beamforming programInstitute of Biomedical Engineering at the University of MontrealMatlab Ultrasound Toolbox 3.4 version
Body temperature maintenance deviceRWD Life Science Co., Ltd.69026
Brain stereotaxic instrumentRWD Life Science Co., Ltd.71000-RAdaptable to breathing mask
Cranial Microinjection Surgical Instrument KitRWD Life Science Co., Ltd.SP0005-R
Digital microscopeRWD Life Science Co., Ltd.DOM-1001
Drug delivery catheterRWD Life Science Co., Ltd.https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/administration/draw-blood
Erythromycin ointmentRenhe PharmaH360200181% x 15 g
Gas anesthesia machineRWD Life Science Co., Ltd.R500IEIncludes breathing mask
Handheld electric clipperGUAZHOUMUMJD-DTJ02
Handheld mini cranial drillRWD Life Science Co., Ltd.78001
Indwelling needleKindly EnterpriseDevelopment Group Co., LTDPositive Pressure Model 26 G
Iodine solutionHYNAUThttps://www.hainuocn.com/index/detail/524.html4.5–5.5 g/L
IQ demodulation programInstitute of Biomedical Engineering at the University of MontrealMatlab Ultrasound Toolbox 3.4 version
IsofluraneRWD Life Science Co., Ltd.R510-22-10
MATLAB softwareMathWorksVersion R2021a
Microinjection pumpRWD Life Science Co., Ltd.R462
Sodium chloride injectionSHENG'AO animals pharmaceutical Co., Ltd.2700714600.90%
SonoVueBraccohttps://www.bracco.com/en-se/product/sonovue
Spherical drill bitRWD Life Science Co., Ltd.HM1027/HM1010
Supporting Positioning SoftwareRWD Life Science Co., Ltd.V2.0.0.30400
SyringeKindly EnterpriseDevelopment Group Co., Ltd.RWLB1 mL
Tracking programJean-Yves Tinevez2016 version
Ultrasound gelJunkang Medical Equipment Co., Ltd.Model DS-1
Ultrasound probeVERASONICS, INC.L22-14vX LF
Verasonics Ultrasound SystemVERASONICS, INC.Vantage-256ultrasound platform

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