用有机电化学晶体管翻译细胞外电子转移活动

摘要

在这里，我们提出了一种使用有机电化学晶体管 （OECT） 将 Shewanella oneidensis 中的细胞外电子转移 （EET） 活性转化为电信号的方案。混合 OECT 系统具有更强的稳定性、灵敏度，并具有快速、高通量检测的潜力，使其成为 EET 测量的有效工具。

摘要

细胞外电子转移 （EET） 是某些微生物可以通过其细胞膜将电子转移到外部电子受体的过程，从而将细胞代谢与其环境联系起来。虽然 Geobacter 和 Shewanella 一直是 EET 研究的主要模型，但新兴研究表明，EET 活性物种也与发酵和人类肠道微生物组有关。利用 EET 桥接生物和电子系统的能力，我们提出了一种使用有机电化学晶体管 （OECT） 将微生物 EET 活性转化为易于检测的电信号的方案。该系统能够将细胞对外部刺激的反应用于生物传感和生物计算应用。具体来说，我们证明了 OECT 中 p 型聚（3,4-乙烯二氧噻吩）:聚（苯乙烯磺酸盐）（PEDOT:PSS）通道的去掺杂是由来自希 瓦氏菌的细胞 EET 驱动的。通过遗传回路转录控制 EET 通量，我们建立了这种混合 OECT 系统的生物传感能力，以检测化学刺激，例如诱导分子。此外，我们在细胞内引入了基于质粒的布尔逻辑门，使它们能够处理环境信号并驱动 OECT 中的电流变化，进一步展示了这些设备的生物计算潜力。这种方法在生物系统和电子学之间提供了一种新颖的接口，使未来的高通量筛选、生物传感和生物计算应用成为可能。

引言

能够将生物和化学活动转导和放大为电信号的设备在各个领域都至关重要，例如传感 ^1,2、神经形态计算 ^3,4 和可穿戴电子^{学 5}。其中，有机电化学晶体管 （OECT） 因其与水环境的兼容性和低工作电压而成为生物系统和电子读数器之间的特殊接口 ^6,7。OECT 与传统电子设备的不同之处在于，它利用电解质中的离子来调节有机通道的电导率，该通道耦合离子和电子传输以实现出色的跨导^{性 8}。这些特性使 OECT 成为生物系统与电子设备连接的理想选择，因为它们可以放大微弱的生物信号并将其转换为电读数。

OECT 的工作原理是通过离子扩散改变混合离子-电子导电通道的掺杂态，通常通过在栅极上施加电压来控制。然而，生物或氧化还原反应也可以改变通道的电导率，使 OECT 能够对各种化学和生物刺激做出反应。用脂质双层、离子通道或生物分子对 OECT 进行功能化，使其能够检测特定分析物，使其可用于传感应用 ^9,10。例如，OECT 已与葡萄糖氧化酶等氧化还原活性酶集成，以直接将电子转移到通道，根据葡萄糖浓度调整其电导率¹¹。虽然这种配置对生物传感有效，但由于单个酶或蛋白质的行为相对简单，它们的计算能力受到限制。

相比之下，活细胞，尤其是细菌，提供了一个多功能平台，能够执行复杂而稳健的计算 4,12,13,14,15。电活性细菌，如 Shewanella oneidensis 和 Geobacter sulfurreducens，具有在称为细胞外电子转移 （EET） 的过程中跨细胞膜转移电子的独特能力。在厌氧条件下，这些细菌将其代谢过程与外部电子受体的还原或氧化相结合，包括金属、金属氧化物和合成材料，如导电聚合物¹⁶ 和纳米颗粒¹⁷（图 1A）。这种能力已被用于微生物燃料电池的发电，并为更先进的生物电子应用提供了潜力^18,19。此外，合成生物学的进步使电活性细菌的精确遗传作能够控制 EET 通路。通过设计调节 EET 相关基因表达的遗传回路，研究人员可以调节电子通量以响应特定的环境线索或计算逻辑作^20,21。这种对 EET 的遗传控制为创建生物混合系统开辟了途径，其中细菌计算直接与 OECT 等电子设备接口。例如，细菌遗传回路可以设计为响应化学输入的组合，打开或关闭 EET 通路，从而调节 OECT 通道的电导率。这将允许直接电读取细菌计算，而无需荧光或其他传统的生物报告基因。

最近的进展证明了 OECT 与电活性细菌偶联的潜力。例如，Méhes 等人使用 S. oneidensis 通过 p 型 OECT 监测实时 EET 活动，说明了如何通过电跟踪细菌代谢²²。虽然这项工作强调了使用 OECT 检测细菌活动的可能性，但用于生物传感和生物计算的混合系统的潜力仍未得到充分探索。为了解决这个问题，我们最近开发了混合晶体管，将转基因 S. oneidensis 整合到 p 型 OECT^{中 23}。结果表明，OECT 通道可以通过细菌 EET 活性去掺杂（图 1B）。为了进一步增强生物传感能力并获得对去掺杂过程的机制见解，我们设计了具有调节 EET 通量的遗传回路的 S. oneidensis 菌株。这导致可预测的 OECT 输出响应环境线索（如诱导分子）的变化。此外，通过将布尔逻辑集成到这些遗传电路中，我们实现了复杂细菌计算的直接电读数。

在这里，我们提出了混合晶体管作的综合方案，包括器件制造、细胞培养制备、测量程序和数据分析。此外，我们还解决了关键考虑因素，例如设备清洁、可重用性和高通量测试中自动化的潜力。

研究方案

注意:所有化学品均按收到时的状态使用，未进一步纯化。如果没有说明，则使用分析级化学品。

1. OECT 器件制造

注意:OECT 是使用改编自先前工作²⁴ 的标准微加工技术在石英显微镜载玻片上制造的。如图 2A 所示，八个 OECT 器件排列在单个标准载玻片上。将预切的聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 片材放置在载玻片上，以形成 OECT 腔室和检修口。p 型导电聚合物聚（3,4-乙烯二氧噻吩）:聚苯乙烯磺酸盐）（PEDOT:PSS）用于 OECT 通道和栅电极，通道尺寸为 150 μm x 10 μm，栅极尖端尺寸为 500 μm x 500 μm（ 图 2B）。 图 2C 提供了 OECT 通道制造和器件组装过程的摘要。

1. 金电极制造
   1. 用丙酮、异丙醇 （IPA） 和去离子 （DI） 水冲洗石英载玻片。用 N₂ 气体吹干。
   2. 用 50 sccm 和 150 W 进行 O₂ 等离子清洗，持续 120 秒。
   3. 旋涂 AZ5209e 光刻胶 （PR） 有 2 个阶段:第一个阶段为 500 rpm，100 rpm/s 加速，持续 5 秒，第二个阶段为 2000 rpm，1000 rpm/s 加速，持续 45 秒。
   4. 在 90 °C 下硬烤 150 秒。
   5. 打开掩模对准器 （Suss MA6） 并选择 i-line （365 nm） 作为紫外线源，设置参数:曝光时间为 3.5 秒（13 W），对准间隙为 15 μm，WEC 类型为接触。将 exposure type 设置为 Hard。
   6. 将光刻掩模和载玻片装入对准器中，将载玻片与掩模对齐，然后进行初始曝光。
   7. 在 110 °C 下反向烘烤 180 秒。
   8. 取下光刻掩模并使用以下参数进行泛光曝光:曝光时间为 25 秒（13 W），曝光类型为 Flood E。
   9. 使用制造商预先稀释的 AZ 400K 1:4 显影液开发 PR。将适量的显影剂倒入结晶皿中，使载玻片浸没，并以圆周运动不断摇动培养皿 45 s。然后，立即取下载玻片并将其浸泡在 DI 水中 45 秒，用 DI 水冲洗，然后用 N₂ 吹干。
      注意:该过程可以在此处暂停。
   10. 将玻片移入电子束蒸发器。泵至 2.7 x ^10-4 Pa （2 x ^10-6 T） 或更低。
   11. 依次沉积 Ti 粘合剂层 （10 nm） 和 Au （100 nm）。沉积速度可能因所使用的特定蒸发器而异。建议 0.1 nm/s 的沉积速度，以实现沉积质量和处理时间之间的良好平衡。
   12. 将载玻片浸泡在丙酮中过夜，去除多余的金属。浸泡后，使用移液管将丙酮流喷射到载玻片表面，以去除任何残留的过量金属。上述步骤后获得的夸脱载玻片称为 OECT 电极载玻片。
       注意:或者，使用超声处理来帮助去除多余的金属。
2. PEDOT:PSS 通道制造
   1. 用丙酮、IPA 和 DI 水冲洗 OECT 电极载玻片。用 N₂ 气体吹干。
   2. 将载玻片在 160 °C 下烘烤至少 5 分钟。 在旋涂之前让载玻片冷却。
   3. 旋涂 AZ5209e PR 分为 2 个阶段:首先以 500 rpm、100 rpm/s 的加速度持续 5 秒，然后以 2000 rpm、1000 rpm/s 的速度加速 45 秒。
   4. 在 90 °C 下硬烤 150 秒。
   5. 在硬接触模式下使用 i-line 以 13 W 开始初始曝光 3.5 秒。
   6. 在 110 °C 下反向烘烤 180 秒。
   7. 在 13 W 下执行 25 秒的泛洪暴露。
   8. 使用 AZ 400K 1:4 显影液显影 45 秒，并不断圆周摇动培养皿。然后，将载玻片浸泡在 DI 水中 45 秒，用 DI 水冲洗，并用 N₂ 吹干。
      注意:该过程可以在此处暂停。
   9. 通过将瓶子漂浮在装满超声仪填充线的去离子水浴上，对 PEDOT:PSS 分散体进行超声处理 5 分钟。用 0.22 μm 过滤器过滤 PEDOT:PSS 分散体以去除团块。
   10. 旋涂 PEDOT:PSS 转速为 3500 rpm，加速度为 3500 rpm/s，持续 60 秒。在 90 °C 下干燥 15 分钟。
   11. 将载玻片浸泡在丙酮中 12 分钟，然后超声处理 1 分钟，去除过量的 PEDOT:PSS 膜。
   12. 用丙酮冲洗玻片，然后用 IPA 冲洗玻片，然后用 N₂ 吹干。
   13. 通过将载玻片放在 90 °C 的热板上进行乙二醇 （EG） 处理，然后滴入足够的 EG 以覆盖所有 PEDOT:PSS 5 分钟。用去离子水冲洗，然后用 N₂ 吹干。上述步骤后获得的夸脱玻片称为 OECT 玻片。
3. PDMS 器件腔室制造
   1. 通过将基料和固化剂以 10:1 的比例混合来制作 PDMS 片材。将溶液浇注到模具中以达到 3 毫米的厚度，并在连接到真空泵的 2/4 脱气室中脱气 1 小时。
   2. 通过将模具在室温下放在水平工作台上 48 小时来固化混合物，以确保 PDMS 表面光滑。盖住模具以避免空气中碎屑的污染。
   3. 用剃须刀片切出 PDMS，并分别用直径为 5 mm 和 1.5 mm 的圆孔冲孔创建设备腔室和流体交换端口。确保 PDMS 的高度在 模具铸造过程中控制在 3 毫米（步骤 1.3.1）

2. 培养基制备

1. 高压灭菌 500 mL 超纯水、四个不锈钢分液针、两个橡胶瓶盖（用于 250 mL 圆底烧瓶）、两个 250 mL 圆底烧瓶和一个 500 mL 玻璃培养基瓶。将无菌超纯水储存在 4 °C 以备将来使用。
2. 根据 表 1 准备用 2x Wolfe 微量矿物混合物 0.1% 酪蛋白氨基酸修饰的 2x 希瓦氏菌基础培养基 （SBM）。过滤器 用瓶顶过滤器将培养基灭菌到无菌玻璃培养基底部（在步骤 2.1 中获得）中。该培养基称为 2x SBM++，每个 + 表示添加了微量矿物质混合物和酪蛋白氨基酸。储存在 4 °C 以备将来使用。
3. 分别过滤无菌（0.22 μm 过滤器）以下每种化学品:将 50 mL 1 M 富马酸钠放入无菌 50 mL 离心管中;将 1 mL 2.5 mg/mL 卡那霉素 （KAN），称为 100x KAN 注入无菌微量离心管中。将 1 mL 60% w/w 无菌乳酸钠（按原样使用）分配到微量离心管中。将所有制备的溶液储存在 4 °C 下。
4. 在无菌微量离心管中分别制备 1 mL 以下化学品:100 mM 异丙基 ß-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG），简称 100x IPTG;10 mM 3-氧代己酰-高丝氨酸内酯 （OC6），称为 100x OC6;1 mM 盐酸无水四环素 （aTc），称为 100x aTc。储存在 4 °C 以备将来使用。
5. 使用步骤 2.1 中制备的灭菌瓶、橡胶盖和针头，清洗培养基储备液。将 200 mL 无菌 2X SBM++ 和超纯水各分配到单独的 250 mL 圆底培养瓶中。用橡胶盖密封烧瓶并插入无菌分液针以创建气体清洗装置（进气针浸没在液体中;气体出口针位于液体表面上方）。用 N₂ 吹扫 15 分钟。
6. 将吹扫的 2x SBM++ 和超纯水、乳酸、1 M 富马酸钠、100x KAN、100x IPTG、100x OC6 和 100x aTc 转移到手套箱中，以便进一步与 OECT 一起使用。

3. 使用 OECT 设备监控蜂窝 EET

注意:为确保厌氧性，OECT 实验在室温下在没有湿度控制的手套箱中进行。

1. 第 1 天
   1. 器械灭菌和制备
      1. 将 OECT 载玻片、PDMS 片材和 Ag/AgCl 参比电极 （RE） 高压灭菌在单独的容器中。在 80 °C 下烘烤干燥。 将高压灭菌的 OECT 载玻片和 Ag/AgCl RE 带入手套箱。
      2. 通过在手套箱前室的真空中释放 PDMS 片材中的氧气 4 小时，将其解吸。通过将 PDMS 片材放在手套箱中的 OECT 载玻片上来组装 OECT 设备。
      3. 将 45 μL 适当的 SBM 培养基注入每个 OECT 腔室。对于大多数实验，使用补充有 20 mM 乳酸的 1x SBM++。例如，通过混合 500 μL 的 2x SBM++、497 μL 无菌超纯水和 2.85 μL 的 60% w/w 乳酸钠来制备 1 mL 的 1x SBM++。
      4. 用 PDMS 片材覆盖 OECT 腔室端口，以避免介质蒸发和污染。
      5. 在 -0.05 V 的恒定通道电压 V_DS 和 0.2 V 的栅极电压 V_GS 下监控 OECT 通道电流 I_DS，直到电流稳定下来。电压选择可能因 OECT 设备或生物样品而异。在整个测量过程中，对栅极和通道使用相同的连续偏置电压。稳定可能需要数小时到数天，具体取决于前室的真空度和解吸持续时间。
   2. 细胞培养物
      1. 将细胞原液（储存在 -80 °C）划线到含有 LB（用于非质粒携带菌株）或含有 25 μg/mL 卡那霉素（用于质粒携带菌株）的 LB 的琼脂平板上，并在 30 °C^20,23 下有氧生长过夜。
2. 第 2 天
   1. 细胞制备（需氧培养）
      1. 从 LB 琼脂平板（在步骤 3.1.2.1 中获得）中随机挑选单个菌落，在 2 mL 1x SBM++ 中补充有 15 mL 培养管中的 20 mM 乳酸盐。将细胞在 30 °C 和 250 rpm 振荡下放置过夜。准备 6 mL 不含细胞的生长培养基作为非生物对照，稍后将用于细胞洗涤。
   2. 细胞制备（厌氧培养）
      1. 将含有待测菌株的 LB 琼脂平板转移到手套箱中。
      2. 在 15 mL 培养管中，从 1 mL 补充有 20 mM 乳酸盐和 40 mM 富马酸盐的适当 SBM 中的 LB 琼脂平板中随机挑选单个菌落。例如，通过混合 500 μL 2x SBM++、437 μL 无菌超纯水、2.85 μL 60% w/w 乳酸钠、40 mM 1 M 富马酸钠、10 μL 100 mM IPTG 和 10 μL 2.5 mg/mL KAN，为需要 1 mM IPTG 和 25 μg/mL KAN 的 IPTG 诱导菌株制备 1 mL 培养基。
      3. 将细胞在 30 °C 下保持 18 - 24 小时，不要摇晃。为确保实验批次之间的可比性，请保持一致的生长时间。
3. 第 3 天
   1. 初始 OECT 电化学测量
      注意:OECT 特性的类型从静态类型（如恒压偏置）到动态类型（如栅极脉冲）不等。在这里，我们使用栅极电压阶跃测试来获得动态和静态特性。重新配置 OECT 和仪器（在本例中为多通道恒电位仪）之间的电气连接由定制的手动多路复用 （MUX） 电路板协助。可以开发用于高通量测量的自动 MUX 板。
      1. 使用下述设置测量对应于 0 V 至 0.2 V 栅极电压阶跃的 OECT 通道电流 I_DS （确切名称可能因仪器而异）。
      2. 仪器通道 1 测量 OECT 通道电流 I_DS。为此，请设置 Technique name: Fast Amperometry;平衡时间:1 s;平衡电压:- 0.05 V;偏置电压:-0.05 V;运行时间:14 秒;采样间隔:0.5 毫秒。
      3. 仪器通道 2 控制 OECT 栅极电压 V_GS。为此，请设置 Technique name: Mixed Mode;条件时间:1 s;条件电压:0 V;阶段 1 模式:常数 E;1 级偏置电压:0 V;第 1 阶段运行时间:4 秒;第 2 阶段模式:常数 E;第 2 级偏置电压:0.2 V;第 2 阶段运行时间:10 秒;采样间隔:0.5 毫秒。
      4. 对所有 OECT 重复栅极电压阶跃测试（步骤 3.3.1.1 至 3.3.1.3）。此步骤可以自动化以进行高通量测试。
      5. 对所有 OECT 施加 -0.05 V 的恒定通道电压 V_DS 和 0.2 V 的栅极电压 V_GS ，直至接种。确保偏置电压与器件稳定期间使用的电压相同（步骤 3.1.1.5）。
   2. 接种物制备（需氧培养物）
      1. 通过以 1503 x g 离心 4 分钟并重悬于 1 mL 用于细胞生长的新鲜培养基中（步骤 3.2.1.1）来三重洗涤细胞。最后一次（^{第 3 次}）离心后，将细胞重悬于 0.5 mL（或原始培养体积的一半）中，以获得 OD₆₀₀ 为 1 - 3.5 的浓缩细胞悬液。相应地调整最终悬架体积。
      2. 将细胞悬液转移到手套箱中。
      3. 为了获得接种物，将细胞稀释至 0.1 的预期 OD₆₀₀ （或接种 OD₆₀₀ 的 10 倍）。妄想培养基与生长培养基具有相同的结构，但将其与清除的培养基原液一起在手套箱中新鲜制备。例如，如果细胞在补充有乳酸盐的 SBM++ 中有氧生长，则在手套箱中准备补充有乳酸盐的新鲜 SBM++ 用于接种稀释。
      4. 停止恒电位仪。将 5 μL 接种物注入 OECT 室（含有 45 μL 适当的 SBM），以在 OECT 中达到 0.01 的最终 OD₆₀₀ 。用 PDMS 片材覆盖 OECT 腔室端口，以避免介质蒸发和污染。
   3. 接种物制备（厌氧培养）
      1. 为了获得接种物，将细胞培养物稀释 10 倍。使用与生长培养基具有相同构成但缺乏富马酸盐的妄想培养基。例如，如果细胞在补充有乳酸盐、富马酸盐、KAN 和 IPTG 的 SBM++ 中厌氧生长，则在手套箱中制备补充有乳酸、KAN 和 IPTG 的新鲜 SBM++，用于接种稀释。
      2. 停止恒电位仪。将 5 μL 接种物注入 OECT 室（含有 45 μL 适当的 SBM）。用 PDMS 片材覆盖 OECT 腔室端口，以避免介质蒸发和污染。
   4. 连续测量和时间点
      1. 在整个实验过程中，对 OECT 通道 （V_DS = -0.05 V） 和栅极 （V_GS = 0.2 V） 施加恒定偏置电压，但在时间点测量期间，当电化学工作站连接到单个 OECT 进行表征时除外。
      2. 接种后运行实验 24 小时。将接种前的测量（参见步骤 3.3.1）视为 0 小时时间点。
      3. OECT 通道掺杂状态的显着变化通常发生在最初的 8 小时内。在此期间选择 5-7 个时间点进行测量，然后在 12 小时到 16 小时之间进行一次测量，最后在 24 小时标记处进行测量。示例时间点可以包括接种后立即以及接种后 1 小时、 2 小时、 3 小时、 4.5 小时、 6 小时、 8 小时、 18 小时和 24 小时的时间点。
      4. 为避免深夜测量，请在当天早些时候开始接种（参见步骤 3.3.2 或 3.3.3），以适应前 8 小时内频繁的时间点测量。
      5. 对每个时间点测量重复 3.3.1 中概述的步骤。
4. 第 4 天
   1. 最后一个时间点 （24 h） 的转移曲线测量
      1. 轻轻扭转 RE 并将其推入流体交换端口，将 Ag/AgCl RE 插入 OECT 腔室。
      2. 通过在 -0.1 V 至 0.6 V 范围内扫描栅极电压来测量 OECT 的传输曲线，同时在 -0.05 V 下使用恒定偏置 V_DS 监测通道电流 I_DS。根据 Ag/AgCl RE 测量精确的栅极和源极电位。
      3. 按照如下所述配置仪器（确切名称可能因仪器而异）。
      4. 仪器通道 1 测量 OECT 通道电流 I_DS， 使用以下设置:技术名称:计时安培法 （CA），平衡时间:5 秒，平衡电压:- 0.05 V，偏置电压:-0.05 V，运行时间:35 秒，采样间隔:0.09915 秒。
      5. 仪器通道 2 控制 OECT 栅极电压 V_GS，使用以下设置:技术名称:线性扫描伏安法 （LSV），平衡时间:5 s，平衡电压:- 0.1 V，开始电压:-0.1 V，结束电压:0.6 V，电压步长:0.002 V，扫描速率:0.02 V/s。
      6. 仪器通道 3 测量 OECT 源_{电位 VS 与} Ag/AgCl RE 的关系，使用以下设置:技术名称:开路电位法 （OCP），运行时间:40 秒，采样间隔:0.09915 秒。
      7. 仪器通道 4 测量 OECT 栅极_{电位 VG 与} Ag/AgCl RE，使用以下设置:技术名称:开路电位法 （OCP），运行时间:40 秒，采样间隔:0.09915 秒。
      8. 对所有 OECT 重复传输曲线测量。每次测量后，用 70% 乙醇冲洗 Ag/AgCl 参比电极 （RE），然后用新的低绒毛巾擦拭。Ag/AgCl RE 可以在同一样品组中重复使用，一式三份，但不应在不同的样品组之间重复使用。

4. 数据分析

1. 数据提取
   1. 使用自定义 MATLAB 代码进行数据处理，以自动从仪器的本机软件中提取和记录数据，从而显著缩短处理时间。Texas Data Repository （https://doi.org/10.18738/T8/MNKO8D） 中提供了 MATLAB 脚本。
2. 数据处理
   1. 拟合 OECT 通道电流 I_DS 数据，得到速率常数 k，用于进一步分析和比较（图 3）。对于支持 EET 的细胞样品，我们发现单个指数模型提供了最合适的。因此，我们在分析软件中使用一相指数衰减模型来拟合 I_DS 时间序列数据并获得拟合速率常数 k。此 I_DS 时间序列数据可以是原始值，也可以标准化为 0 h 时间点，因为速率常数 k 反映的是变化率而不是绝对值。
   2. 通过将 I_DS 值除以 0 h 时间点值 （I_DS0） 来获得标准化的 I_DS，称为 I_DS/I_DS0。
3. 确定速率常数 k
   1. 打开分析软件（Prism 10、GraphPad）并通过单击 "文件"创建一个新项目>"新建">"新建项目文件"。在 Create （创建） 选项卡下，选择 XY （XY）。在 Options （选项） 部分中，将 X 设置为 Numbers （数字），将 Y 设置为 Enter （输入），并为每个点绘制一个 Y 值。
   2. 将 OECT 通道电流 I_DS 数据导入到表中。通过单击 Analysis 选项卡中的 Analyze，将 I_DS 数据与单相指数衰减模型拟合。在 XY 分析中找到非线性回归 （曲线拟合） 方法。确保在右侧选择 All the Data Sets that Need to be Fited，然后单击 OK。
   3. 在新的 Parameters 窗口中，选择 Exponential 组中的 One phase decay model，然后单击 OK。模型方程如下:
      Y=（Y0 - 高原）*^e-k*X + 高原
      其中: Y 是 OECT 通道的电流 I_DS，T 是时间，k 是速率常数。
   4. 获得 k 值后，通过检查每个拟合的 R 平方值来查看拟合质量。一个好的拟合应该具有高于 0.95 的 R² 。
4. 未配对的双尾学生 t 检验
   1. 为了评估样本组之间的统计显著性，请执行未配对的双尾学生 t 检验。
   2. 打开分析软件，然后单击 File > New > New Project File） 创建一个新项目。在 Create （创建） 选项卡下，选择 XY （XY）。在 Options 部分中，将 X 设置为 Numbers 和 Y 以在并排子列中输入 3 个仿行值。
   3. 将拟合率常数 k 值导入到表中。通过单击 Analysis 选项卡中的 Analyze 来执行 t 检验。在列分析中找到 t 检验（和非参数检验）方法。确保选择 Two Data Sets Each Time（每次两个数据集），然后单击 OK（确定）。
   4. 在 Experimental Design 手册中，选择 Unpaired， Yes （是）。使用参数检验和未配对的 t 检验。假设两个种群具有相同的 SD 选项。将为每次比较生成 p 值。在图中，p 值表示如下:ns:p > 0.05（不显著），*:p ≤ 0.05，**:p ≤ 0.01，***:p ≤ 0.001，****:p ≤ 0.0001。
   5. 对所有相关数据集重复步骤 4.4.3 -4.4.4。

5. OECT 设备清洁和可重复使用

1. 实验结束后，拆卸装置并将 OECT 载玻片在肥皂水（1:10，肥皂:去离子水）中煮沸 15 分钟。
2. 将载玻片快速移至装有室温去离子水的烧杯中，等待 5 分钟让载玻片冷却。用 DI 冲洗载玻片并用清空气吹干。
3. 用万用表测量 OECT 通道的电阻。如果通道电阻在原始值的 400% 以内，则灭菌后可重新使用该设备进行实验（步骤 3.1.1）。OECT 载玻片也可以使用以下步骤进行清洁，并且适用于使用步骤 1.2 的通道制造。
   注意:食人鱼溶液具有很强的腐蚀性，会产生大量热量。始终使用适当的个人防护装备 （PPE），包括手套、护目镜和实验服。极其小心地处理并遵守机构的安全指南。
4. 在通风良好的通风橱中准备食人鱼溶液。小心地以 1:4 的比例将 30% （w/w） 过氧化氢加入 98% 硫酸中，同时轻轻地来回倾斜结晶皿进行搅拌。
5. 将结晶皿放在加热 70 °C 的热板上。 用镊子将载玻片放入食人鱼溶液中并浸入 1 分钟。
6. 小心地将载玻片转移到装有去离子水的烧杯中，让它们静置至少 1 分钟。用去离子水彻底冲洗载玻片，然后用空气吹干。
7. 根据机构化学废物处理指南处理食人鱼溶液。通过将食人鱼溶液缓慢加入装有约 4 倍溶液体积的冰水混合物的烧杯中来中和食人鱼溶液。逐渐加入中和剂（例如，10 M NaOH），同时用试纸监测 pH 值直至中性。

结果

拟合率常数 k
OECT 通道电流 I_DS 的拟合速率常数 k 是评估样品 EET 活性的可靠指标。虽然恒定的栅极偏置电压会影响速率常数，但我们选择 0.2 V 来确保正偏置，以促进细菌电子转移，同时避免在较高栅极电压下快速去掺杂，并提供和最小化细菌细胞上的电化学应力²³。选择漏极电压 -0.05 V 以确保可靠的电流?...

讨论

电化学池 （EC） 比较
根据 OECT 通道电流拟合速率常数的一个主要优点是，它通过关注 I_DS 变化的基本动态而不是原始输出来最大限度地减少器件变化。与传统的电化学电池 （EC） 相比，这种方法结合了 OECT 固有的信号放大能力，增强了混合 OECT 系统的稳健性。例如，在每个 24 小时 OECT 实验结束时，通过将栅电极电压 V_GS 从 -0.1 扫描到 0.6 V ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-oxohexanoyl-homoserine lactone	Sigma-Aldrich
anhydrotetracycline hydrochloride	VWR
casamino acids	VWR
Equipment
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich		anhydrous 99.8%,
HEPES buffer solution	VWR		1 M in water, pH = 7.3
isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside	Teknova
kanamycin sulfate	Growcells
Magnesium(II) sulfate heptahydrate	VWR
PEDOT:PSS aqueous suspension	Heraeus Epurio LLC	Clevios PH1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich
Potentiostat	PalmSens BV	MultiPalmSens4
Quartz microscopic slides	AdValue	FQ-S-003
Quartz microscopic slides
Sodium chloride	VWR
Sodium DL-lactate	TCI		60% in water
Sodium fumarate	VWR		98%
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich		95.0%-98.0%
Two-part silicone elastomer	Electron Microscopy Sciences	Sylgard184
Wolfe's Trace Mineral Mix	ATCC