Traduction des activités de transfert d’électrons extracellulaires à l’aide de transistors électrochimiques organiques

Résumé

Ici, nous présentons un protocole d’utilisation de transistors électrochimiques organiques (OECT) pour traduire l’activité de transfert d’électrons extracellulaires (EET) chez Shewanella oneidensis en signaux électriques. Le système OECT hybride offre une robustesse, une sensibilité et un potentiel accrus pour des tests rapides et à haut débit, ce qui en fait un outil efficace pour les mesures EET.

Résumé

Le transfert d’électrons extracellulaire (EET) est un processus par lequel certains micro-organismes peuvent transférer des électrons à travers leurs membranes cellulaires vers des accepteurs d’électrons externes, reliant le métabolisme cellulaire à leur environnement. Alors que Geobacter et Shewanella ont été les principaux modèles de recherche sur l’EET, des études émergentes révèlent que les espèces actives à l’EET sont également associées à la fermentation et au microbiome intestinal humain. En tirant parti de la capacité d’EET à relier les systèmes biologiques et électroniques, nous présentons un protocole d’utilisation de transistors électrochimiques organiques (OECT) pour traduire l’activité microbienne d’EET en signaux électriques facilement détectables. Ce système permet d’utiliser les réponses cellulaires à des stimuli externes pour des applications de biodétection et de bioinformatique. Plus précisément, nous avons démontré que le dédopage du canal poly(3,4-éthylènedioxythiophène) de type p (PEDOT : PSS) dans l’OECT est piloté par l’EET cellulaire de Shewanella oneidensis. En contrôlant transcriptionnellement le flux d’EET par des circuits génétiques, nous établissons la capacité de biodétection de ce système OECT hybride à détecter des stimuli chimiques, tels que des molécules inductrices. De plus, nous introduisons des portes logiques booléennes basées sur des plasmides dans les cellules, leur permettant de traiter les signaux environnementaux et d’entraîner des changements de courant dans les OECT, démontrant ainsi le potentiel bio-informatique de ces dispositifs. Cette méthode fournit une nouvelle interface entre les systèmes biologiques et l’électronique, permettant de futures applications de criblage à haut débit, de biodétection et de bioinformatique.

Introduction

Les dispositifs capables de transduire et d’amplifier les activités biologiques et chimiques en signaux électriques sont cruciaux dans divers domaines, tels que la détection ^1,2, l’informatique neuromorphique ^3,4 et l’électronique portable⁵. Parmi ceux-ci, les transistors électrochimiques organiques (OECT) sont apparus comme des interfaces exceptionnelles entre les systèmes biologiques et les lectures électroniques en raison de leur compatibilité avec les environnements aqueux et les basses tensions de fonctionnement ^6,7. Les OECT diffèrent de l’électronique conventionnelle en utilisant des ions dans un électrolyte pour moduler la conductivité d’un canal organique, qui couple le transport ionique et électronique pour obtenir une transconductance exceptionnelle⁸. Ces caractéristiques rendent les OECT idéaux pour l’interfaçage de systèmes biologiques avec l’électronique, car ils peuvent amplifier des signaux biologiques faibles et les traduire en lectures électriques.

Les OECT fonctionnent en modifiant l’état de dopage d’un canal conducteur mixte ionique-électronique par diffusion ionique, généralement contrôlée par l’application d’une tension à l’électrode de grille. Cependant, les réactions biologiques ou redox peuvent également modifier la conductivité du canal, permettant aux OETC de répondre à une variété de stimuli chimiques et biologiques. La fonctionnalisation des OETC avec des bicouches lipidiques, des canaux ioniques ou des biomolécules leur permet de détecter des analytes spécifiques, ce qui les rend utiles pour les applications de détection ^9,10. Par exemple, les OECT ont été intégrés à des enzymes redox actives comme la glucose oxydase pour transférer directement les électrons au canal, ajustant sa conductivité en réponse à la concentration de glucose¹¹. Bien que de telles configurations soient efficaces pour la biodétection, elles sont limitées dans leur capacité de calcul en raison du comportement relativement simple des enzymes ou des protéines individuelles.

En revanche, les cellules vivantes, en particulier les bactéries, offrent une plate-forme polyvalente capable d’effectuer des calculs complexes et robustes 4,12,13,14,15. Les bactéries électroactives telles que Shewanella oneidensis et Geobacter sulfurreducens ont la capacité unique de transférer des électrons à travers leurs membranes cellulaires dans un processus connu sous le nom de transfert d’électrons extracellulaire (EET). Dans des conditions anaérobies, ces bactéries couplent leurs processus métaboliques à la réduction ou à l’oxydation des accepteurs d’électrons externes, y compris les métaux, les oxydes métalliques et les matériaux synthétiques comme les polymères conducteurs¹⁶ et les nanoparticules¹⁷ (Figure 1A). Cette capacité a été exploitée dans les piles à combustible microbiennes pour la production d’énergie et offre le potentiel d’applications bioélectroniques plus avancées^18,19. De plus, les progrès de la biologie synthétique ont permis une manipulation génétique précise des bactéries électroactives pour contrôler les voies EET. En concevant des circuits génétiques qui régulent l’expression des gènes liés à l’EET, les chercheurs peuvent moduler le flux d’électrons en réponse à des signaux environnementaux spécifiques ou à des opérations de logique computationnelle^20,21. Ce contrôle génétique sur l’EET ouvre la voie à la création de systèmes bio-hybrides où les calculs bactériens sont directement interfacés avec des dispositifs électroniques tels que les OECT. Par exemple, les circuits génétiques bactériens pourraient être conçus pour répondre à des combinaisons d’intrants chimiques, en activant ou en désactivant les voies EET et en modulant ainsi la conductivité d’un canal OECT. Cela permettrait des lectures électriques directes des calculs bactériens, sans avoir besoin de rapporteurs fluorescents ou d’autres rapporteurs biologiques traditionnels.

Des progrès récents ont démontré le potentiel du couplage des OETC avec des bactéries électroactives. Par exemple, Méhes et al. ont utilisé S. oneidensis pour surveiller l’activité EET en temps réel avec un OETC de type p, illustrant comment le métabolisme bactérien pouvait être suivi électriquement²². Bien que ces travaux mettent en évidence la possibilité d’utiliser les OECT pour détecter l’activité bactérienne, le potentiel du système hybride pour la biodétection et la bioinformatique reste sous-exploré. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment développé des transistors hybrides incorporant S. oneidensis génétiquement modifié dans des OECT de type p²³. Les résultats ont démontré que le canal OECT pouvait être dopé par les activités bactériennes d’EET (Figure 1B). Afin d’améliorer davantage les capacités de biodétection et d’obtenir des informations mécanistes sur le processus de dédopage, nous avons conçu des souches de S. oneidensis avec des circuits génétiques qui régulent le flux d’EET. Cela se traduit par des changements prévisibles de la sortie OECT en réponse à des signaux environnementaux tels que les molécules inductrices. De plus, en intégrant la logique booléenne dans ces circuits génétiques, nous avons permis des lectures électriques directes de calculs bactériens complexes.

Nous présentons ici le protocole complet pour le fonctionnement du transistor hybride, couvrant la fabrication du dispositif, la préparation de la culture cellulaire, les procédures de mesure et l’analyse des données. De plus, nous abordons des considérations clés telles que le nettoyage des appareils, la réutilisation et le potentiel d’automatisation des tests à haut débit.

Protocole

REMARQUE : Tous les produits chimiques ont été utilisés tels qu’ils ont été reçus sans autre purification. Sauf indication contraire, des produits chimiques de qualité analytique ont été utilisés.

1. Fabrication du dispositif OECT

REMARQUE : Les OECT sont fabriqués sur des lames de microscope à quartz à l’aide de techniques de microfabrication standard adaptées de travaux antérieurs²⁴. Comme le montre la figure 2A, huit dispositifs OECT sont disposés sur une seule diapositive standard. Des feuilles de polydiméthylsiloxane (PDMS) prédécoupées sont placées sur la lame pour former des chambres OECT et des ports d’accès. Le polymère conducteur de type p poly(3,4-éthylènedioxythiophène) : poly(styrènesulfonate) (PEDOT : PSS) est utilisé pour le canal OECT et l’électrode de grille, avec des dimensions de 150 μm x 10 μm pour le canal et de 500 μm x 500 μm pour la pointe de grille ( figure 2B). La figure 2C présente un résumé du processus de fabrication du canal OECT et d’assemblage du dispositif.

1. Fabrication d’électrodes en or
   1. Nettoyez les lames de quartz en les rinçant avec de l’acétone, de l’alcool isopropylique (IPA) et de l’eau déminéralisée (DI). Sécher au gaz N₂ .
   2. Effectuez un nettoyage au plasma O₂ avec 50 sccm à 150 W pendant 120 s.
   3. Photorésine (PR) Spin-coat AZ5209e avec 2 étages : le premier à 500 tr/min, accélération de 100 tr/min pendant 5 s, et le second à 2000 tr/min, accélération de 1000 tr/min pendant 45 s.
   4. Cuire dur à 90 °C pendant 150 s.
   5. Allumez l’aligneur de masque (Suss MA6) et sélectionnez i-line (365 nm) comme source UV, réglez les paramètres : temps d’exposition à 3,5 s (13 W), écart d’alignement à 15 μm, type WEC à Contact. et le type d’exposition à Difficile.
   6. Chargez le masque de lithographie et la diapositive dans l’aligneur, alignez la diapositive sur le masque, puis effectuez l’exposition initiale.
   7. Cuire à l’envers à 110 °C pendant 180 s.
   8. Retirez le masque de lithographie et effectuez l’exposition Flood avec les paramètres suivants : temps d’exposition 25 s (13 W), type d’exposition Flood E.
   9. Développez le PR avec le révélateur AZ 400K 1:4 pré-dilué par le fabricant. Versez la quantité appropriée de révélateur dans un plat de cristallisation pour immerger la lame, et secouez constamment le plat avec des mouvements circulaires pendant 45 s. Ensuite, retirez immédiatement la lame et faites-la tremper dans de l’eau DI pendant 45 s, rincez à l’eau DI et séchez-la au N₂.
      REMARQUE : Le processus peut être interrompu ici.
   10. Déplacez les glissières dans l’évaporateur à faisceau d’électros. Pompe à 2,7 x ^10-4 Pa (2 x ^10-6 T) ou moins.
   11. Déposez la couche adhésive Ti (10 nm) et Au (100 nm) séquentiellement. La vitesse de dépôt peut varier en fonction de l’évaporateur spécifique utilisé. Une vitesse de dépôt de 0,1 nm/s est recommandée pour obtenir un bon équilibre entre la qualité du dépôt et le temps de traitement.
   12. Retirez l’excès de métal en trempant les lames dans de l’acétone pendant la nuit. Après le trempage, utilisez une pipette pour projeter des jets d’acétone sur la surface de la lame afin de déloger tout excès de métal restant. Les lames d’un quart obtenues après les étapes ci-dessus sont appelées lames d’électrodes OECT.
       REMARQUE : Vous pouvez également utiliser la sonication pour aider à déloger l’excès de métal.
2. PEDOT : Fabrication de canaux PSS
   1. Nettoyez les lames d’électrodes OECT en les rinçant avec de l’acétone, de l’alcool isopropylique et de l’eau DI. Sécher au gaz N₂ .
   2. Faites cuire les lames pendant au moins 5 min à 160 °C. Laissez les lames refroidir avant de les faire tourner.
   3. Spin-coat AZ5209e PR avec 2 étages : d’abord à 500 tr/min, accélération de 100 tr/min pendant 5 s puis accélération à 2000 tr/min, accélération de 1000 tr/min à 45 s.
   4. Cuire dur à 90 °C pendant 150 s.
   5. Démarrez l’exposition initiale avec i-line en mode contact dur pendant 3,5 s à 13 W.
   6. Cuire à l’envers à 110 °C pendant 180 s.
   7. Effectuez l’exposition aux inondations pendant 25 s à 13 W.
   8. Développer avec un révélateur AZ 400K 1:4 pendant 45 s avec une agitation circulaire constante du plat. Ensuite, trempez les lames dans de l’eau DI pendant 45 s, rincez à l’eau DI et séchez-les au N₂.
      REMARQUE : Le processus peut être interrompu ici.
   9. Sonicer la dispersion PEDOT :PSS pendant 5 min en faisant flotter la bouteille sur un bain-marie DI rempli jusqu’à la ligne de remplissage du sonicateur. Filtrez la dispersion PEDOT : PSS à l’aide d’un filtre de 0,22 μm pour éliminer les grumeaux.
   10. Spin-coat PEDOT : PSS à 3500 tr/min avec accélération à 3500 tr/min pendant 60 s. Sécher à 90 °C pendant 15 min.
   11. Retirez l’excès de film PEDOT :PSS en trempant les lames dans de l’acétone pendant 12 min, suivi d’une sonication de 1 min.
   12. Rincez les lames avec de l’acétone puis de l’IPA et séchez-les au sèche-cheveux avec du N₂.
   13. Effectuez un traitement à l’éthylène glycol (EG) en plaçant les lames sur la plaque chauffante à 90 °C, puis déposez suffisamment d’EG pour couvrir tout le PEDOT : PSS pendant 5 min. Rincer à l’eau DI et sécher au N₂. Les lames d’un quart obtenues après les étapes ci-dessus sont appelées lames OECT.
3. Fabrication de la chambre du dispositif PDMS
   1. Fabriquez des feuilles PDMS en mélangeant la base et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1. Couler la solution dans le moule jusqu’à ce qu’elle atteigne une épaisseur de 3 mm et dégazer pendant 1 h dans une chambre de dégazage aux 2 quarts reliée à une pompe à vide.
   2. Durcissez le mélange en plaçant le moule sur un banc nivelé pendant 48 h à température ambiante pour assurer des surfaces PDMS lisses. Couvrez le moule pour éviter la contamination par des débris en suspension dans l’air.
   3. Découpez le PDMS avec des lames de rasoir et créez les chambres de l’appareil et les orifices d’échange de fluide avec des poinçons circulaires d’un diamètre de 5 mm et 1,5 mm, respectivement. Assurez-vous que la hauteur du PDMS est de 3 mm, comme indiqué lors de la coulée du moule (étape 1.3.1)

2. Préparation des supports

1. Autoclave 500 ml d’eau ultrapure, quatre aiguilles de distribution en acier inoxydable, deux bouchons de flacons en caoutchouc (pour les flacons à fond rond de 250 ml), deux flacons à fond rond de 250 ml et une bouteille en verre de 500 ml. Conservez l’eau ultrapure stérile à 4 °C pour une utilisation future.
2. Préparez le milieu basal 2x Shewanella (SBM) amendé avec 2x Wolfe’s Trace Mineral Mix 0,1 % d’acides aminés conformément au tableau 1. Filtrez et stérilisez le milieu dans le fond du média en verre stérile (obtenu à l’étape 2.1) à l’aide d’un filtre sur le dessus de la bouteille. Ce milieu est appelé 2x SBM++, chaque + indiquant l’ajout d’un mélange d’oligo-éléments et d’acides casaminés. Conserver à 4 °C pour une utilisation future.
3. Filtrer stérilement (filtre de 0,22 μm) chacun des produits chimiques suivants séparément : 50 mL de fumarate de sodium 1 M dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL ; 1 mL de kanamycine (KAN) à 2,5 mg/mL, appelée KAN 100x, dans un tube de microcentrifugation stérile. Répartir 1 mL de lactate de sodium stérile à 60 % p/p (utilisé tel quel) dans un tube de microcentrifugation. Conservez toutes les solutions préparées à 4 °C.
4. Préparer séparément 1 mL des produits chimiques suivants dans des tubes de microcentrifugation stériles : 100 mM d’isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), appelé IPTG 100x ; 10 mM de 3-oxohexanoyl-homosérine lactone (OC6), appelée 100x OC6 ; 1 mM de chlorhydrate d’anhydrotétracycline (aTc), appelé 100x aTc. Conserver à 4 °C pour une utilisation future.
5. À l’aide des flacons stérilisés, des capuchons en caoutchouc et des aiguilles préparés à l’étape 2.1, purgez le bouillon de fluide. Répartir 200 ml d’eau stérile 2X SBM++ et d’eau ultrapure dans des flacons à fond rond séparés de 250 ml. Scellez les flacons avec des capuchons en caoutchouc et insérez des aiguilles de distribution stériles pour créer une configuration de lavage de gaz (aiguille d’entrée d’air immergée dans le liquide ; aiguille de sortie de gaz au-dessus de la surface du liquide). Purger avec N₂ pendant 15 min.
6. Transférez le 2x SBM++ purgé et l’eau ultra-pure, le lactate, le fumarate de sodium 1 M, le KAN 100, l’IPTG 100, l’OC6 et l’aTc 100 dans la boîte à gants pour une utilisation ultérieure avec l’OECT.

3. Surveillance de l’EET cellulaire avec des appareils OECT

REMARQUE : Pour assurer l’anaérobie, l’expérience OECT est menée dans une boîte à gants sans contrôle de l’humidité à température ambiante.

1. Jour 1
   1. Stérilisation et préparation du dispositif
      1. Autoclavez les lames OECT, les feuilles PDMS et l’électrode de référence (RE) Ag/AgCl dans des récipients séparés. Sécher par cuisson à 80 °C. Apportez les glissières OECT autoclavées et Ag/AgCl RE dans la boîte à gants.
      2. Désorber l’oxygène piégé dans les feuilles PDMS en le soumettant au vide dans l’antichambre de la boîte à gants pendant 4 h. Assemblez le dispositif OECT en plaçant les feuilles PDMS sur les glissières OECT dans la boîte à gants.
      3. Injectez 45 μL de fluide SBM approprié dans chaque chambre OECT. Pour la plupart des expériences, utilisez 1x SBM++ complété par 20 mM de lactate. Par exemple, préparez 1 ml de 1 SBM++ en mélangeant 500 μL de 2 SBM++, 497 μL d’eau ultrapure stérile et 2,85 μL de lactate de sodium à 60 % p/p.
      4. Couvrez les orifices de la chambre OECT avec des feuilles PDMS pour éviter l’évaporation et la contamination du fluide.
      5. Surveiller le courant du canal OECT I_DS sous une tension de canal constante V_DS de -0,05 V et une tension de grille V_GS de 0,2 V jusqu’à ce que le courant se stabilise. La sélection de la tension peut varier en fonction de l’appareil OECT ou des échantillons biologiques. Utilisez les mêmes tensions de polarisation continues pour la grille et la voie tout au long de la mesure. La stabilisation peut prendre de quelques heures à quelques jours, selon le niveau de vide et la durée de désorption dans l’antichambre.
   2. Cultures cellulaires
      1. Étalez les stocks de cellules (stockées à -80 °C) sur des plaques de gélose contenant LB (pour les souches non hébergeuses de plasmides) ou LB avec 25 μg/mL de kanamycine (pour les souches hébergeant des plasmides) et cultivez en aérobie pendant la nuit à 30 °C^20,23.
2. Jour 2
   1. Préparation cellulaire (cultures aérobies)
      1. Prélever au hasard des colonies uniques dans les plaques de gélose LB (obtenues à l’étape 3.1.2.1) dans 2 mL de 1x SBM++ complété par 20 mM de lactate dans des tubes de culture de 15 mL. Conservez les cellules toute la nuit à 30 °C et à 250 tr/min. Préparez un milieu de croissance de 6 mL sans cellule comme contrôle abiotique qui sera utilisé plus tard dans le lavage cellulaire.
   2. Préparation cellulaire (culture anaérobie)
      1. Transférez les plaques de gélose LB contenant les souches à tester dans la boîte à gants.
      2. Prélever au hasard des colonies isolées sur des plaques de gélose LB dans 1 mL de SBM approprié complété par 20 mM de lactate et 40 mM de fumarate dans des tubes de culture de 15 mL. Par exemple, préparer 1 mL de milieu pour une souche inductible par l’IPTG nécessitant 1 mM d’IPTG et 25 μg/mL de KAN en mélangeant 500 μL de 2x SBM++, 437 μL d’eau ultrapure stérile, 2,85 μL de lactate de sodium à 60 % p/p, 40 mM de fumarate de sodium 1M, 10 μL de 100 mM IPTG et 10 μL de 2,5 mg/mL de KAN.
      3. Maintenir les cellules à 30 °C pendant 18 à 24 h sans agiter. Pour assurer la comparabilité entre les lots d’expériences, maintenez des temps de croissance constants.
3. Jour 3
   1. Mesure électrochimique initiale OECT
      REMARQUE : Le type de caractérisation OECT varie des types statiques, tels que le biais de tension constante, aux types dynamiques, tels que les impulsions de grille. Ici, nous utilisons le test de pas de tension de grille pour obtenir des caractéristiques dynamiques et statiques. La reconfiguration de la connexion électrique entre les OECT et l’instrument (un potentiostat multicanal dans ce cas) est assistée par des cartes de circuits imprimés multiplexes manuels (MUX) personnalisées. Des cartes MUX automatisées peuvent être développées pour des mesures à haut débit.
      1. Mesurez le courant du canal OECT I_DS correspondant au pas de tension de grille de 0 V à 0,2 V avec les réglages décrits ci-dessous (les noms exacts peuvent varier en fonction de l’instrument).
      2. Le canal 1 de l’instrument mesure le courant du canal OECT I_DS. Pour cela, définissez le nom de la technique : Ampérométrie rapide ; Temps d’équilibrage : 1 s ; Tension d’équilibrage : - 0,05 V ; Tension de polarisation : -0,05 V ; Durée : 14 s ; Intervalle d’échantillonnage : 0,5 ms.
      3. Le canal d’instrument 2 contrôle la tension de grille OECT V_GS. Pour cela, définissez le nom de la technique : Mode mixte ; Temps d’état : 1 s ; Tension d’état : 0 V ; Mode Étape 1 : Constante E ; Tension de polarisation de l’étape 1 : 0 V ; Durée de l’étape 1 : 4 s ; Mode étape 2 : E constant ; Tension de polarisation de l’étape 2 : 0,2 V ; Durée de l’étape 2 : 10 s ; Intervalle d’échantillonnage : 0,5 ms.
      4. Répétez l’essai de tension de grille (étapes 3.3.1.1 à 3.3.1.3) pour tous les OECT. Cette étape peut être automatisée pour les tests à haut débit.
      5. Appliquer une tension de canal constante V_DS de -0,05 V et une tension de grille V_GS de 0,2 V à tous les OETC jusqu’à l’inoculation. Assurez-vous que les tensions de polarisation sont les mêmes que celles utilisées lors de la stabilisation de l’appareil (étape 3.1.1.5).
   2. Préparation de l’inoculum (cultures aérobies)
      1. Laver trois fois les cellules en les centrifugant à 1503 x g pendant 4 minutes et en les remettant en suspension dans 1 mL de milieu frais utilisé pour la croissance cellulaire (étape 3.2.1.1). Après le dernier (3^rd) spin, remettre les cellules en suspension dans 0,5 mL (ou la moitié du volume de culture d’origine) pour obtenir une suspension cellulaire concentrée à OD₆₀₀ de 1 à 3,5. Ajustez le volume final de la suspension en conséquence.
      2. Transférez la suspension cellulaire dans la boîte à gants.
      3. Pour obtenir l’inoculum, diluez les cellules à une OD₆₀₀ de 0,1 (ou 10x l’OD d’inoculation₆₀₀). Le milieu d’illusion a la même constitution que le milieu de croissance, mais préparez-le frais dans la boîte à gants avec des stocks de médias purgés. Par exemple, si des cellules ont été cultivées en aérobie dans du SBM++ supplémenté en lactate, préparez du SBM++ frais enrichi en lactate dans la boîte à gants pour la dilution de l’inoculum.
      4. Arrêtez le potentiostat. Injecter 5 μL de l’inoculum dans la chambre OECT (contenant 45 μL de SBM approprié) pour obtenir une DO_{finale de 600} de 0,01 dans l’OECT. Couvrez les orifices de la chambre OECT avec des feuilles PDMS pour éviter l’évaporation et la contamination du fluide.
   3. Préparation de l’inoculum (cultures anaérobies)
      1. Pour obtenir l’inoculum, diluez 10 fois les cultures cellulaires. Utilisez un milieu de délire qui a la même constitution que le milieu de croissance mais qui n’a pas de fumarate. Par exemple, si des cellules ont été cultivées en anaérobie dans du SBM++ complété par du lactate, du fumarate, du KAN et de l’IPTG, préparez du SBM++ frais complété par du lactate, du KAN et de l’IPTG dans la boîte à gants pour la dilution de l’inoculum.
      2. Arrêtez le potentiostat. Injecter 5 μL de l’inoculum dans la chambre OECT (contenant 45 μL de SBM approprié). Couvrez les orifices de la chambre OECT avec des feuilles PDMS pour éviter l’évaporation et la contamination du fluide.
   4. Mesure continue et points temporels
      1. Appliquer des tensions de polarisation constantes aux voies OECT (V_DS = -0,05 V) et à la grille (V_GS = 0,2 V) tout au long de l’expérience, sauf pendant les mesures ponctuelles lorsque le potentiostat est connecté à des OETC individuels pour la caractérisation.
      2. Exécutez l’expérience pendant 24 heures après l’inoculation. Considérez la mesure avant l’inoculation (voir l’étape 3.3.1) comme le point de temps 0 h.
      3. Des changements significatifs dans l’état de dopage du canal OECT se produisent généralement au cours des 8 premières heures. Sélectionnez 5 à 7 points temporels pour les mesures pendant cette période, suivis d’une mesure entre 12 h et 16 h, et du dernier point temporel à la marque 24 h. Des exemples de points temporels pourraient inclure immédiatement après l’inoculation et à 1 h, 2 h, 3 h, 4,5 h, 6 h, 8 h, 18 h et 24 h après l’inoculation.
      4. Pour éviter les mesures tard dans la nuit, commencez l’inoculation (voir l’étape 3.3.2 ou 3.3.3) tôt dans la journée pour tenir compte des mesures ponctuelles fréquentes au cours des 8 premières heures.
      5. Répétez l’étape décrite à la section 3.3.1 pour chaque mesure de point temporel.
4. Jour 4
   1. Mesure de la courbe de transfert au dernier point temporel (24 h)
      1. Insérez l’ER Ag/AgCl dans la chambre OECT en tournant et en poussant doucement l’ER à travers l’orifice d’échange de fluide.
      2. Mesurez les courbes de transfert de l’OECT en balayant la tension de grille de -0,1 V à 0,6 V tout en surveillant le courant de canal I_DS avec une polarisation constante V_DS à -0,05 V. Mesurez avec précision les potentiels de grille et d’électrode source par rapport à l’EnR Ag/AgCl.
      3. Configurez l’instrument comme décrit ci-dessous (les noms exacts peuvent varier en fonction de l’instrument).
      4. La voie 1 de l’instrument mesure le courant de la voie OECT I_DS, utilisez le réglage suivant : Nom de la technique : Chronoampérométrie (CA), Temps d’équilibrage : 5 s, Tension d’équilibrage : - 0,05 V, Tension de polarisation : -0,05 V, Temps de fonctionnement : 35 s, Intervalle d’échantillonnage : 0,09915 s.
      5. Le canal d’instrument 2 contrôle la tension de grille OECT V_GS, utilisez le réglage suivant : Nom de la technique : Voltampérométrie à balayage linéaire (LSV), Temps d’équilibrage : 5 s, Tension d’équilibrage : - 0,1 V, Tension de départ : -0,1 V, Tension de fin : 0,6 V, Pas de tension : 0,002 V, Vitesse de balayage : 0,02 V/s.
      6. La voie 3 de l’instrument mesure le potentiel de la source OECT_{V S} contre Ag/AgCl RE, utilisez le réglage suivant : Nom de la technique : Potentiométrie en circuit ouvert (OCP), Durée de fonctionnement : 40 s, Intervalle d’échantillonnage : 0,09915 s.
      7. Le canal 4 de l’instrument mesure le potentiel de grille OECT V_G contre Ag/AgCl RE, utilisez le réglage suivant : Nom de la technique : Potentiométrie en circuit ouvert (OCP), Durée de fonctionnement : 40 s, Intervalle d’échantillonnage : 0,09915 s.
      8. Répétez la mesure de la courbe de transfert pour tous les OECT. Après chaque mesure, rincez l’électrode de référence (RE) Ag/AgCl avec de l’éthanol à 70 % et essuyez-la avec une nouvelle serviette peu pelucheuse. L’ERP Ag/AgCl peut être réutilisé au sein du même groupe d’échantillons pour les triplets, mais ne doit pas être réutilisé entre différents groupes d’échantillons.

4. Analyse des données

1. Extraction de données
   1. Utilisez du code MATLAB personnalisé pour le traitement des données afin d’automatiser l’extraction et l’enregistrement des données à partir du logiciel natif de l’instrument, réduisant ainsi considérablement le temps de traitement. Les scripts MATLAB sont disponibles dans le Texas Data Repository (https://doi.org/10.18738/T8/MNKO8D).
2. Traitement des données
   1. Ajustez les données_DS du courant I du canal OECT pour obtenir les constantes de vitesse k à des fins d’analyse et de comparaison plus approfondies (Figure 3). Pour les échantillons de cellules compatibles EET, nous trouvons que le modèle exponentiel unique offre le meilleur ajustement. Par conséquent, nous avons utilisé le modèle de décroissance exponentielle monophasée dans un logiciel d’analyse pour ajuster les données de la série chronologique I_DS et obtenir la constante de vitesse k ajustée. Ces données de série chronologique I_DS peuvent être la valeur brute ou normalisées au point de temps 0 h, car la constante de vitesse k reflète le taux de variation plutôt que les valeurs absolues.
   2. Obtenez le_{I DS} normalisé en divisant les valeurs I_DS par la valeur de point de temps 0 h (I_DS0), appelée I_DS/I_DS0.
3. Détermination de la constante de vitesse k
   1. Ouvrez le logiciel d’analyse (Prism 10, GraphPad) et créez un nouveau projet en cliquant sur Fichier > Nouveau > Nouveau fichier de projet. Sous l’onglet Créer, choisissez XY. Dans la section Options, définissez X sur Nombres et Y sur Entrée, puis tracez une seule valeur Y pour chaque point.
   2. Importez_{les données DS} du canal OECT current I dans la table. Ajustez les données I_DS avec le modèle de décroissance exponentielle monophasée en cliquant sur Analyser dans l’onglet Analyse. Trouvez la méthode de régression non linéaire (ajustement de courbe) dans les analyses XY. Assurez-vous de sélectionner Tous les ensembles de données qui doivent être ajustés sur la droite, puis cliquez sur OK.
   3. Dans la nouvelle fenêtre Paramètres, sélectionnez Modèle de décroissance d’une phase dans le groupe Exponentiel, puis cliquez sur OK. L’équation du modèle est la suivante :
      Y=(Y0 - Plateau)*^e-k*X + Plateau
      Où : Y est le courant I_DS du canal OECT, T est le temps, k est la constante de vitesse.
   4. Une fois les valeurs k obtenues, vérifiez la qualité de l’ajustement en vérifiant la valeur R au carré pour chaque ajustement. Un bon ajustement doit avoir un R² supérieur à 0,95.
4. Test t de Student bilatéral non apparié
   1. Pour évaluer la signification statistique entre les groupes d’échantillons, effectuez des tests t d’étudiant bilatéraux non appariés.
   2. Ouvrez le logiciel d’analyse et créez un nouveau projet en cliquant sur Fichier > Nouveau > Nouveau fichier de projet. Sous l’onglet Créer, choisissez XY. Dans la section Options, définissez X sur Nombres et Y sur Entrer 3 valeurs de réplication dans des sous-colonnes côte à côte.
   3. Importez les valeurs k de la constante de vitesse ajustée dans la table. Effectuez le test t en cliquant sur Analyser dans l’onglet Analyse. Retrouvez la méthode du test t (et des tests non paramétriques) dans Analyses de colonnes. Assurez-vous de sélectionner Deux ensembles de données à chaque fois, puis cliquez sur OK.
   4. Dans le manuel de conception expérimentale, sélectionnez Non apparié, Oui. Utilisez le test paramétrique et le test t non apparié. Supposons que les deux populations aient les mêmes options d’écart-type. Les valeurs p seront générées pour chaque comparaison. Sur les figures, les valeurs p sont représentées comme suit : n.s. : p > 0,05 (non significatif), * : p ≤ 0,05, ** : p ≤ 0,01, *** : p ≤ 0,001, **** : p ≤ 0,0001.
   5. Répétez les étapes 4.4.3 à 4.4.4 pour tous les ensembles de données pertinents.

5. Nettoyage et réutilisation de l’appareil OECT

1. Après l’expérience, démontez l’appareil et faites bouillir les lames OECT dans de l’eau savonneuse (1:10, savon : eau DI) pendant 15 min.
2. Déplacez rapidement les lames dans un bécher contenant de l’eau DI à température ambiante et attendez 5 min pour que les lames refroidissent. Rincez les lames avec du DI et séchez-les à l’air pur.
3. Mesurez la résistance du canal OECT à l’aide d’un multimètre. Si la résistance du canal est inférieure à 400 % de la valeur d’origine, le dispositif peut être réutilisé pour l’expérience après la stérilisation (étape 3.1.1). Les glissières OECT peuvent également être nettoyées à l’aide des étapes suivantes et conviennent à la fabrication de canaux à l’étape 1.2.
   ATTENTION : La solution de piranha est très corrosive et peut générer une chaleur importante. Utilisez toujours un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris des gants, des lunettes de protection et une blouse de laboratoire. Manipulez avec une extrême prudence et obéissez aux directives de sécurité de l’établissement.
4. Préparez la solution de piranha dans une hotte bien ventilée. Ajoutez soigneusement et lentement 30 % (p/p) de peroxyde d’hydrogène à 98 % d’acide sulfurique dans un rapport de 1:4 tout en remuant en inclinant doucement le plat de cristallisation d’avant en arrière.
5. Placez le plat de cristallisation sur une plaque chauffante chauffée à 70 °C. À l’aide d’une pince à épiler, apportez et immergez les lames dans une solution de piranha pendant 1 min.
6. Transférez délicatement les lames dans un bécher contenant de l’eau DI et laissez-les reposer pendant au moins 1 min. Rincez abondamment les lames à l’eau DI et séchez-les au sèche-cheveux à l’air.
7. Éliminez la solution de piranha conformément aux directives institutionnelles d’élimination des déchets chimiques. Neutralisez la solution de piranha en l’ajoutant lentement dans un bécher contenant un mélange d’eau glacée d’environ 4 fois le volume de la solution. Ajouter graduellement un agent neutralisant (p. ex., 10 M de NaOH) tout en surveillant le pH à l’aide de bandelettes réactives jusqu’à ce qu’il soit neutre.

Résultats

Constante de vitesse ajustée k
La constante de vitesse ajustée k du courant du canal OECT I_DS sert de mesure fiable pour évaluer l’activité EET de l’échantillon. Alors que les tensions de polarisation de grille constantes affecteraient les constantes de vitesse, nous choisissons 0,2 V pour assurer une polarisation positive afin d’encourager le transfert d’électrons bactériens tout en évitant le dédopage rapi...

Discussion

Comparaison des cellules électrochimiques (EC)
L’un des principaux avantages de l’ajustement de la constante de vitesse à partir du courant du canal OECT est qu’il minimise la variation du dispositif en se concentrant sur la dynamique sous-jacente des changements de_{I DS} plutôt que sur la sortie brute. Combinée à la capacité d’amplification du signal inhérente aux OECT, cette approche améliore la robustesse des systèmes OECT hybrides par rap...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-oxohexanoyl-homoserine lactone	Sigma-Aldrich
anhydrotetracycline hydrochloride	VWR
casamino acids	VWR
Equipment
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich		anhydrous 99.8%,
HEPES buffer solution	VWR		1 M in water, pH = 7.3
isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside	Teknova
kanamycin sulfate	Growcells
Magnesium(II) sulfate heptahydrate	VWR
PEDOT:PSS aqueous suspension	Heraeus Epurio LLC	Clevios PH1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich
Potentiostat	PalmSens BV	MultiPalmSens4
Quartz microscopic slides	AdValue	FQ-S-003
Quartz microscopic slides
Sodium chloride	VWR
Sodium DL-lactate	TCI		60% in water
Sodium fumarate	VWR		98%
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich		95.0%-98.0%
Two-part silicone elastomer	Electron Microscopy Sciences	Sylgard184
Wolfe's Trace Mineral Mix	ATCC