有機電気化学トランジスタによる細胞外電子移動活性の翻訳

要約

ここでは、有機電気化学トランジスタ(OECT)を使用して、 Shewanella oneidensis の細胞外電子移動(EET)活性を電気信号に変換するためのプロトコルを紹介します。ハイブリッドOECTシステムは、堅牢性、感度が向上し、迅速でハイスループットなテストが可能になるため、EET測定に効果的なツールとなります。

要約

細胞外電子移動(EET)は、特定の微生物が細胞膜を越えて外部電子受容体に電子を移動させ、細胞代謝を環境に関連付けることができるプロセスです。 Geobacter と Shewanella はEET研究の主要なモデルでしたが、新たな研究では、EET活性種が発酵とヒトの腸内細菌叢にも関連していることが明らかになっています。EETの生物学的システムと電子システムの橋渡し能力を活用して、有機電気化学トランジスタ(OECT)を使用して微生物EETの活性を簡単に検出可能な電気信号に変換するためのプロトコルを提示します。このシステムは、バイオセンシングおよびバイオコンピューティングアプリケーションのための外部刺激に対する細胞応答の使用を可能にします。具体的には、p型ポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)の脱ドーピングを実証しました:OECTのポリ(スチレンスルホン酸)(PEDOT:PSS)チャネルは、 Shewanella oneidensisの細胞EETによって駆動されます。遺伝子回路によりEETフラックスを転写制御することにより、このハイブリッドOECTシステムのバイオセンシング能力を確立し、誘導分子などの化学刺激を検出します。さらに、プラスミドベースのブール論理ゲートを細胞内に導入することで、環境信号を処理し、OECTの電流変化を駆動できるようにすることで、これらのデバイスのバイオコンピューティングの可能性をさらに実証しています。この方法は、生物学的システムとエレクトロニクスの間の新しいインターフェースを提供し、将来のハイスループットスクリーニング、バイオセンシング、およびバイオコンピューティングアプリケーションを可能にします。

概要

生物学的および化学的活動を電気信号に変換および増幅できるデバイスは、センシング^1,2、ニューロモルフィックコンピューティング^3,4、ウェアラブルエレクトロニクス⁵など、さまざまな分野で重要です。これらの中で、有機電気化学トランジスタ(OECT)は、水性環境との適合性と低い動作電圧^6,7により、生物学的システムと電子読み出しとの間の優れたインターフェースとして浮上しています。OECTは、電解質中のイオンを利用して有機チャネルの導電率を調節し、イオン輸送と電子輸送を結合して優れた相互コンダクタンスを達成するという点で、従来のエレクトロニクスとは異なります⁸。これらの特性により、OECTは、弱い生体信号を増幅して電気的読み出しに変換できるため、生体システムと電子機器のインターフェースに最適です。

OECTは、イオン拡散を介して混合イオン-電子伝導チャネルのドーピング状態を変化させることによって動作し、通常はゲート電極に電圧を印加することによって制御されます。しかし、生物学的反応や酸化還元反応によってチャネルの伝導性が変化することもあるため、OECTはさまざまな化学的および生物学的刺激に応答することができます。OECTを脂質二重膜、イオンチャネル、または生体分子で官能基化することで、特定の分析物を検出できるため、センシングアプリケーションに役立ちます^9,10。例えば、OECTは、グルコースオキシダーゼのような酸化還元活性酵素と統合され、電子を直接チャネルに伝達し、グルコース濃度に応答してチャネルの導電率を調整しています¹¹。このような構成はバイオセンシングには効果的ですが、個々の酵素やタンパク質の挙動が比較的単純なため、計算能力には限界があります。

対照的に、生細胞、特に細菌は、複雑でロバス^トな計算を実行できる汎用性の高いプラットフォームを提供する4,12,13,14,15。Shewanella oneidensisやGeobacter sulfurreducensなどの電気活性細菌は、細胞外電子移動(EET)として知られるプロセスで細胞膜を越えて電子を移動させる独自の能力を持っています。嫌気性条件下では、これらの細菌は、金属、金属酸化物、導電性^{ポリマー16}やナノ粒子¹⁷などの合成材料を含む外部電子受容体の還元または酸化に代謝プロセスを結合します(図1A)。この能力は、発電用の微生物燃料電池で利用されており、より高度なバイオエレクトロニクスアプリケーション^{の可能性を提供しています18,19}。さらに、合成生物学の進歩により、電気活性細菌の正確な遺伝子操作が可能になり、EET経路を制御することが可能になりました。EET関連遺伝子の発現を調節する遺伝子回路を工学的に操作することにより、研究者は特定の環境手がかりや計算論理操作に応答して電子フラックスを調節することができる^20,21。EETに対するこの遺伝的制御は、細菌の計算がOECTなどの電子デバイスと直接インターフェースされるバイオハイブリッドシステムを作成するための道を開きます。例えば、細菌の遺伝回路は、化学物質のインプットの組み合わせに応答するように設計し、EET経路をオンまたはオフにして、OECTチャネルの導電率を調節することができます。これにより、細菌の計算を直接電気的に読み取ることができ、蛍光灯やその他の従来の生物学的レポーターの必要性を回避できます。

近年の進歩により、OECTと電気活性細菌を結合させる可能性が実証されています。例えば、Méhesらは、S. oneidensisを使用して、p型OECTによるリアルタイムのEET活性をモニターし、細菌の代謝を電気的に追跡する方法を示した²²。この研究は、OECTを使用して細菌の活動を検出する可能性を強調していますが、バイオセンシングとバイオコンピューティングのハイブリッドシステムの可能性はまだ十分に調査されていません。これに対処するために、私たちは最近、遺伝子操作されたS.oneidensisをp型OECTs23に組み込んだハイブリッドトランジスタを開発しました。その結果、OECTチャネルは細菌のEET活性によって脱ドープできることが示されました(図1B)。バイオセンシング能力をさらに強化し、脱ドーピングプロセスに関するメカニズムの洞察を得るために、EETフラックスを調節する遺伝子回路を持つS.oneidensis株を設計しました。これにより、誘導分子などの環境手がかりに応答して、OECT出力が予測可能に変化します。さらに、これらの遺伝的回路にブール論理を統合することで、複雑な細菌計算の直接的な電気的読み出しを可能にしました。

ここでは、ハイブリッドトランジスタ操作の包括的なプロトコルについて、デバイスの作製、細胞培養の準備、測定手順、およびデータ解析を網羅しています。さらに、デバイスのクリーニング、再利用性、ハイスループットテストの自動化の可能性などの重要な考慮事項にも取り組みます。

プロトコル

注:すべての化学物質は、それ以上の精製を行わずに受け取ったままに使用しました。指定されていない場合は、分析グレードの化学物質を使用しました。

1. OECTデバイスの作製

注:OECTは、以前の研究²⁴から適応された標準的な微細加工技術を使用して、石英顕微鏡スライド上に製造されます。 図2Aに示すように、8つのOETデバイスが1つの標準スライドに配置されています。スライド上にプレカットされたポリジメチルシロキサン(PDMS)シートを載せ、OECTチャンバーとアクセスポートを形成します。OECTチャネルとゲート電極には、p型導電性ポリマーポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン):ポリ(スチレンスルホン酸)(PEDOT:PSS)が使用されており、チャネルの寸法は150 μm x 10 μm、ゲートチップの寸法は500 μm x 500 μmです( 図2B)。OECTチャネルの製造とデバイスの組み立てプロセスの概要を 図2Cに示します。

1. 金電極の製造
   1. クォーツスライドは、アセトン、イソプロピルアルコール(IPA)、脱イオン水(DI)ですすいで洗浄します。N2ガスでブロードライします。
   2. 150 W で 50 sccm で O₂ プラズマクリーニングを 120 秒間実行します。
   3. スピンコートAZ5209eフォトレジスト(PR)は、500 rpm、100 rpm/s加速5秒、2000 rpm、1000 rpm/s加速45秒の2段階です。
   4. 90°Cで150秒間ハードベークします。
   5. マスクアライナー(Suss MA6)をオンにし、UVソースとしてiライン(365 nm)を選択し、パラメータを設定します:露光時間を3.5秒(13 W)、15 μmのアライメントギャップ、WECタイプを接触に設定します。露出タイプはハードです。
   6. リソグラフィーマスクとスライドをアライナーにセットし、スライドをマスクに合わせ、初期露光を行います。
   7. 110°Cで180秒間リバースベークします。
   8. リソグラフィーマスクを取り外し、次のパラメーターでフラッドエクスポージャーを実行します:露光時間を25秒(13 W)、露光タイプをフラッドEとして。
   9. メーカーが事前に希釈したAZ 400K 1:4現像液を使用してPRを開発します。適量の現像液を結晶化皿に注ぎ、スライドを沈め、皿を円運動で45秒間絶えず振とうします。その後、すぐにスライドを取り外してDI水に45秒間浸し、DI水ですすぎ、_N2でブロードライします。
      注: ここでプロセスを一時停止できます。
   10. スライドを電子ビーム蒸発器に移動します。2.7 x ^10-4 Pa(2 x ^10-6 T)以下にポンプで送液します。
   11. Ti接着剤層(10 nm)とAu(100 nm)を順番に堆積します。蒸着速度は、使用する特定の蒸発器によって異なる場合があります。成膜品質と処理時間の良好なバランスを達成するために、0.1 nm/sの成膜速度が推奨されます。
   12. スライドをアセトンに一晩浸して、余分な金属を取り除きます。浸漬後、ピペットを使用してスライド表面にアセトンストリームを噴射し、残っている余分な金属を取り除きます。上記の手順の後に得られるクォートスライドは、OECT電極スライドと呼ばれます。
       注:あるいは、過剰な金属を取り除くのを助けるために超音波処理を使用してください。
2. PEDOT:PSSチャネル製造
   1. OET電極スライドは、アセトン、IPA、およびDI水ですすいで洗浄します。N2ガスでブロードライします。
   2. スライドを160°Cで少なくとも5分間焼きます。 スピンコーティングする前に、スライドを冷ましてください。
   3. スピンコートAZ5209e PRは2段階あり:最初に500rpmで、100rpm/sで5秒間加速し、続いて45秒で2000rpm、1000rpm/sの加速。
   4. 90°Cで150秒間ハードベークします。
   5. i-lineをハードコンタクトモードで13Wで3.5秒間初期露光を開始します。
   6. 110°Cで180秒間リバースベークします。
   7. 13 Wで25秒間洪水にさらされます。
   8. AZ 400K 1:4現像液を使用して、皿を一定に円形に振る45秒間開発します。次に、スライドを脱イオン水に45秒間浸し、脱イオン水ですすぎ、_N2でブロードライします。
      注: ここでプロセスを一時停止できます。
   9. PEDOTを超音波処理します:PSS分散液を、ソニケーターの充填ラインまで充填されたDIウォーターバス上にボトルを浮かべて5分間加熱します。PEDOT:PSS分散液を0.22μmフィルターでろ過し、凝集物を除去します。
   10. スピンコートPEDOT:3500rpmでPSS、3500rpm/sで60秒間加速。90°Cで15分間乾燥させます。
   11. スライドをアセトンに12分間浸し、続いて1分間超音波処理することにより、過剰なPEDOT:PSSフィルムを除去します。
   12. スライドをアセトン、次にIPAですすぎ、N₂でブロードライします。
   13. エチレングリコール(EG)処理を行うには、スライドを90°Cのホットプレートの上に置き、その後、すべてのPEDOT:PSSを覆うのに十分なEGを5分間滴下します。脱イオン水ですすぎ、_N2でブロードライします。上記の手順の後に得られるクォートスライドは、OECTスライドと呼ばれます。
3. PDMSデバイスチャンバーの作製
   1. ベースと硬化剤を10:1の割合で混合してPDMSシートを作成します。溶液を金型に鋳造して厚さ3mmにし、真空ポンプに接続された2/4の脱気チャンバーで1時間脱気します。
   2. 混合物を硬化させるには、金型を水平なベンチに室温で48時間置き、PDMS表面を滑らかにします。空気中の破片による汚染を避けるために、金型を覆います。
   3. かみそりの刃でPDMSを切り取り、直径5mmと1.5mmの円形穴パンチを備えたデバイスチャンバーと流体交換ポートを作成します。PDMSの高さが、金型鋳造中に制御された3 mmであることを確認します(ステップ1.3.1)

2. 培地の準備

1. オートクレーブ500mLの超純水、ステンレス製分注針4本、ゴム製フラスコキャップ2個(250mL丸底フラスコ用)、250mL丸底フラスコ2個、500mLガラス製培地ボトル1本。滅菌超純水は、将来の使用のために4°Cで保存してください。
2. 表1に従って、2x Wolfe's Trace Mineral Mix 0.1%カサミノ酸で修正した2x Shewanella基礎培地(SBM)を調製します。ボトルトップフィルターを使用して、培地を滅菌ガラス培地の底(ステップ2.1で取得)に滅菌します。この培地は2x SBM ++と呼ばれ、各+は微量ミネラルミックスとカサミノ酸の添加を示します。将来の使用のために4°Cで保管してください。
3. 滅菌済み(0.22μmフィルター)以下の化学物質をそれぞれ別々にろ過します:50mLの1Mフマル酸ナトリウムを滅菌済みの50mL遠心分離チューブに入れます。1 mL の 2.5 mg/mL カナマイシン(KAN)(100x KAN と呼ばれる)を滅菌マイクロ遠心チューブに入れます。1 mLの60%w / w滅菌乳酸ナトリウム(受け取ったとおりに使用)を微量遠心チューブに割り当てます。.調製した溶液はすべて4°Cで保存します。
4. 滅菌マイクロ遠心チューブに以下の化学物質1 mLを別途調製します:100 mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)、100x IPTGと呼ばれる。10 mM 3-オキソヘキサノイル-ホモセリンラクトン(OC6)、100x OC6と呼ばれる;1 mM アンヒドロテトラサイクリン塩酸塩 (aTc)、100x aTc と呼ばれます。将来の使用のために4°Cで保管してください。
5. ステップ2.1で調製した滅菌フラスコ、ゴムキャップ、針を使用して、培地ストックをパージします。滅菌済みの2X SBM++水と超純水をそれぞれ200 mLずつ、別々の250 mL丸底フラスコに割り付けます。フラスコをゴム製のキャップで密封し、滅菌ディスペンシングニードルを挿入してガス洗浄セットアップを作成します(空気入口ニードルを液体に沈め、ガス出口ニードルを液体表面の上に置きます)。N₂ で15分間パージします。
6. パージした2x SBM++と超純水、乳酸、1 Mフマル酸ナトリウム、100x KAN、100x IPTG、100x OC6、および100x aTcをグローブボックスに移し、OECTでさらに使用します。

3. OETデバイスによるセルラーEETの監視

注:嫌気性を確保するために、OECT実験は室温で湿度制御されていないグローブボックスで行われます。

1. 1日目
   1. デバイスの滅菌と調製
      1. OECTスライド、PDMSシート、およびAg/AgCl参照電極(RE)を別々の容器にオートクレーブします。80°Cで焼いて乾燥させます。 オートクレーブ処理したOECTスライドとAg/AgCl REをグローブボックスに取り込みます。
      2. PDMSシートに閉じ込められた酸素を、グローブボックスの控え室で4時間真空にさらすことにより脱着します。グローブボックス内のOETスライドの上にPDMSシートを置いて、OETデバイスを組み立てます。
      3. 45 μLの適切なSBM培地を各OECTチャンバーに注入します。ほとんどの実験では、20 mMの乳酸を添加した1x SBM++を使用します。例えば、500 μLの2x SBM++、497 μLの滅菌超純水、および2.85 μLの60% w/w乳酸ナトリウムを混合して、1x SBM++を1 mL調製します。
      4. OECTチャンバーポートをPDMSシートで覆い、媒体の蒸発や汚染を防ぎます。
      5. OECTチャネル電流I_DS を、-0.05Vの一定チャネル電圧_VDS 、0.2Vのゲート電圧_VGS で、電流が安定するまで監視します。電圧の選択は、OECTデバイスまたは生物学的サンプルによって異なります。測定全体を通して、ゲートとチャンネルに同じ連続バイアス電圧を使用します。安定化には、アンテチャンバー内の真空レベルと脱着時間に応じて、数時間から数日かかる場合があります。
   2. 細胞培養
      1. LB(非プラスミド保有株の場合)または25 μg/mLカナマイシンを含むLB(プラスミド保有株の場合)を含む寒天プレートにストリーク細胞ストック(-80°Cで保存)し、30°Cで一晩^20,23に好気的に増殖します。
2. 2日目
   1. 細胞調製(好気性培養)
      1. 15 mL培養チューブに20 mM乳酸を添加した1x SBM++の2 mL中のLB寒天プレート(ステップ3.1.2.1で取得)から単一コロニーをランダムに選択します。細胞を30°C、250rpmで一晩放置します。アバイオティクスコントロールとして細胞を含まない6 mLの増殖培地を調製し、後で細胞洗浄に使用します。
   2. 細胞調製(嫌気性培養)
      1. 試験する菌株を含むLB寒天プレートをグローブボックスに移します。
      2. 15 mLの培養チューブに20 mMの乳酸と40 mMのフマル酸塩を添加した適切なSBM1 mLのLB寒天プレートから単一コロニーをランダムに選択します。例えば、500 μL の 2x SBM++、437 μL の滅菌超純水、2.85 μL の 60% w/w 乳酸ナトリウム、40 mM の 1 M フマル酸ナトリウム、100 mM IPTG 10 μL、100 mg/mL KAN 10 μL を混合して、1 mM IPTG と 25 μg/mL の KAN を必要とする IPTG 誘導株用の 1 mL の培地を調製します。
      3. 細胞を振とうせずに30°Cで18〜24時間保持します。実験バッチ間での比較可能性を確保するには、一貫した増殖時間を維持します。
3. 3日目
   1. 初期OECT電気化学測定
      注:OECT特性評価のタイプは、定電圧バイアスなどの静的タイプから、ゲートパルスなどの動的タイプまでさまざまです。ここでは、ゲート電圧ステップテストを使用して、動的特性と静的特性の両方を取得します。OECTと機器(この場合はマルチチャンネルポテンショスタット)間の電気的接続の再構成は、カスタマイズされた手動マルチプレックス(MUX)回路基板によって支援されます。自動MUXボードは、ハイスループット測定用に開発できます。
      1. 0 Vから0.2 Vまでのゲート電圧ステップに対応するOECTチャンネル電流I_DS を、以下の設定で測定します(正確な名前は機器によって異なる場合があります)。
      2. 計測器チャンネル1は、OECTチャンネル電流I_DSを計測します。このためには、テクニック名を高速アンペロメトリーに設定します。平衡化時間:1秒;平衡電圧:-0.05 V;バイアス電圧:-0.05 V;実行時間:14秒。サンプル間隔:0.5ms。
      3. 計器チャンネル2は、OECTゲート電圧V_GSを制御します。このためには、テクニック名を混合モードに設定します。コンディション時間:1秒;状態電圧:0 V;ステージ1モード:定数E;ステージ1バイアス電圧:0V;ステージ 1 の実行時間: 4 秒。ステージ2モード:定数E;ステージ2バイアス電圧:0.2V;ステージ 2 の実行時間: 10 秒。サンプル間隔:0.5ms。
      4. すべての OECT に対して、ゲート電圧ステップ テスト (ステップ 3.3.1.1 から 3.3.1.3) を繰り返します。この手順は、ハイスループットテストのために自動化できます。
      5. 接種まで、すべてのOECTに-0.05Vの定チャネル電圧_VDS 、0.2Vのゲート電圧_VGS を印加します。バイアス電圧が、デバイスの安定化中に使用される電圧と同じであることを確認します(ステップ3.1.1.5)。
   2. 接種物調製(好気性培養)
      1. 1503 x g で4分間遠心分離し、細胞増殖に使用した1 mLの新鮮な培地に再懸濁して、細胞をトリプルウォッシュします(ステップ3.2.1.1)。最後(3^回目)のスピン後、細胞を0.5 mL(または元の培養量の半分)に再懸濁して、OD₆₀₀ 1 - 3.5の濃縮細胞懸濁液を得ます。それに応じて最終的なサスペンションのボリュームを調整します。
      2. 細胞懸濁液をグローブボックスに移します。
      3. 接種物を得るためには、細胞を意図されたOD₆₀₀ の0.1(または接種_OD600の10倍)に希釈する。妄想培地は成長培地と同じ体質ですが、パージされた培地ストックと一緒にグローブボックスで新鮮に準備します。例えば、乳酸を添加したSBM++で細胞を好気的に増殖させた場合は、乳酸を添加した新鮮なSBM++をグローブボックスで調製し、接種希釈液として調製します。
      4. ポテンショスタットを停止します。5 μL の接種材料を OECT チャンバー (45 μL の適切な SBM を含む) に注入して、OECT で 0.01 の最終 OD₆₀₀ を達成します。OECTチャンバーポートをPDMSシートで覆い、媒体の蒸発や汚染を防ぎます。
   3. 接種物調製(嫌気性培養)
      1. 接種物を得るためには、細胞培養物を10倍に希釈します。成長培地と同じ体質であるが、フマル酸塩が不足している妄想培地を使用してください。例えば、乳酸、フマル酸、KAN、およびIPTGを添加したSBM++で細胞を嫌気的に増殖させた場合は、乳酸、KAN、およびIPTGを添加した新鮮なSBM++をグローブボックスに調製し、接種希釈液を調製します。
      2. ポテンショスタットを停止します。接種材料 5 μL を OECT チャンバー (適切な SBM 45 μL を含む) に注入します。OECTチャンバーポートをPDMSシートで覆い、媒体の蒸発や汚染を防ぎます。
   4. 連続測定とタイムポイント
      1. 実験全体を通して、OECTチャネル_(VDS = -0.05 V)とゲート(V_GS = 0.2 V)に一定のバイアス電圧を印加します。ただし、ポテンショスタットが特性評価のために個々のOECTに接続されているタイムポイント測定中を除きます。
      2. 接種後24時間実験を行います。接種前の測定値(ステップ3.3.1を参照)を0時間の時点と考えてください。
      3. OECTチャネルのドーピング状態の大幅な変化は、通常、最初の8時間の間に発生します。この期間中の測定には 5 〜 7 個の時点を選択し、その後 12 時間から 16 時間の間に 1 回測定し、最終時点を 24 時間マークにします。例えば、接種直後や接種後1時間、2時間後、3時間後、4.5時間後、6時間後、8時間後、18時間後、24時間後などの時点が挙げられます。
      4. 深夜の測定を避けるために、接種をその日の早い時間に開始し(ステップ3.3.2または3.3.3を参照)、最初の8時間の間に頻繁な時点測定に対応します。
      5. 3.3.1 で概説した手順を、各タイムポイント測定について繰り返します。
4. 4日目
   1. 最後の時点(24時間)での転送曲線測定
      1. Ag/AgCl REをOECTチャンバーに挿入し、REを静かにねじって流体交換ポートに通します。
      2. ゲート電圧を-0.1Vから0.6VにスイープしてOECTの伝達曲線を測定し、チャネル電流I_DS を-0.05Vで一定バイアスV_DS で監視します。Ag/AgCl REに対するゲート電極とソース電極の電位を正確に測定します。
      3. 以下の説明に従って機器を設定します(正確な名前は機器によって異なる場合があります)。
      4. 機器チャンネル1はOECTチャンネル電流I DSを測定し_、 次の設定を使用します:技術名:クロノアンペロメトリー(CA)、平衡化時間:5秒、平衡電圧:-0.05 V、バイアス電圧:-0.05 V、実行時間:35秒、サンプル間隔:0.09915秒。
      5. 機器チャンネル2はOECTゲート電圧V_GSを制御し、次の設定を使用します:技術名:リニアスイープボルタンメトリー(LSV)、平衡化時間:5秒、平衡電圧:-0.1V、開始電圧:-0.1V、終了電圧:0.6V、電圧ステップ:0.002V、スキャンレート:0.02V/秒。
      6. 装置チャンネル3は、Ag/AgCl_RE に対するOECTソース電位VSを測定し、次の設定を使用します:技術名:開回路ポテンショメトリー(OCP)、実行時間:40秒、サンプル間隔:0.09915秒。
      7. 装置チャンネル4は、Ag/AgCl_RE に対してOECTゲート電位VGを測定し、次の設定を使用します:技術名:開回路ポテンショメトリー(OCP)、実行時間:40秒、サンプル間隔:0.09915秒。
      8. すべてのOECTについて、伝達曲線の測定を繰り返します。各測定後、Ag/AgCl参照電極(RE)を70%エタノールですすぎ、新しい低リントタオルで拭きます。Ag/AgCl REは、トリプリケートの同じサンプルグループ内で再利用できますが、異なるサンプルグループ間で再利用しないでください。

4. データ分析

1. データ抽出
   1. データ処理にカスタム MATLAB コードを使用して、計測器のネイティブ ソフトウェアからのデータの抽出とロギングを自動化し、処理時間を大幅に短縮します。MATLAB スクリプトは、Texas Data Repository (https://doi.org/10.18738/T8/MNKO8D) で入手できます。
2. データ処理
   1. OECTチャネル電流I_DS データを適合させて、さらなる分析と比較のためにレート定数kを取得します(図3)。EET対応細胞サンプルの場合、提供された単一の指数モデルが最適であることがわかりました。そこで、解析ソフトウェアの一相指数減衰モデルを用いて、_{I DS} 時系列データを適合させ、適合率定数kを求めました。この_{I DS} 時系列データは、生の値にすることも、レート定数 k が絶対値ではなく変化率を反映するため、0 h の時点に正規化することもできます。
   2. I_DSの値を0時間の時点値(I_DS0)で割ることにより、正規化されたI_DSを取得します。これはI_DS/I_DS0と呼ばれます。
3. レート定数kの決定
   1. 解析ソフトウェア(Prism 10、GraphPad)を開き、[ ファイル]>[新規]>[新規プロジェクトファイル]をクリックして新しいプロジェクトを作成します。[作成] タブで [ XY] を選択します。[オプション] セクションで、[X] を [数値] に、[Y] を [入力] に設定し、各ポイントに 1 つの Y 値をプロットします。
   2. OECT チャネルの現在の I_DS データをテーブルにインポートします。I_DS データを 1 相指数減衰モデルに当てはめるには、[解析] タブで [解析] をクリックします。XY分析で非線形回帰(カーブフィット)法を見つけます。 右側で「適合が必要なすべてのデータセット」を選択し、「 OK」をクリックします。
   3. 新しい[パラメーター]ウィンドウで、[指数]グループで [1 相減衰 モデル]を選択し、[ OK]をクリックします。モデル方程式は次のとおりです。
      Y=(Y0 - プラトー)*^e-k*X + プラトー
      ここで、YはOECTチャネルの電流I_DS、Tは時間、kはレート定数です。
   4. k 値が取得されたら、各近似の R 二乗値を確認して、近似の品質を確認します。適切なフィッティングは、R² が0.95より大きい必要があります。
4. 対応のない両側スチューデントのt検定
   1. サンプルグループ間の統計的有意性を評価するには、対応のない両側スチューデントのt検定を実行します。
   2. 解析ソフトウェアを開き、[ ファイル] > [新規] > [新規プロジェクト ファイル] をクリックして新しいプロジェクトを作成します。[作成] タブで [ XY] を選択します。[オプション] セクションで、[X] を [数値] に、[Y] を [3 つのレプリケート値を並べてサブカラムに入力] に設定します。
   3. 適合率定数kの値をテーブルにインポートします。「解析」タブで 「解析 」をクリックして、t検定を実行します。カラム分析でt検定(およびノンパラメトリック検定)の方法を見つけます。必ず [毎回 2 つのデータセット] を選択し、[ OK] をクリックします。
   4. 実験計画マニュアルで、 Unpaired、Yesを選択します。パラメトリック検定と対応のないt検定を使用します。両方の母集団に同じSDオプションがあると仮定します。p値は、比較ごとに生成されます。図では、p値は次のように表されます:n.s.:p > 0.05(有意ではない)、*:p ≤ 0.05、**:p ≤ 0.01、***:p ≤ 0.001、****:p ≤ 0.0001。
   5. 関連するすべてのデータセットについて、手順 4.4.3 から 4.4.4 を繰り返します。

5. OECTデバイスのクリーニングと再利用性

1. 実験後、装置を分解し、OECTスライドを石鹸水(1:10、石鹸:DI水)で15分間煮沸します。
2. スライドを室温のDI水が入ったビーカーにすばやく移動し、スライドが冷えるまで5分間待ちます。スライドをDIですすぎ、きれいな空気でブロードライします。
3. マルチメータでOETチャネルの抵抗を測定します。チャネル抵抗が元の値の400%以内の場合、滅菌後の実験にデバイスを再利用できます(ステップ3.1.1)。OECTスライドは、次の手順を使用して洗浄することもでき、ステップ1.2を使用したチャネル製造に適しています。
   注意: ピラニア溶液は腐食性が高く、かなりの熱を発生する可能性があります。手袋、ゴーグル、白衣など、常に適切な個人用保護具(PPE)を使用してください。細心の注意を払って取り扱い、機関の安全指導に従ってください。
4. ピラニア溶液は、換気の良いヒュームフードで調製します。結晶化皿を前後に静かに傾けて攪拌しながら、30%(w / w)過酸化水素を98%硫酸に1:4の比率で注意深くゆっくりと加えます。
5. 70°Cに加熱したホットプレートに結晶化皿を置きます。 ピンセットを使用して、スライドをピラニア溶液に1分間浸します。
6. スライドをDI水が入ったビーカーに慎重に移し、少なくとも1分間放置します。スライドをDI水で十分にすすぎ、空気でブロードライします。
7. ピラニア溶液は、施設の化学廃棄物処理ガイドラインに従って廃棄してください。ピラニア溶液を、溶液の約4倍の体積の氷水混合物を含むビーカーにゆっくりと加えて中和します。中和剤(10 M NaOHなど)を徐々に加えながら、テストストリップでpHを中性になるまで監視します。

結果

適合率定数k
OECTチャネル電流I_DS の適合レート定数kは、サンプルのEET活性を評価するための信頼性の高い指標として機能します。一定のゲートバイアス電圧はレート定数に影響を与えるが、我々は、より高いゲート電圧での迅速なドーピングを回避し、細菌細胞²³に電気化学的ストレスを提供し、最小?...

ディスカッション

電気化学セル(EC)の比較
OECTチャネル電流からレート定数をフィッティングする主な利点の1つは、生の出力ではなくI_DSの変化の基本的なダイナミクスに焦点を当てることで、デバイスの変動を最小限に抑えることです。このアプローチは、OECTの固有のシグナル増幅能力と組み合わせることで、従来の電気化学セル(EC)と比較して、ハイブリッドOE...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-oxohexanoyl-homoserine lactone	Sigma-Aldrich
anhydrotetracycline hydrochloride	VWR
casamino acids	VWR
Equipment
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich		anhydrous 99.8%,
HEPES buffer solution	VWR		1 M in water, pH = 7.3
isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside	Teknova
kanamycin sulfate	Growcells
Magnesium(II) sulfate heptahydrate	VWR
PEDOT:PSS aqueous suspension	Heraeus Epurio LLC	Clevios PH1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich
Potentiostat	PalmSens BV	MultiPalmSens4
Quartz microscopic slides	AdValue	FQ-S-003
Quartz microscopic slides
Sodium chloride	VWR
Sodium DL-lactate	TCI		60% in water
Sodium fumarate	VWR		98%
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich		95.0%-98.0%
Two-part silicone elastomer	Electron Microscopy Sciences	Sylgard184
Wolfe's Trace Mineral Mix	ATCC