유기 전기화학 트랜지스터를 이용한 세포외 전자 전달 활동의 번역

요약

여기에서는 유기 전기화학 트랜지스터(OECT)를 사용하여 Shewanella oneidensis 의 세포외 전자 전달(EET) 활성을 전기 신호로 변환하는 프로토콜을 제시합니다. 하이브리드 OECT 시스템은 향상된 견고성, 감도 및 신속한 고처리량 테스트 가능성을 제공하여 EET 측정을 위한 효과적인 도구입니다.

초록

세포외 전자 전달(EET)은 특정 미생물이 세포막을 가로질러 외부 전자 수용체로 전자를 전달하여 세포 대사를 환경과 연결할 수 있는 과정입니다. 지오박터(Geobacter )와 셰와넬라(Shewanella )가 EET 연구의 주요 모델이었지만, 새로운 연구에 따르면 EET 활성 종은 발효 및 인간의 장내 마이크로바이옴과도 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 생물학적 시스템과 전자 시스템을 연결하는 EET의 기능을 활용하여 유기 전기화학 트랜지스터(OECT)를 사용하여 미생물 EET 활성을 쉽게 감지할 수 있는 전기 신호로 변환하는 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 바이오센싱 및 바이오컴퓨팅 애플리케이션을 위해 외부 자극에 대한 세포 반응을 사용할 수 있도록 합니다. 구체적으로, OECT에서 p형 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜): 폴리(스티렌설포네이트)(PEDOT: PSS) 채널의 도핑은 Shewanella oneidensis의 세포 EET에 의해 구동됨을 입증했습니다. 유전자 회로에 의한 EET 플럭스를 전사적으로 제어함으로써 유도 분자와 같은 화학적 자극을 감지하는 이 하이브리드 OECT 시스템의 바이오센싱 능력을 확립합니다. 또한 세포 내에 플라스미드 기반 부울 로직 게이트를 도입하여 세포 내에서 환경 신호를 처리하고 OECT의 전류 변화를 유도할 수 있도록 하여 이러한 장치의 바이오컴퓨팅 잠재력을 더욱 입증합니다. 이 방법은 생물학적 시스템과 전자 장치 간의 새로운 인터페이스를 제공하여 미래의 고처리량 스크리닝, 바이오센싱 및 바이오컴퓨팅 응용 분야를 가능하게 합니다.

서문

생물학적 및 화학적 활동을 전기 신호로 변환하고 증폭할 수 있는 장치는 감지 ^1,2, 뉴로모픽 컴퓨팅(neuromorphic computing)^3,4, 웨어러블 전자 장치⁵와 같은 다양한 분야에서 매우 중요합니다. 이 중 유기 전기 화학 트랜지스터 (OECT)는 수성 환경과의 호환성 및 낮은 작동 전압 ^6,7으로 인해 생물학적 시스템과 전자 판독 사이의 탁월한 인터페이스로 부상했습니다. OECT는 전해질의 이온을 사용하여 유기 채널의 전도도를 조절한다는 점에서 기존 전자 장치와 다르며, 이는 이온 및 전자 수송을 결합하여 탁월한 트랜스컨덕턴스를 달성합니다⁸. 이러한 특성으로 인해 OECT는 약한 생물학적 신호를 증폭하고 이를 전기 판독값으로 변환할 수 있기 때문에 생물학적 시스템과 전자 장치를 인터페이스하는 데 이상적입니다.

OECT는 이온 확산을 통해 혼합 이온-전자 전도 채널의 도핑 상태를 변경하여 작동하며, 일반적으로 게이트 전극에 전압을 가하여 제어됩니다. 그러나 생물학적 또는 산화환원 반응은 채널의 전도도를 변화시켜 OECT가 다양한 화학적 및 생물학적 자극에 반응할 수 있도록 할 수도 있습니다. 지질 이중층, 이온 채널 또는 생체 분자로 OECT를 기능화하면 특정 분석물을 검출할 수 있으므로 감지 응용 분야에 유용합니다 ^9,10. 예를 들어, OECT는 포도당 산화효소와 같은 산화 환원 활성 효소와 통합되어 전자를 채널로 직접 전달하여 포도당 농도¹¹에 반응하여 전도도를 조정합니다. 이러한 구성은 바이오센싱에 효과적이지만, 개별 효소 또는 단백질의 비교적 단순한 동작으로 인해 계산 용량이 제한적입니다.

대조적으로, 살아있는 세포, 특히 박테리아는 복잡하고 강력한 계산을 수행할 수 있는 다재다능한 플랫폼을 제공합니다 ^{4,12,13,14,15}. Shewanella oneidensis 및 Geobacter sulfurreducens와 같은 전기 활성 박테리아는 세포외 전자 전달(EET)로 알려진 과정에서 세포막을 가로질러 전자를 전달하는 고유한 능력을 가지고 있습니다. 혐기성 조건에서 이러한 박테리아는 대사 과정을 금속, 금속 산화물 및 전도성 폴리머¹⁶ 및 나노 입자¹⁷과 같은 합성 물질을 포함한 외부 전자 수용체의 환원 또는 산화와 결합합니다(그림 1A). 이 기능은 발전용 미생물 연료 전지에서 활용되었으며 보다 발전된 생체 전자 응용 분야에 대한 잠재력을 제공합니다^18,19. 또한 합성 생물학의 발전으로 전기 활성 박테리아의 정확한 유전자 조작이 가능해져 EET 경로를 제어할 수 있게 되었습니다. EET 관련 유전자의 발현을 조절하는 유전 회로를 설계함으로써 연구자들은 특정 환경 신호 또는 계산 논리 연산에 반응하여 전자 플럭스를 조절할 수 있습니다^20,21. EET에 대한 이러한 유전적 제어는 박테리아 계산이 OECT와 같은 전자 장치와 직접 인터페이스되는 바이오 하이브리드 시스템을 만들 수 있는 길을 열어줍니다. 예를 들어, 박테리아 유전 회로는 화학적 입력의 조합에 반응하여 EET 경로를 켜거나 끄고, 이에 따라 OECT 채널의 전도도를 조절하도록 설계될 수 있습니다. 이를 통해 박테리아 계산의 직접적인 전기 판독이 가능하여 형광등 또는 기타 전통적인 생물학적 리포터의 필요성을 우회할 수 있습니다.

최근의 발전은 OECT와 전기 활성 박테리아를 결합할 수 있는 잠재력을 보여주었습니다. 예를 들어, Méhes 등은 S. oneidensis를 사용하여 p형 OECT로 실시간 EET 활동을 모니터링하여 박테리아 대사를 전기적으로 추적할 수 있는 방법을 설명했습니다²². 이 연구는 OECT를 사용하여 박테리아 활동을 감지할 수 있는 가능성을 강조하지만 바이오센싱 및 바이오컴퓨팅을 위한 하이브리드 시스템의 잠재력은 아직 연구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 최근 유전자 조작 S. oneidensis를 p형 OECT에 통합한 하이브리드 트랜지스터를 개발했습니다²³. 그 결과 OECT 채널이 박테리아 EET 활성을 통해 도핑을 제거할 수 있음을 보여주었습니다(그림 1B). 바이오센싱 기능을 더욱 강화하고 디도핑 공정에 대한 기계론적 통찰력을 얻기 위해 당사는 EET 플럭스를 조절하는 유전자 회로를 가진 S. oneidensis 균주를 설계했습니다. 그 결과 유도 분자와 같은 환경 신호에 대한 반응으로 예측 가능한 OECT 출력 변화가 발생합니다. 또한 이러한 유전 회로에 부울 논리를 통합함으로써 복잡한 박테리아 계산의 직접적인 전기 판독을 가능하게 했습니다.

여기에서는 하이브리드 트랜지스터 작동을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시하며, 장치 제조, 세포 배양 준비, 측정 절차 및 데이터 분석을 다룹니다. 또한 장치 세척, 재사용성 및 고처리량 테스트의 자동화 가능성과 같은 주요 고려 사항을 다룹니다.

프로토콜

알림: 모든 화학 물질은 추가 정제 없이 받은 대로 사용되었습니다. 지정하지 않은 경우 분석 등급 화학 물질이 사용되었습니다.

1. OECT 장치 제작

참고: OECT는 이전 작업²⁴에서 채택된 표준 미세 가공 기술을 사용하여 석영 현미경 슬라이드에 제작됩니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이 8개의 OECT 장치가 단일 표준 슬라이드에 배열되어 있습니다. 미리 절단된 폴리디메틸실록산(PDMS) 시트는 슬라이드에 배치되어 OECT 챔버와 액세스 포트를 형성합니다. p형 전도성 고분자 폴리(3,4-ethylenedioxythiophene): 폴리(스티렌설포네이트)(PEDOT: PSS)는 OECT 채널 및 게이트 전극에 사용되며 치수는 채널의 경우 150μm x 10μm, 게이트 팁의 경우 500μm x 500μm입니다( 그림 2B). OECT 채널 제작 및 장치 조립 공정에 대한 요약은 그림 2C에 나와 있습니다.

1. 금 전극 제작
   1. 석영 슬라이드를 아세톤, 이소프로필 알코올(IPA) 및 탈이온수(DI)로 헹궈 청소합니다. N₂ 가스로 건조시킵니다.
   2. 120초 동안 150W에서 50sccm으로 O₂ 플라즈마 청소를 수행합니다.
   3. 2단계의 스핀 코트 AZ5209e 포토레지스트(PR): 첫 번째는 500rpm, 100rpm/s 가속에서 5초, 두 번째는 2000rpm, 1000rpm/s 가속에서 45초.
   4. 90°C에서 150초 동안 하드 베이킹합니다.
   5. 마스크 얼라이너(Suss MA6)를 켜고 UV 소스로 i-line(365nm)을 선택하고 노출 시간을 3.5초(13W), 정렬 갭을 15μm, WEC 유형을 접점으로 매개변수를 설정합니다. 및 노출 유형은 하드에 있습니다.
   6. 리소그래피 마스크와 슬라이드를 얼라이너에 로드하고 슬라이드를 마스크에 정렬한 다음 초기 노출을 수행합니다.
   7. 110°C에서 180초 동안 역굽습니다.
   8. 리소그래피 마스크를 제거하고 노출 시간을 25초(13W)로, 노출 유형을 Flood E로 매개변수로 사용하여 홍수 노출을 수행합니다.
   9. 제조사에서 사전 희석한 AZ 400K 1:4 현상액으로 PR을 개발합니다. 적당량의 현상액을 결정화 접시에 부어 슬라이드를 담그고 45초 동안 원을 그리며 접시를 계속 흔듭니다. 그런 다음 즉시 슬라이드를 제거하고 DI 물에 45초 동안 담그고 DI 물로 헹구고 N₂로 건조시킵니다.
      참고: 여기에서 프로세스를 일시 중지할 수 있습니다.
   10. 슬라이드를 전자빔 증발기로 이동합니다. 2.7 x ^10-4 Pa (2 x ^10-6 T) 이하로 펌핑합니다.
   11. Ti 접착층(10nm)과 Au(100nm)를 순차적으로 증착합니다. 증착 속도는 사용되는 특정 증발기에 따라 달라질 수 있습니다. 증착 품질과 처리 시간 간의 적절한 균형을 이루기 위해 0.1nm/s의 증착 속도가 권장됩니다.
   12. 슬라이드를 아세톤에 밤새 담가 과도한 금속을 제거하십시오. 담근 후 피펫을 사용하여 슬라이드 표면의 아세톤 흐름을 분사하여 남아 있는 과도한 금속을 제거합니다. 위의 단계 후에 얻어진 쿼트 슬라이드를 OECT 전극 슬라이드라고 합니다.
       알림: 또는 초음파 처리를 사용하여 과도한 금속을 제거하는 데 도움을 줍니다.
2. PEDOT: PSS 채널 제작
   1. OECT 전극 슬라이드를 아세톤, IPA 및 DI 물로 헹궈 청소합니다. N₂ 가스로 건조시킵니다.
   2. 160°C에서 최소 5분 동안 슬라이드를 굽습니다. 스핀 코팅하기 전에 슬라이드를 식히십시오.
   3. 2단의 스핀 코트 AZ5209e PR: 먼저 500rpm에서 100rpm/s 가속 5초 후 2000rpm, 1000초에서 45rpm/s 가속.
   4. 90°C에서 150초 동안 하드 베이킹합니다.
   5. 13W에서 3.5초 동안 하드 컨택트 모드에서 i-line으로 초기 노출을 시작합니다.
   6. 110°C에서 180초 동안 역굽습니다.
   7. 13W에서 25초 동안 홍수 노출을 수행합니다.
   8. AZ 400K 1:4 현상액으로 접시를 지속적으로 원형 흔들면서 45초 동안 현상합니다. 그런 다음 슬라이드를 DI 물에 45초 동안 담그고 DI 물로 헹구고 N₂로 건조시킵니다.
      참고: 여기에서 프로세스를 일시 중지할 수 있습니다.
   9. PEDOT를 초음파 처리합니다 : 초음파 처리기의 채우기 라인에 채워진 DI 수조에 병을 띄워 5 분 동안 PSS 분산을 수행합니다. PEDOT: PSS 분산액을 0.22μm 필터로 필터링하여 덩어리를 제거합니다.
   10. 스핀 코트 PEDOT: 3500rpm에서 PSS, 3500rpm/s에서 60초 동안 가속. 90°C에서 15분 동안 건조합니다.
   11. 슬라이드를 아세톤에 12 분 동안 담근 다음 1 분 동안 초음파 처리하여 과도한 PEDOT : PSS 필름을 제거하십시오.
   12. 슬라이드를 아세톤으로 헹군 다음 IPA로 헹구고 N₂로 건조시킵니다.
   13. 90°C의 핫 플레이트 위에 슬라이드를 배치하여 에틸렌 글리콜(EG) 처리를 수행한 다음 모든 PEDOT: PSS를 덮을 수 있도록 충분한 EG를 5분 동안 떨어뜨립니다. DI 물로 헹구고 N₂로 불어 건조시킵니다. 위의 단계 후에 얻은 쿼트 슬라이드를 OECT 슬라이드라고 합니다.
3. PDMS 소자 챔버 제작
   1. 베이스와 경화제를 10:1 비율로 혼합하여 PDMS 시트를 만듭니다. 용액을 금형에 주입하여 3mm 두께에 도달하고 진공 펌프에 연결된 2/4 탈기 챔버에서 1시간 동안 탈기합니다.
   2. 매끄러운 PDMS 표면을 보장하기 위해 실온에서 48시간 동안 평평한 벤치에 금형을 놓아 혼합물을 경화합니다. 공기 중 파편으로 인한 오염을 방지하기 위해 금형을 덮으십시오.
   3. 면도날로 PDMS를 잘라내고 직경이 각각 5mm와 1.5mm인 원형 구멍 펀치가 있는 장치 챔버와 유체 교환 포트를 만듭니다. PDMS의 높이가 금형 주조 중에 제어된 대로 3mm인지 확인합니다(단계 1.3.1).

2. 배지 준비

1. 초순수 500mL, 스테인리스강 디스펜싱 바늘 4개, 고무 플라스크 캡 2개(250mL 둥근 바닥 플라스크용), 250mL 둥근 바닥 플라스크 2개, 500mL 유리 배지 병 1개를 오토클레이브합니다. 나중에 사용할 수 있도록 멸균 초순수를 4°C에서 보관하십시오.
2. 표 1에 따라 2x Wolfe's Trace Mineral Mix 0.1% 카스아미노산으로 수정된 2x Shewanella 기저 배지(SBM)를 준비합니다. 필터는 병 상단 필터를 사용하여 매체를 멸균 유리 매체 바닥(2.1단계에서 얻음)으로 멸균합니다. 이 배지는 2x SBM++이라고 하며, 각 +는 미량 미네랄 믹스와 카사미노산의 첨가를 나타냅니다. 나중에 사용할 수 있도록 4 °C에서 보관하십시오.
3. 멸균 (0.22 μm 필터) 다음 화학 물질 각각을 개별적으로 필터링하십시오 : 1M 푸마르산 나트륨 50 mL를 멸균 50 mL 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 100x KAN이라고 하는 2.5mg/mL 카나마이신(KAN) 1mL를 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 60% w/w 멸균 젖산나트륨 1mL(받은 대로 사용)를 마이크로 원심분리기 튜브에 할당합니다. 준비된 모든 용액을 4°C에서 보관하십시오.
4. 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 다음 화학 물질 1mL를 별도로 준비합니다: 100mM 이소프로필 ß-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG), 100x IPTG라고 함; 10mM 3-옥소헥사노일-호모세린 락톤(OC6), 100x OC6이라고 함; 1mM 안하이드로테트라사이클린 염산염(aTc), 100x aTc라고 함. 나중에 사용할 수 있도록 4 °C에서 보관하십시오.
5. 2.1단계에서 준비한 멸균된 플라스크, 고무 캡 및 바늘을 사용하여 배지 스톡을 퍼지합니다. 멸균 2X SBM++ 및 초순수 각각 200mL를 별도의 250mL 둥근 바닥 플라스크에 할당합니다. 플라스크를 고무 캡으로 밀봉하고 멸균 디스펜싱 바늘을 삽입하여 가스 세척 설정을 만듭니다(액체에 잠긴 공기 흡입구 바늘, 액체 표면 위의 가스 배출구 바늘). 15분 동안 N₂ 로 퍼지합니다.
6. 퍼지된 2x SBM++ 및 초순수, 젖산염, 1M 푸마르산나트륨, 100x KAN, 100x IPTG, 100x OC6 및 100x aTc를 OECT와 함께 사용할 수 있도록 글로브 박스로 옮깁니다.

3. OECT 장치를 사용한 세포 EET 모니터링

알림: 혐기성을 보장하기 위해 OECT 실험은 실온에서 습도 조절 장치가 없는 글로브 박스에서 수행됩니다.

1. 1일차
   1. 장치 멸균 및 준비
      1. OECT 슬라이드, PDMS 시트 및 Ag/AgCl 기준 전극(RE)을 별도의 용기에 오토클레이브합니다. 80 °C에서 굽고 건조시킵니다. 오토클레이브 OECT 슬라이드와 Ag/AgCl RE를 글로브박스에 넣습니다.
      2. 탈착은 글로브 박스의 대기실에서 4 시간 동안 진공을 가하여 PDMS 시트에 산소를 가두었습니다. 글로브 박스의 OECT 슬라이드 위에 PDMS 시트를 배치하여 OECT 장치를 조립합니다.
      3. 45μL의 적절한 SBM 배지를 각 OECT 챔버에 주입합니다. 대부분의 실험에는 20mM 젖산이 보충된 1x SBM++을 사용합니다. 예를 들어, 500μL의 2x SBM++, 497μL의 멸균 초순수, 2.85μL의 60% w/w 젖산나트륨을 혼합하여 1x SBM++ 1mL를 준비합니다.
      4. 매체 증발 및 오염을 방지하기 위해 OECT 챔버 포트를 PDMS 시트로 덮습니다.
      5. 전류가 안정화될 때까지 -0.05V의 일정한 채널 전압 V_DS 및 0.2V의 게이트 전압 V_GS에서 OECT 채널 전류 I_DS를 모니터링합니다. 전압 선택은 OECT 장치 또는 생물학적 샘플에 따라 달라질 수 있습니다. 측정 전반에 걸쳐 게이트와 채널에 대해 동일한 연속 바이어스 전압을 사용합니다. 안정화는 대기실의 진공 수준과 탈착 기간에 따라 몇 시간에서 며칠이 걸릴 수 있습니다.
   2. 세포 배양
      1. LB (비 플라스미드 호빙 균주의 경우) 또는 25 μg / mL 카나 마이신 (플라스미드 호빙 균주의 경우)을 함유 한 한천 플레이트에 줄무늬 세포 스톡 (-80 ° C에서 저장) 30 ° C에서 밤새 호기성으로 성장합니다^20,23.
2. 2일차
   1. 세포 준비(호기성 배양)
      1. 15mL 배양 튜브에 20mM 젖산염이 보충된 2mL의 1x SBM++ LB 한천 플레이트(3.1.2.1단계에서 획득)에서 단일 콜로니를 무작위로 선택합니다. 30°C 및 250rpm 쉐이킹에서 밤새 세포를 유지하십시오. 나중에 세포 세척에 사용될 비생물적 대조군으로 세포가 없는 6mL 성장 배지를 준비합니다.
   2. 세포 준비(혐기성 배양)
      1. 테스트할 균주가 포함된 LB 한천 플레이트를 글로브 박스로 옮깁니다.
      2. 15mL 배양 튜브에 20mM 락테이트와 40mM 푸마르산염이 보충된 적절한 SBM 1mL의 LB 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 무작위로 선택합니다. 예를 들어, 500 μL의 2x SBM++, 437 μL의 멸균 초순수, 2.85 μL의 60% w/w 젖산나트륨, 40 mM의 1 M 푸마르산나트륨, 10 μL의 100 mM IPTG 및 10 μL의 2.5 mg/mL KAN을 혼합하여 1 mM IPTG 및 25 μg/mL KAN을 필요로 하는 IPTG 유도성 균주에 대해 1 mL의 배지를 준비합니다.
      3. 흔들림 없이 18 - 24시간 동안 셀을 30°C에서 유지하십시오. 실험 배치 간의 비교를 보장하려면 일관된 성장 시간을 유지하십시오.
3. 3일차
   1. 초기 OECT 전기화학 측정
      참고: OECT 특성화의 유형은 정전압 바이어스와 같은 정적 유형에서 게이트 펄스와 같은 동적 유형에 이르기까지 다양합니다. 여기에서는 게이트 전압 스텝 테스트를 사용하여 동적 특성과 정적 특성을 모두 얻습니다. OECT와 기기(이 경우 다중 채널 전위차점) 간의 전기 연결을 재구성하는 것은 맞춤형 수동 멀티플렉스(MUX) 회로 기판의 지원을 받습니다. 높은 처리량 측정을 위해 자동화된 MUX 보드를 개발할 수 있습니다.
      1. 아래 설명된 설정을 사용하여 0V에서 0.2V까지의 게이트 전압 단계에 해당하는 OECT 채널 전류 I_DS 를 측정합니다(정확한 이름은 기기에 따라 다를 수 있음).
      2. 기기 채널 1은 OECT 채널 전류 I_DS를 측정합니다. 이를 위해 기술 이름을 설정합니다. 평형 시간: 1초; 평형 전압 : - 0.05V; 바이어스 전압: -0.05V; 실행 시간 : 14 초; 샘플 간격: 0.5ms.
      3. 기기 채널 2는 OECT 게이트 볼륨을 제어합니다.tage V_GS. 이를 위해 기술 이름을 설정합니다: 혼합 모드; 조건 시간 : 1 초; 상태 전압: 0 V; 스테이지 1 모드: 상수 E; 스테이지 1 바이어스 전압: 0 V; 스테이지 1 실행 시간: 4초; 2단계 모드: 상수 E; 스테이지 2 바이어스 전압: 0.2 V; 스테이지 2 실행 시간: 10초; 샘플 간격: 0.5ms.
      4. 모든 OECT에 대해 게이트 전압 단계 테스트(단계 3.3.1.1에서 3.3.1.3)를 반복합니다. 이 단계는 고처리량 테스트를 위해 자동화할 수 있습니다.
      5. 접종할 때까지 모든 OECT에 -0.05V의 채널 전압 V_DS 와 0.2V의 게이트 전압 V_GS 를 적용합니다. 바이어스 voltages는 장치 안정화 중에 사용되는 것과 동일합니다(단계 3.1.1.5).
   2. 접종 준비(호기성 배양)
      1. 1503 x g 에서 4분 동안 원심분리하고 세포 성장에 사용된 1mL의 새로운 배지에 재현탁하여 세포를 삼중 세척합니다(단계 3.2.1.1). 마지막(3^번째) 스핀 후 세포를 0.5mL(또는 원래 배양 부피의 절반)로 재현탁하여 1 - 3.5의 OD₆₀₀ 에서 농축된 세포 현탁액을 얻습니다. 그에 따라 최종 서스펜션 볼륨을 조정합니다.
      2. 세포 현탁액을 글로브 박스로 옮깁니다.
      3. 접종물을 얻으려면 세포를 의도한 OD₆₀₀ 0.1(또는 접종 OD₆₀₀의 10배)로 희석합니다. 망상 매체는 성장 매체와 동일한 구성을 가지고 있지만 퍼지 배지 재고가 있는 글로브 박스에서 신선하게 준비합니다. 예를 들어, 젖산이 보충된 SBM++에서 세포를 호기적으로 성장시킨 경우, 접종물 희석을 위해 글로브 박스에서 젖산이 보충된 새로운 SBM++을 준비합니다.
      4. 전위차(potentiostat)를 중지합니다. OECT 챔버(적절한 SBM 45μL 포함)에 5μL의 접종물을 주입하여 OECT에서 0.01의 최종 OD₆₀₀ 을 달성합니다. 매체 증발 및 오염을 방지하기 위해 OECT 챔버 포트를 PDMS 시트로 덮습니다.
   3. 접종물 준비(혐기성 배양물)
      1. 접종물을 얻으려면 세포 배양액을 10배 희석합니다. 성장 배지와 체질은 같지만 푸마르산염이 없는 망상 배지를 사용하십시오. 예를 들어, 젖산염, 푸마르산염, KAN, IPTG가 보충된 SBM++에서 세포를 혐기성으로 성장시킨 경우, 접종물 희석을 위해 글로브박스에서 젖산염, KAN, IPTG가 보충된 새로운 SBM++을 준비합니다.
      2. 전위차(potentiostat)를 중지합니다. 5μL의 접종물을 OECT 챔버(45μL의 적절한 SBM 포함)에 주입합니다. 매체 증발 및 오염을 방지하기 위해 OECT 챔버 포트를 PDMS 시트로 덮습니다.
   4. 지속적인 측정 및 타임포인트
      1. 전위차가 특성화를 위해 개별 OECT에 연결된 시점 측정 중을 제외하고 실험 전반에 걸쳐 OECT 채널(V_DS = -0.05V) 및 게이트(V_GS = 0.2V)에 일정한 바이어스 전압을 적용합니다.
      2. 접종 후 24시간 동안 실험을 실행합니다. 접종 전 측정(3.3.1단계 참조)을 0h 시점으로 간주합니다.
      3. OECT 채널 도핑 상태의 중요한 변화는 일반적으로 초기 8시간 동안 발생합니다. 이 기간 동안 측정을 위해 5-7개의 시점을 선택한 다음 12시간에서 16시간 사이에 한 번 측정하고 24시간 표시에서 최종 시점을 선택합니다. 시점의 예로는 접종 직후와 접종 후 1시간, 2시간, 3시간, 4.5시간, 6시간, 8시간, 18시간 및 24시간 시점이 포함될 수 있습니다.
      4. 늦은 밤 측정을 피하려면 처음 8시간 동안 빈번한 시점 측정을 수용하기 위해 이른 아침에 접종(3.3.2 또는 3.3.3 단계 참조)을 시작하십시오.
      5. 각 시점 측정에 대해 3.3.1에 설명된 단계를 반복합니다.
4. 4일차
   1. 마지막 시점(24시간)에서 전사 곡선 측정
      1. 유체 교환 포트를 통해 RE를 부드럽게 비틀고 밀어 Ag/AgCl RE를 OECT 챔버에 삽입합니다.
      2. -0.05V에서 일정한 바이어스 V_DS로 채널 전류 I_DS를 모니터링하면서 게이트 전압을 -0.1V에서 0.6V로 스윕하여 OECT의 전달 곡선을 측정합니다. Ag/AgCl RE에 대해 정확한 게이트 및 소스 전극 전위를 측정합니다.
      3. 아래 설명된 대로 기기를 구성합니다(정확한 이름은 기기에 따라 다를 수 있음).
      4. 기기 채널 1은 OECT 채널 전류 I DS를 측정_하고 다음 설정을 사용합니다: 기술 이름: 크로노암페어롬트리(CA), 평형 시간: 5초, 평형 전압: - 0.05V, 바이어스 전압: -0.05V, 실행 시간: 35초, 샘플 간격: 0.09915초.
      5. 기기 채널 2는 OECT 게이트 전압 V_GS를 제어하며, 다음 설정을 사용합니다: 기술 이름: 선형 스윕 전압주사법(LSV), 평형 시간: 5초, 평형 전압: - 0.1V, 시작 전압: -0.1V, 종료 전압: 0.6V, 전압 단계: 0.002V, 스캔 속도: 0.02V/s.
      6. 기기 채널 3은 Ag/AgCl RE에 대한 OECT 소스 전위_VS 를 측정하며, 다음 설정을 사용합니다: 기술 이름: 개방 회로 전위차계(OCP), 실행 시간: 40초, 샘플 간격: 0.09915초.
      7. 기기 채널 4는 Ag/AgCl_RE 에 대한 OECT 게이트 전위 VG를 측정하며 다음 설정을 사용합니다. 기술 이름: 개방 회로 전위차계(OCP), 실행 시간: 40초, 샘플 간격: 0.09915초.
      8. 모든 OECT에 대해 전달 곡선 측정을 반복합니다. 각 측정 후 Ag/AgCl 기준 전극(RE)을 70% 에탄올로 헹구고 보푸라기가 적은 새 수건으로 닦습니다. Ag/AgCl RE는 삼중주에 대해 동일한 샘플 그룹 내에서 재사용할 수 있지만 다른 샘플 그룹 간에 재사용해서는 안 됩니다.

4. 데이터 분석

1. 데이터 추출
   1. 데이터 처리를 위한 사용자 지정 MATLAB 코드를 사용하여 계측기의 기본 소프트웨어에서 데이터 추출 및 로깅을 자동화함으로써 처리 시간을 크게 단축할 수 있습니다. MATLAB 스크립트는 텍사스 데이터 저장소(https://doi.org/10.18738/T8/MNKO8D)에서 사용할 수 있습니다.
2. 데이터 처리
   1. 추가 분석 및 비교를 위해 속도 상수 k를 얻기 위해 OECT 채널 전류 I_DS 데이터를 맞춥니다(그림 3). EET가 가능한 세포 샘플의 경우 단일 지수 모델이 가장 적합하다는 것을 알 수 있습니다. 따라서 분석 소프트웨어에서 1상 지수 감쇠 모델을 사용하여 I_DS 시계열 데이터를 피팅하고 피팅 비율 상수 k를 얻었습니다. 이 I_DS 시계열 데이터는 원시 값이거나 0h 시점으로 정규화될 수 있으며, 속도 상수 k는 절대 값이 아닌 변화율을 반영하기 때문입니다.
   2. I_DS 값을 I_DS/I_DS0이라고 하는 0h 시점 값(I_DS0)으로 나누어 정규화된 I_DS를 얻습니다.
3. 속도 상수 k 결정
   1. 해석 소프트웨어(Prism 10, GraphPad)를 열고 파일 > 새로 만들기 > 새 프로젝트 파일을 클릭하여 새 프로젝트를 만듭니다. Create 탭에서 XY를 선택합니다. 옵션 섹션에서 X를 숫자로, Y를 Enter로 설정하고 각 점에 대해 단일 Y 값을 플롯합니다.
   2. OECT 채널 현재 I_DS 데이터를 테이블로 가져옵니다. 분석 탭에서 분석을 클릭하여 I_DS 데이터를 1상 지수 감쇠 모델에 맞춥니다. XY 해석에서 비선형 회귀(곡선 맞춤) 방법을 찾습니다. 오른쪽에서 All the Data Sets that need to be Fit(적합해야 하는 모든 데이터 세트)을 선택한 다음 OK(확인)를 클릭합니다.
   3. 새 Parameters 창에서 Exponential 그룹의 One phase decay model을 선택한 다음 OK를 클릭합니다. 모형 방정식은 다음과 같습니다.
      Y=(Y0 - 고원)*^e-k*X + 고원
      여기서: Y는 OECT 채널의 전류 I_DS, T는 시간, k는 속도 상수입니다.
   4. k 값을 구한 후에는 각 피팅에 대한 R 제곱 값을 확인하여 피팅 품질을 검토합니다. 양호한 피팅은 R² 가 0.95보다 높아야 합니다.
4. 쌍을 이루지 않은 양측 학생 t-검정
   1. 표본 그룹 간의 통계적 유의성을 평가하려면 짝을 이루지 않은 양측 학생 t-검정을 수행합니다.
   2. 해석 소프트웨어를 열고 파일 > 새 프로젝트 파일 > 새 프로젝트 파일을 클릭하여 새 프로젝트를 만듭니다. Create 탭에서 XY를 선택합니다. Options(옵션) 섹션에서 X를 Numbers(숫자)로 설정하고 Y를 Enter 3 replicate values in side-by-side subcolumns(나란히 있는 하위 열에 3개의 복제 값)로 설정합니다.
   3. 적합률 상수 k 값을 표로 가져옵니다. 분석 탭에서 분석을 클릭하여 t-test를 수행합니다. t-검정(및 비모수 검정) 방법은 컬럼 분석에서 찾을 수 있습니다. 매번 두 개의 데이터 세트를 선택해야 하며 확인을 클릭합니다.
   4. Experimental Design manual(실험 설계 설명서)에서 Unpaired(페어링되지 않음), Yes(예)를 선택합니다. 파라메트릭 검정 및 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용합니다. 두 모집단이 동일한 SD 옵션을 가지고 있다고 가정합니다. 각 비교에 대해 p-값이 생성됩니다. 그림에서 p-값은 다음과 같이 표시됩니다: n.s.: p > 0.05 (유의하지 않음), *: p ≤ 0.05, **: p ≤ 0.01, ***: p ≤ 0.001, ****: p ≤ 0.0001.
   5. 모든 관련 데이터 세트에 대해 4.4.3 -4.4.4 단계를 반복합니다.

5. OECT 장치 세척 및 재사용성

1. 실험이 끝나면 장치를 분해하고 OECT 슬라이드를 비눗물(1:10, 비누: DI 물)에 15분 동안 끓입니다.
2. 슬라이드를 실온 DI 물이 들어 있는 비커로 빠르게 이동하고 슬라이드가 식을 때까지 5분 동안 기다립니다. DI로 슬라이드를 헹구고 깨끗한 공기로 말리십시오.
3. 멀티미터로 OECT 채널의 저항을 측정합니다. 채널 저항이 원래 값의 400% 이내인 경우 멸균 후 실험에 재사용할 수 있습니다(단계 3.1.1). OECT 슬라이드는 다음 단계를 사용하여 청소할 수도 있으며 1.2단계를 사용하여 채널 제작에 적합합니다.
   주의: 피라냐 용액은 부식성이 강하여 상당한 열을 발생시킬 수 있습니다. 항상 장갑, 고글, 실험복을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용하십시오. 각별히 주의하여 취급하고 기관의 안전 지침을 준수하십시오.
4. 환기가 잘 되는 흄 후드에 피라냐 용액을 준비합니다. 30%(w/w)의 과산화수소와 98% 황산을 1:4 비율로 조심스럽게 천천히 첨가하면서 결정화 접시를 앞뒤로 부드럽게 기울여 저어줍니다.
5. 70°C로 가열된 열판에 결정화 접시를 놓습니다. 핀셋을 사용하여 슬라이드를 피라냐 용액에 넣고 1분 동안 담그십시오.
6. 슬라이드를 DI 물이 들어 있는 비커에 조심스럽게 옮기고 최소 1분 동안 그대로 두십시오. 슬라이드를 DI 물로 철저히 헹구고 공기로 말리십시오.
7. 피라냐 용액은 기관의 화학 폐기물 처리 지침에 따라 폐기하십시오. 피라냐 용액을 용액 부피의 약 4배인 얼음-물 혼합물이 들어 있는 비커에 천천히 첨가하여 중화합니다. 중화제(예: 10M NaOH)를 점차적으로 첨가하면서 중성이 될 때까지 테스트 스트립으로 pH를 모니터링합니다.

결과

적합률 상수 k
OECT 채널 전류 I_DS의 피팅 비율 상수 k는 샘플의 EET 활성을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 지표 역할을 합니다. 일정한 게이트 바이어스 전압이 속도 상수에 영향을 미치지만, 더 높은 게이트 전압에서 빠른 도핑을 피하고 박테리아 세포에 전기화학적 스트레스를 제공하고 최소화하는 동시에 박테리아 전자 전?...

토론

전기화학 전지(EC) 비교
OECT 채널 전류에서 속도 상수를 피팅하는 한 가지 주요 이점은 원시 출력이 아닌 I_DS 변화의 기본 역학에 초점을 맞춰 장치 변동을 최소화한다는 것입니다. OECT의 고유한 신호 증폭 기능과 결합된 이 접근 방식은 기존 전기화학 전지(EC)에 비해 하이브리드 OECT 시스템의 견고성을 향상시킵니다. 예를 들어, 각 24시간 OECT 실험이 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-oxohexanoyl-homoserine lactone	Sigma-Aldrich
anhydrotetracycline hydrochloride	VWR
casamino acids	VWR
Equipment
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich		anhydrous 99.8%,
HEPES buffer solution	VWR		1 M in water, pH = 7.3
isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside	Teknova
kanamycin sulfate	Growcells
Magnesium(II) sulfate heptahydrate	VWR
PEDOT:PSS aqueous suspension	Heraeus Epurio LLC	Clevios PH1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich
Potentiostat	PalmSens BV	MultiPalmSens4
Quartz microscopic slides	AdValue	FQ-S-003
Quartz microscopic slides
Sodium chloride	VWR
Sodium DL-lactate	TCI		60% in water
Sodium fumarate	VWR		98%
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich		95.0%-98.0%
Two-part silicone elastomer	Electron Microscopy Sciences	Sylgard184
Wolfe's Trace Mineral Mix	ATCC