Traducción de Actividades de Transferencia de Electrones Extracelulares con Transistores Electroquímicos Orgánicos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para el uso de transistores electroquímicos orgánicos (OECTs) para traducir la actividad de transferencia de electrones extracelulares (EET) en Shewanella oneidensis en señales eléctricas. El sistema híbrido OECT proporciona una mayor robustez, sensibilidad y potencial para pruebas rápidas y de alto rendimiento, lo que lo convierte en una herramienta eficaz para las mediciones de EET.

Resumen

La transferencia extracelular de electrones (EET) es un proceso a través del cual ciertos microorganismos pueden transferir electrones a través de sus membranas celulares a aceptores de electrones externos, vinculando el metabolismo celular con su entorno. Si bien Geobacter y Shewanella han sido los modelos principales para la investigación de EET, los estudios emergentes revelan que las especies activas de EET también están asociadas con la fermentación y el microbioma intestinal humano. Aprovechando la capacidad de EET para unir sistemas biológicos y electrónicos, presentamos un protocolo para usar transistores electroquímicos orgánicos (OECT) para traducir la actividad microbiana de EET en señales eléctricas fácilmente detectables. Este sistema permite el uso de respuestas celulares a estímulos externos para aplicaciones de biodetección y bioinformática. Específicamente, demostramos el desdopaje del canal de poli(3,4-etilendioxitiofeno): poli(estirenosulfonato) (PEDOT: PSS) de tipo p en el OECT es impulsado por EET celular de Shewanella oneidensis. Mediante el control transcripcional del flujo de EET mediante circuitos genéticos, establecemos la capacidad de biodetección de este sistema híbrido OECT para detectar estímulos químicos, como moléculas inductoras. Además, introducimos puertas lógicas booleanas basadas en plásmidos dentro de las células, lo que les permite procesar señales ambientales e impulsar cambios de corriente en los OECT, lo que demuestra aún más el potencial bioinformático de estos dispositivos. Este método proporciona una interfaz novedosa entre los sistemas biológicos y la electrónica, lo que permite futuras aplicaciones de cribado, biodetección y biocomputación de alto rendimiento.

Introducción

Los dispositivos que pueden transducir y amplificar las actividades biológicas y químicas en señales eléctricas son cruciales en varios campos, como la detección ^1,2, la computación neuromórfica ^3,4 y la electrónica portátil⁵. Entre estos, los transistores electroquímicos orgánicos (OECTs) han surgido como interfaces excepcionales entre los sistemas biológicos y las lecturas electrónicas debido a su compatibilidad con ambientes acuosos y bajos voltajes de operación ^6,7. Los OECT difieren de la electrónica convencional en que utilizan iones en un electrolito para modular la conductividad de un canal orgánico, que acopla el transporte iónico y electrónico para lograr una transconductancia excepcional^. Estas características hacen que los OECT sean ideales para interconectar sistemas biológicos con electrónica, ya que pueden amplificar señales biológicas débiles y traducirlas en lecturas eléctricas.

Los OECT funcionan alterando el estado de dopaje de un canal conductor mixto iónico-electrónico a través de la difusión iónica, normalmente controlada mediante la aplicación de un voltaje en el electrodo de puerta. Sin embargo, las reacciones biológicas o redox también pueden cambiar la conductividad del canal, lo que permite que los OECT respondan a una variedad de estímulos químicos y biológicos. La funcionalización de los OECT con bicapas lipídicas, canales iónicos o biomoléculas les permite detectar analitos específicos, lo que los hace útiles para aplicaciones de detección ^9,10. Por ejemplo, los OECT se han integrado con enzimas redox activas como la glucosa oxidasa para transferir electrones directamente al canal, ajustando su conductividad en respuesta a la concentración de glucosa¹¹. Si bien estas configuraciones son efectivas para la biodetección, su capacidad computacional está limitada debido al comportamiento relativamente simple de las enzimas o proteínas individuales.

Por el contrario, las células vivas, en particular las bacterias, ofrecen una plataforma versátil capaz de realizar cálculos complejos y robustos 4,12,13,14,15. Las bacterias electroactivas, como Shewanella oneidensis y Geobacter sulfurreducens, tienen la capacidad única de transferir electrones a través de sus membranas celulares en un proceso conocido como transferencia de electrones extracelulares (EET). En condiciones anaeróbicas, estas bacterias acoplan sus procesos metabólicos a la reducción u oxidación de aceptores de electrones externos, incluidos metales, óxidos metálicos y materiales sintéticos como polímeros conductores¹⁶ y nanopartículas¹⁷ (Figura 1A). Esta capacidad se ha explotado en pilas de combustible microbianas para la generación de energía y ofrece el potencial para aplicaciones bioelectrónicas más avanzadas^18,19. Además, los avances en biología sintética han permitido la manipulación genética precisa de bacterias electroactivas para controlar las vías de EET. Mediante la ingeniería de circuitos genéticos que regulan la expresión de genes relacionados con EET, los investigadores pueden modular el flujo de electrones en respuesta a señales ambientales específicas^{u operaciones de} lógica computacional^. Este control genético sobre EET abre vías para la creación de sistemas biohíbridos en los que los cálculos bacterianos se interconectan directamente con dispositivos electrónicos como los OECT. Por ejemplo, los circuitos genéticos bacterianos podrían diseñarse para responder a combinaciones de entradas químicas, activando o desactivando las vías EET y, por lo tanto, modulando la conductividad de un canal OECT. Esto permitiría lecturas eléctricas directas de los cálculos bacterianos, evitando la necesidad de fluorescentes u otros reporteros biológicos tradicionales.

Los avances recientes han demostrado el potencial de acoplar los OECT con las bacterias electroactivas. Por ejemplo, Méhes et al. utilizaron S. oneidensis para monitorear la actividad de EET en tiempo real con un OECT de tipo p, lo que ilustra cómo se podría rastrear eléctricamente el metabolismo bacteriano²². Si bien este trabajo destaca la posibilidad de utilizar OECT para detectar la actividad bacteriana, el potencial del sistema híbrido para la biodetección y la biocomputación sigue siendo poco explorado. Para abordar esto, recientemente desarrollamos transistores híbridos que incorporan S. oneidensis modificado genéticamente en OECTs de tipo p²³. Los resultados demostraron que el canal OECT podía ser desdopado a través de las actividades bacterianas de EET (Figura 1B). Para mejorar aún más las capacidades de biodetección y obtener información mecanicista sobre el proceso de desdopaje, diseñamos cepas de S. oneidensis con circuitos genéticos que regulan el flujo de EET. Esto da lugar a cambios predecibles en la producción de OECT en respuesta a señales ambientales, como las moléculas inductoras. Además, al integrar la lógica booleana en estos circuitos genéticos, permitimos lecturas eléctricas directas de cálculos bacterianos complejos.

Aquí, presentamos el protocolo completo para el funcionamiento del transistor híbrido, que cubre la fabricación del dispositivo, la preparación del cultivo celular, los procedimientos de medición y el análisis de datos. Además, abordamos consideraciones clave como la limpieza de dispositivos, la reutilización y el potencial de automatización en las pruebas de alto rendimiento.

Protocolo

NOTA: Todos los productos químicos se utilizaron tal como se recibieron sin más purificación. Si no se especificaba, se utilizaban productos químicos de grado analítico.

1. Fabricación de dispositivos OECT

NOTA: Los OECTs se fabrican en portaobjetos de microscopio de cuarzo utilizando técnicas de microfabricación estándar adaptadas de trabajos anteriores²⁴. Como se muestra en la Figura 2A, ocho dispositivos OECT están dispuestos en una sola diapositiva estándar. Las láminas de polidimetilsiloxano (PDMS) precortadas se colocan en el portaobjetos para formar cámaras OECT y puertos de acceso. El polímero conductor de tipo p poli(3,4-etilendioxitiofeno): poli(estirenosulfonato) (PEDOT: PSS) se utiliza para el canal OECT y el electrodo de puerta, con unas dimensiones de 150 μm x 10 μm para el canal y 500 μm x 500 μm para la punta de la puerta ( Figura 2B). En la Figura 2C se proporciona un resumen del proceso de fabricación y ensamblaje de dispositivos de canales OECT.

1. Fabricación de electrodos de oro
   1. Limpie los portaobjetos de cuarzo enjuagándolos con acetona, alcohol isopropílico (IPA) y agua desionizada (DI). Secar con gas N₂ .
   2. Realice la limpieza con plasma de_O2 con 50 sccm a 150 W durante 120 s.
   3. Spin-coat AZ5209e fotorresistente (PR) con 2 etapas: la primera a 500 rpm, aceleración de 100 rpm/s durante 5 s, y la segunda a 2000 rpm, aceleración de 1000 rpm/s durante 45 s.
   4. Horneado duro a 90 °C durante 150 s.
   5. Encienda el alineador de máscaras (Suss MA6) y seleccione i-line (365 nm) como fuente UV, configure los parámetros: tiempo de exposición en 3,5 s (13 W), espacio de alineación en 15 μm, tipo WEC en Contacto. y el tipo de exposición a Difícil.
   6. Cargue la máscara de litografía y el portaobjetos en el alineador, alinee el portaobjetos con la máscara y, a continuación, realice la exposición inicial.
   7. Hornee al revés a 110 °C durante 180 s.
   8. Retire la máscara de litografía y realice la exposición a inundaciones con los siguientes parámetros: tiempo de exposición de 25 s (13 W), tipo de exposición de inundación E.
   9. Desarrolle el PR con el revelador AZ 400K 1:4 prediluido por el fabricante. Vierta la cantidad adecuada de revelador en un plato de cristalización para sumergir el portaobjetos y agite constantemente el plato con movimientos circulares durante 45 s. A continuación, retire inmediatamente el portaobjetos y sumérjalo en agua desionizada durante 45 s, enjuague con agua desionizada y seque con N₂.
      NOTA: El proceso se puede pausar aquí.
   10. Mueva las correderas al evaporador de haz electrónico. Bombee a 2,7 x ^10-4 Pa (2 x ^10-6 T) o menos.
   11. Depositar la capa adhesiva de Ti (10 nm) y Au (100 nm) secuencialmente. La velocidad de deposición puede variar dependiendo del evaporador específico utilizado. Se recomienda una velocidad de deposición de 0,1 nm/s para lograr un buen equilibrio entre la calidad de deposición y el tiempo de procesamiento.
   12. Elimine el exceso de metal remojando los portaobjetos en acetona durante la noche. Después de remojar, use una pipeta para inyectar chorros de acetona en la superficie del portaobjetos para desalojar cualquier resto de metal excesivo. Los portaobjetos de un cuarto de galón obtenidos después de los pasos anteriores se denominan portaobjetos de electrodos OECT.
       NOTA: Alternativamente, utilice la sonicación para ayudar a desalojar el exceso de metal.
2. PEDOT: Fabricación de canales PSS
   1. Limpie los portaelectrodos OECT enjuagándolos con acetona, alcohol isopropílico y agua desionizada. Secar con gas N₂ .
   2. Hornee los portaobjetos durante al menos 5 minutos a 160 °C. Deje que los portaobjetos se enfríen antes de centrifugar.
   3. Spinner AZ5209e PR con 2 etapas: primero a 500 rpm, aceleración de 100 rpm/s durante 5 s seguido de 2000 rpm, aceleración de 1000 rpm/s a 45 s.
   4. Horneado duro a 90 °C durante 150 s.
   5. Inicie la exposición inicial con i-line en modo de contacto duro durante 3,5 s a 13 W.
   6. Horneado inverso a 110 °C durante 180 s.
   7. Realice una exposición a inundaciones durante 25 s a 13 W.
   8. Revele con revelador AZ 400K 1:4 durante 45 s con agitación circular constante de la placa. A continuación, remoje los portaobjetos en agua desionizada durante 45 s, enjuague con agua desionizada y séquelos con N₂.
      NOTA: El proceso se puede pausar aquí.
   9. Sonicar la dispersión PEDOT: PSS durante 5 minutos haciendo flotar la botella en un baño de agua DI lleno hasta la línea de llenado del sonicador. Filtre la dispersión PEDOT: PSS con un filtro de 0,22 μm para eliminar los grumos.
   10. Spinner coat PEDOT: PSS a 3500 rpm con aceleración a 3500 rpm/s durante 60 s. Secar a 90 °C durante 15 min.
   11. Elimine el exceso de película PEDOT:PSS remojando los portaobjetos en acetona durante 12 minutos, seguido de 1 min de sonicación.
   12. Enjuague los portaobjetos con acetona y luego IPA y seque con N₂.
   13. Realice el tratamiento con etilenglicol (EG) colocando los portaobjetos sobre la placa calefactora a 90 °C, luego deje caer suficiente EG para cubrir todo el PEDOT: PSS durante 5 min. Enjuague con agua desionizada y seque con N₂. Los portaobjetos de un cuarto de galón obtenidos después de los pasos anteriores se denominan portaobjetos OECT.
3. Fabricación de cámaras de dispositivos PDMS
   1. Haga láminas de PDMS mezclando la base y el agente de curado en una proporción de 10:1. Lanzar la solución en el molde hasta alcanzar un espesor de 3 mm y desgasificar durante 1 h en una cámara de desgasificación de 2 cuartos conectada a una bomba de vacío.
   2. Cura la mezcla colocando el molde en un banco nivelado durante 48 h a temperatura ambiente para garantizar superficies lisas de PDMS. Cubra el molde para evitar la contaminación por los desechos transportados por el aire.
   3. Recorte el PDMS con cuchillas de afeitar y cree las cámaras del dispositivo y los puertos de intercambio de fluidos con perforadoras circulares con diámetros de 5 mm y 1,5 mm, respectivamente. Asegúrese de que la altura del PDMS sea de 3 mm, según lo controlado durante la fundición del molde (paso 1.3.1)

2. Preparación de los medios de comunicación

1. Autoclave 500 mL de agua ultrapura, cuatro agujas dispensadoras de acero inoxidable, dos tapas de matraz de goma (para los matraces de fondo redondo de 250 mL), dos matraces de fondo redondo de 250 mL y una botella de vidrio de 500 mL. Almacene el agua ultrapura estéril a 4 °C para su uso futuro.
2. Prepare el medio basal (SBM) 2x Shewanella modificado con 2x Wolfe's Trace Mineral Mix 0.1% de ácidos casamino de acuerdo con la Tabla 1. Filtro: esterilice el medio en el fondo del medio de vidrio estéril (obtenido en el paso 2.1) con un filtro en la parte superior de la botella. Este medio se denomina 2x SBM++, y cada + indica la adición de Trace Mineral Mix y ácidos casamino. Almacenar a 4 °C para su uso futuro.
3. Filtre estéril (filtro de 0,22 μm) cada uno de los siguientes productos químicos por separado: 50 mL de fumarato de sodio 1 M en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL; 1 mL de 2,5 mg/mL de kanamicina (KAN), denominada KAN 100x, en un tubo de microcentrífuga estéril. Asigne 1 mL de lactato de sodio estéril al 60% p/p (usado tal como se recibió) en un tubo de microcentrífuga. Almacene todas las soluciones preparadas a 4 °C.
4. Prepare por separado 1 mL de los siguientes productos químicos en tubos de microcentrífuga estériles: 100 mM de isopropil ß-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG), denominado IPTG 100x; 10 mM 3-oxohexanoil-homoserina lactona (OC6), denominada 100x OC6; Clorhidrato de anhidrotetraciclina (aTc) de 1 mM, denominado 100x aTc. Almacenar a 4 °C para su uso futuro.
5. Usando los matraces esterilizados, los tapones de goma y las agujas preparados en el paso 2.1, purgue el material mediano. Asigne 200 ml de agua estéril 2X SBM++ y ultrapura en matraces separados de fondo redondo de 250 ml. Selle los matraces con tapas de goma e inserte agujas dispensadoras estériles para crear una configuración de lavado de gas (aguja de entrada de aire sumergida en el líquido; aguja de salida de gas por encima de la superficie del líquido). Purgar con N₂ durante 15 min.
6. Transfiera la 2x SBM++ purgada y el agua ultrapura, el lactato, el fumarato de sodio 1 M, el 100x KAN, el 100x IPTG, el 100x OC6 y el 100x aTc a la guantera para su uso posterior con el OECT.

3. Monitorización de EET celular con dispositivos OECT

NOTA: Para garantizar la anaericidad, el experimento OECT se lleva a cabo en una guantera sin control de humedad a temperatura ambiente.

1. Día 1
   1. Esterilización y preparación de dispositivos
      1. Autoclave los portaobjetos OECT, las láminas de PDMS y el electrodo de referencia (RE) de Ag/AgCl en contenedores separados. Secar horneando a 80 °C. Lleve las correderas OECT esterilizadas en autoclave y Ag/AgCl RE a la guantera.
      2. Dessorbe el oxígeno atrapado en las láminas de PDMS sometiéndolo al vacío en la antecámara de la guantera durante 4 h. Ensamble el dispositivo OECT colocando las hojas de PDMS sobre las correderas OECT en la guantera.
      3. Inyecte 45 μL de medio SBM apropiado en cada cámara OECT. Para la mayoría de los experimentos, use 1x SBM++ suplementado con 20 mM de lactato. Por ejemplo, prepare 1 ml de 1x SBM++ mezclando 500 μL de 2x SBM++, 497 μL de agua ultrapura estéril y 2,85 μL de lactato de sodio al 60% p/p.
      4. Cubra los puertos de la cámara OECT con láminas de PDMS para evitar la evaporación del medio y la contaminación.
      5. Supervise la corriente del canal OECT I_DS bajo una tensión de canal constante V_DS de -0,05 V y una tensión de puerta V_GS de 0,2 V hasta que la corriente se estabilice. La selección de voltaje puede variar según el dispositivo OECT o las muestras biológicas. Utilice los mismos voltajes de polarización continua para la puerta y el canal durante toda la medición. La estabilización puede tardar de horas a unos pocos días, dependiendo del nivel de vacío y la duración de la desorción en la antecámara.
   2. Cultivos celulares
      1. Estratificar las existencias de células (almacenadas a -80 °C) en placas de agar que contengan LB (para cepas que no albergan plásmidos) o LB con 25 μg/mL de kanamicina (para cepas que albergan plásmidos) y crecer aeróbicamente durante la noche a 30 °C^20,23.
2. Día 2
   1. Preparación celular (cultivos aeróbicos)
      1. Elija aleatoriamente colonias individuales de las placas de agar LB (obtenidas en el paso 3.1.2.1) en 2 mL de 1x SBM++ suplementado con 20 mM de lactato en tubos de cultivo de 15 mL. Mantenga las celdas durante la noche a 30 °C y 250 rpm agitando. Preparar 6 mL de medio de crecimiento sin células como control abiótico que se utilizará posteriormente en el lavado de células.
   2. Preparación celular (cultivo anaeróbico)
      1. Transfiera a la guantera las placas de agar LB que contienen las cepas que se van a probar.
      2. Elija al azar colonias individuales de placas de agar LB en 1 mL de SBM apropiado suplementado con 20 mM de lactato y 40 mM de fumarato en tubos de cultivo de 15 mL. Por ejemplo, prepare 1 mL de medio para la cepa inducible por IPTG que requiera 1 mM de IPTG y 25 μg/mL de KAN mezclando 500 μL de 2x SBM++, 437 μL de agua ultrapura estéril, 2,85 μL de lactato de sodio al 60% p/p, 40 mM de fumarato de sodio 1 M, 10 μL de IPTG 100 mM y 10 μL de 2,5 mg/mL de KAN.
      3. Mantenga las células a 30 °C durante 18 - 24 h sin temblar. Para garantizar la comparabilidad entre los lotes de experimentos, mantenga tiempos de crecimiento constantes.
3. Día 3
   1. Medición electroquímica inicial OECT
      NOTA: El tipo de caracterizaciones de OECT varía desde tipos estáticos, como polarización de voltaje constante, hasta tipos dinámicos, como pulsos de puerta. Aquí, utilizamos la prueba de paso de voltaje de puerta para obtener características dinámicas y estáticas. La reconfiguración de la conexión eléctrica entre los OECT y el instrumento (un potenciostato multicanal en este caso) es asistida por placas de circuito multiplex manual (MUX) personalizadas. Se pueden desarrollar placas MUX automatizadas para la medición de alto rendimiento.
      1. Mida la corriente del canal OECT I_DS correspondiente al paso de voltaje de la puerta de 0 V a 0,2 V con los ajustes que se describen a continuación (los nombres exactos pueden variar según el instrumento).
      2. El canal de instrumentos 1 mide la corriente del canal OECT I_DS. Para esto, establezca el nombre de la técnica: Amperometría rápida; Tiempo de equilibrio: 1 s; Voltaje de equilibrio: - 0,05 V; Voltaje de polarización: -0,05 V; Duración: 14 s; Intervalo de muestreo: 0,5 ms.
      3. El canal de instrumentos 2 controla la tensión de la puerta OECT V_GS. Para esto, establezca el nombre de la técnica: Modo mixto; Tiempo de condición: 1 s; Voltaje de condición: 0 V; Modo de la etapa 1: Constante E; Voltaje de polarización de la etapa 1: 0 V; Tiempo de ejecución de la etapa 1: 4 s; Modo de la etapa 2: E constante; Voltaje de polarización de la etapa 2: 0,2 V; Tiempo de ejecución de la etapa 2: 10 s; Intervalo de muestreo: 0,5 ms.
      4. Repita la prueba de paso de voltaje de puerta (pasos 3.3.1.1 a 3.3.1.3) para todos los OECT. Este paso se puede automatizar para pruebas de alto rendimiento.
      5. Aplique una tensión de canal constante V_DS de -0,05 V y una tensión de puerta V_GS de 0,2 V a todos los OECT hasta la inoculación. Asegúrese de que los voltajes de polarización sean los mismos que los utilizados durante la estabilización del dispositivo (paso 3.1.1.5).
   2. Preparación de inóculo (cultivos aeróbicos)
      1. Lavar tres veces las células centrifugando a 1503 x g durante 4 min y resuspendiendo en 1 mL de medio fresco utilizado para el crecimiento celular (paso 3.2.1.1). Después del último (^3º) centrifugado, vuelva a suspender las células en 0,5 mL (o la mitad del volumen de cultivo original) para obtener una suspensión celular concentrada a DO₆₀₀ de 1 - 3,5. Ajuste el volumen final de la suspensión en consecuencia.
      2. Transfiera la suspensión de celdas a la guantera.
      3. Para obtener el inóculo, diluya las células hasta una DO₆₀₀ prevista de 0,1 (o 10 veces la DO₆₀₀ de la inoculación). El medio de delirio tiene la misma constitución que el medio de crecimiento, pero prepárelo fresco en la guantera con existencias de medios purgadas. Por ejemplo, si las células se cultivaron aeróbicamente en SBM++ suplementado con lactato, prepare SBM++ fresco suplementado con lactato en la guantera para la dilución del inóculo.
      4. Detenga el potenciostato. Inyectar 5 μL del inóculo en la cámara del OECT (que contiene 45 μL de SBM apropiado) para lograr un OD final de₆₀₀ de 0,01 en el OECT. Cubra los puertos de la cámara OECT con láminas de PDMS para evitar la evaporación del medio y la contaminación.
   3. Preparación de inóculo (cultivos anaeróbicos)
      1. Para obtener el inóculo, diluir los cultivos celulares 10 veces. Utilice un medio de delirio que tenga la misma constitución que el medio de crecimiento pero que carezca de fumarato. Por ejemplo, si las células se cultivaron anaeróbicamente en SBM++ suplementadas con lactato, fumarato, KAN e IPTG, prepare SBM++ fresco suplementado con lactato, KAN e IPTG en la guantera para la dilución del inóculo.
      2. Detenga el potenciostato. Inyecte 5 μL del inóculo en la cámara OECT (que contiene 45 μL de SBM apropiado). Cubra los puertos de la cámara OECT con láminas de PDMS para evitar la evaporación del medio y la contaminación.
   4. Medición continua y puntos de tiempo
      1. Aplique voltajes de polarización constantes a los canales OECT (V_DS = -0,05 V) y a la puerta (V_GS = 0,2 V) durante todo el experimento, excepto durante las mediciones de puntos de tiempo cuando el potenciostato está conectado a OECT individuales para la caracterización.
      2. Realice el experimento durante 24 horas después de la inoculación. Considere la medición antes de la inoculación (ver paso 3.3.1) como el punto de tiempo de 0 h.
      3. Los cambios significativos en el estado de dopaje del canal OECT suelen ocurrir durante las 8 h iniciales. Seleccione de 5 a 7 puntos de tiempo para las mediciones durante este período, seguido de una medición entre las 12 h y las 16 h, y el punto de tiempo final en la marca de 24 h. Ejemplos de puntos de tiempo podrían incluir inmediatamente después de la inoculación y a 1 h, 2 h, 3 h, 4,5 h, 6 h, 8 h, 18 h y 24 h después de la inoculación.
      4. Para evitar mediciones nocturnas, inicie la inoculación (consulte el paso 3.3.2 o 3.3.3) temprano en el día para adaptarse a las mediciones frecuentes de puntos de tiempo durante las primeras 8 h.
      5. Repita el paso descrito en 3.3.1 para cada medición de punto de tiempo.
4. Día 4
   1. Medición de la curva de transferencia en el último punto temporal (24 h)
      1. Inserte el Ag/AgCl RE en la cámara OECT girando y empujando suavemente el RE a través del puerto de intercambio de fluido.
      2. Mida las curvas de transferencia del OECT barriendo el voltaje de la puerta de -0.1 V a 0.6 V mientras monitorea la corriente del canal I_DS con polarización constante V_DS a -0.05 V. Mida los potenciales precisos de la puerta y del electrodo de fuente contra el Ag/AgCl RE.
      3. Configure el instrumento como se describe a continuación (los nombres exactos pueden variar según el instrumento).
      4. El canal 1 del instrumento mide la corriente del canal OECT I_DS, utilice la siguiente configuración: Nombre de la técnica: Cronoamperometría (CA), Tiempo de equilibrio: 5 s, Voltaje de equilibrio: - 0,05 V, Voltaje de polarización: -0,05 V, Tiempo de ejecución: 35 s, Intervalo de muestreo: 0,09915 s.
      5. El canal de instrumento 2 controla el voltaje de la puerta OECT V_GS, use la siguiente configuración: Nombre de la técnica: Voltamperometría de barrido lineal (LSV), Tiempo de equilibrio: 5 s, Voltaje de equilibrio: - 0,1 V, Voltaje de inicio: -0,1 V, Voltaje de finalización: 0,6 V, Paso de voltaje: 0,002 V, Velocidad de escaneo: 0,02 V/s.
      6. El canal de instrumento 3 mide el potencial de la fuente OECT V_S frente a Ag/AgCl RE, utilice la siguiente configuración: Nombre de la técnica: Potenciometría de circuito abierto (OCP), Tiempo de ejecución: 40 s, Intervalo de muestreo: 0,09915 s.
      7. El canal de instrumento 4 mide el potencial de puerta OECT V_G frente a Ag/AgCl RE, utilice la siguiente configuración: Nombre de la técnica: Potenciometría de circuito abierto (OCP), Tiempo de ejecución: 40 s, Intervalo de muestreo: 0,09915 s.
      8. Repita la medición de la curva de transferencia para todos los OECT. Después de cada medición, enjuague el electrodo de referencia (RE) de Ag/AgCl con etanol al 70% y límpielo con una toalla nueva con poca pelusa. El Ag/AgCl RE se puede reutilizar dentro del mismo grupo de muestra para los triplicados, pero no debe reutilizarse entre diferentes grupos de muestras.

4. Análisis de datos

1. Extracción de datos
   1. Utilice código personalizado de MATLAB para el procesamiento de datos con el fin de automatizar la extracción y el registro de datos desde el software nativo del instrumento, lo que reduce significativamente el tiempo de procesamiento. Los scripts de MATLAB están disponibles en Texas Data Repository (https://doi.org/10.18738/T8/MNKO8D).
2. Procesamiento de datos
   1. Ajuste los datos de corriente del canal OECT I_DS para obtener las constantes de velocidad k para su posterior análisis y comparación (Figura 3). En el caso de las muestras de células con capacidad EET, encontramos que el modelo exponencial único proporciona el mejor ajuste. Por lo tanto, utilizamos el modelo de decaimiento exponencial monofásico en el software de análisis para ajustar los datos de la serie temporal I_DS y obtener la constante de velocidad ajustada k. Estos datos de series temporales_{I DS} pueden ser el valor bruto o normalizados al punto de tiempo de 0 h, ya que la constante de velocidad k refleja la tasa de cambio en lugar de los valores absolutos.
   2. Obtenga el I_DS normalizado dividiendo los valores de I_DS por el valor del punto de tiempo de 0 h (I_DS0), denominado I_DS/I_DS0.
3. Determinación de la constante de velocidad k
   1. Abra el software de análisis (Prism 10, GraphPad) y cree un nuevo proyecto haciendo clic en Archivo > Nuevo > Nuevo archivo de proyecto. En la pestaña Crear, elija XY. En la sección Opciones, establezca X en Números e Y en Intro y trace un único valor Y para cada punto.
   2. Importe los datos actuales del canal OECT I_DS a la tabla. Ajuste los datos de I_DS con el modelo de decaimiento exponencial monofásico haciendo clic en Analizar en la pestaña Análisis. Encuentre el método de regresión no lineal (ajuste de curva) en análisis XY. Asegúrese de seleccionar Todos los conjuntos de datos que deben ajustarse a la derecha y, a continuación, haga clic en Aceptar.
   3. En la nueva ventana Parámetros, seleccione Modelo de decaimiento de una fase en el grupo Exponencial y, a continuación, haga clic en Aceptar. La ecuación del modelo es la siguiente:
      Y=(Y0 - Meseta)*^e-k*X + Meseta
      Donde: Y es la corriente I_DS del canal OECT, T es el tiempo, k es la constante de velocidad.
   4. Una vez obtenidos los valores k, revise la calidad del ajuste comprobando el valor R cuadrado para cada ajuste. Un buen ajuste debe tener una R² superior a 0,95.
4. Prueba t de Student de dos colas no apareadas
   1. Para evaluar la significación estadística entre los grupos de la muestra, se deben realizar pruebas t de Student de dos colas no apareadas.
   2. Abra el software de análisis y cree un nuevo proyecto haciendo clic en Archivo > Nuevo > Nuevo archivo de proyecto. En la pestaña Crear, elija XY. En la sección Opciones, establezca X en Números e Y en Introducir 3 valores de réplica en subcolumnas en paralelo.
   3. Importe los valores k de la constante de tasa ajustada en la tabla. Realice la prueba t haciendo clic en Analizar en la pestaña Análisis. Encuentre el método de la prueba t (y las pruebas no paramétricas) en Análisis de columnas. Asegúrese de seleccionar Dos conjuntos de datos cada vez y, a continuación, haga clic en Aceptar.
   4. En el manual de Diseño experimental, seleccione No emparejado, Sí. Utilice la prueba paramétrica y la prueba t no emparejada. Supongamos que ambas poblaciones tienen las mismas opciones de SD. Los valores p se generarán para cada comparación. En las figuras, los valores p se representan de la siguiente manera: n.s.: p > 0,05 (no significativo), *: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001, ****: p ≤ 0,0001.
   5. Repita los pasos 4.4.3 -4.4.4 para todos los conjuntos de datos relevantes.

5. Limpieza y reutilización de dispositivos OECT

1. Después del experimento, desmonte el dispositivo y hierva los portaobjetos OECT en agua jabonosa (1:10, jabón: agua desionizada) durante 15 minutos.
2. Mueva rápidamente los portaobjetos a un vaso de precipitados que contenga agua desionizada a temperatura ambiente y espere 5 minutos para que los portaobjetos se enfríen. Enjuague los portaobjetos con DI y séquelos con aire limpio.
3. Mida la resistencia del canal OECT con un multímetro. Si la resistencia del canal está dentro del 400% del valor original, el dispositivo se puede reutilizar para el experimento después de la esterilización (Paso 3.1.1). Los portaobjetos OECT también se pueden limpiar siguiendo los siguientes pasos y son adecuados para la fabricación de canales mediante el paso 1.2.
   PRECAUCIÓN: La solución de piraña es altamente corrosiva y puede generar mucho calor. Utilice siempre el equipo de protección personal (EPP) adecuado, incluidos guantes, gafas y una bata de laboratorio. Manéjelo con extremo cuidado y obedezca las pautas de seguridad de la institución.
4. Prepare la solución de piraña en una campana extractora bien ventilada. Agregue con cuidado y lentamente un 30% (p/p) de peróxido de hidrógeno a un 98% de ácido sulfúrico en una proporción de 1:4 mientras revuelve inclinando suavemente el plato de cristalización hacia adelante y hacia atrás.
5. Coloque el plato de cristalización en una placa caliente calentada a 70 °C. Use pinzas para llevar y sumergir los portaobjetos en solución de piraña durante 1 minuto.
6. Transfiera con cuidado los portaobjetos a un vaso de precipitados que contenga agua desionizada y déjelos reposar durante al menos 1 minuto. Enjuague bien los portaobjetos con agua desionizada y séquelos con aire.
7. Deseche la solución de piraña de acuerdo con las pautas institucionales de eliminación de desechos químicos. Neutralice la solución de piraña añadiéndola lentamente a un vaso de precipitados que contenga una mezcla de agua helada de aproximadamente 4 veces el volumen de la solución. Agregue gradualmente un agente neutralizante (por ejemplo, 10 M de NaOH) mientras monitorea el pH con tiras reactivas hasta que esté neutro.

Resultados

Constante de velocidad ajustada k
La constante de velocidad ajustada k de la corriente de canal OECT I_DS sirve como una métrica fiable para evaluar la actividad EET de la muestra. Si bien los voltajes de polarización de puerta constante afectarían a las constantes de velocidad, elegimos 0,2 V para garantizar una polarización positiva que fomente la transferencia de electrones bacterianos, evitando al mismo tiempo un desd...

Discusión

Comparación de celdas electroquímicas (EC)
Una ventaja importante de ajustar la constante de velocidad de la corriente del canal OECT es que minimiza la variación del dispositivo al centrarse en la dinámica subyacente de los cambios de I_DS en lugar de la salida bruta. Combinado con la capacidad inherente de amplificación de señales de los OECT, este enfoque mejora la robustez de los sistemas híbridos de OECT en comparación con las celdas electroquí...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-oxohexanoyl-homoserine lactone	Sigma-Aldrich
anhydrotetracycline hydrochloride	VWR
casamino acids	VWR
Equipment
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich		anhydrous 99.8%,
HEPES buffer solution	VWR		1 M in water, pH = 7.3
isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside	Teknova
kanamycin sulfate	Growcells
Magnesium(II) sulfate heptahydrate	VWR
PEDOT:PSS aqueous suspension	Heraeus Epurio LLC	Clevios PH1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich
Potentiostat	PalmSens BV	MultiPalmSens4
Quartz microscopic slides	AdValue	FQ-S-003
Quartz microscopic slides
Sodium chloride	VWR
Sodium DL-lactate	TCI		60% in water
Sodium fumarate	VWR		98%
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich		95.0%-98.0%
Two-part silicone elastomer	Electron Microscopy Sciences	Sylgard184
Wolfe's Trace Mineral Mix	ATCC