Translation extrazellulärer Elektronentransferaktivitäten mit organischen elektrochemischen Transistoren

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die Verwendung von organischen elektrochemischen Transistoren (OECTs) vor, um die Aktivität des extrazellulären Elektronentransfers (EET) in Shewanella oneidensis in elektrische Signale zu übersetzen. Das hybride OECT-System bietet eine verbesserte Robustheit, Empfindlichkeit und das Potenzial für schnelle Tests mit hohem Durchsatz, was es zu einem effektiven Werkzeug für EET-Messungen macht.

Zusammenfassung

Der extrazelluläre Elektronentransfer (EET) ist ein Prozess, durch den bestimmte Mikroorganismen Elektronen über ihre Zellmembranen zu externen Elektronenakzeptoren übertragen können, wodurch der Zellstoffwechsel mit ihrer Umgebung verknüpft wird. Während Geobacter und Shewanella die primären Modelle für die EET-Forschung waren, zeigen neue Studien, dass EET-aktive Spezies auch mit der Fermentation und dem menschlichen Darmmikrobiom in Verbindung gebracht werden. Unter Ausnutzung der Fähigkeit von EET, biologische und elektronische Systeme zu überbrücken, stellen wir ein Protokoll für die Verwendung organischer elektrochemischer Transistoren (OECTs) vor, um mikrobielle EET-Aktivität in leicht nachweisbare elektrische Signale zu übersetzen. Dieses System ermöglicht die Nutzung zellulärer Reaktionen auf externe Reize für Biosensorik- und Biocomputing-Anwendungen. Insbesondere zeigten wir, dass die Dedotierung des p-Typ-Poly(3,4-ethylendioxythiophen)-Kanals von Poly(styrolesulfonat) (PEDOT: PSS) im OECT durch zelluläre EET von Shewanella oneidensis gesteuert wird. Durch die transkriptionelle Kontrolle des EET-Flusses durch genetische Schaltkreise etablieren wir die Biosensorfähigkeit dieses hybriden OECT-Systems zur Detektion chemischer Stimuli, wie z.B. Induktormoleküle. Darüber hinaus führen wir plasmidbasierte Boolesche Logikgatter in die Zellen ein, die es ihnen ermöglichen, Umweltsignale zu verarbeiten und Stromänderungen in den OECTs zu steuern, was das Biocomputing-Potenzial dieser Bauelemente weiter demonstriert. Diese Methode stellt eine neuartige Schnittstelle zwischen biologischen Systemen und Elektronik dar und ermöglicht zukünftige Hochdurchsatz-Screening-, Biosensorik- und Biocomputing-Anwendungen.

Einleitung

Bauelemente, die biologische und chemische Aktivitäten in elektrische Signale umwandeln und verstärken können, sind in verschiedenen Bereichen von entscheidender Bedeutung, z. B. bei der Sensorik ^1,2, beim neuromorphen Computing ^3,4 und bei der tragbaren Elektronik⁵. Unter diesen haben sich organische elektrochemische Transistoren (OECTs) aufgrund ihrer Kompatibilität mit wässrigen Umgebungen und niedrigen Betriebsspannungen als außergewöhnliche Schnittstellen zwischen biologischen Systemen und elektronischen Anzeigen herauskristallisiert ^6,7. OECTs unterscheiden sich von herkömmlicher Elektronik durch die Verwendung von Ionen in einem Elektrolyten, um die Leitfähigkeit eines organischen Kanals zu modulieren, der den Ionen- und den elektronischen Transport koppelt, um eine außergewöhnliche Transkonduktanz zu erreichen⁸. Diese Eigenschaften machen OECTs ideal für die Verbindung biologischer Systeme mit Elektronik, da sie schwache biologische Signale verstärken und in elektrische Anzeigen übersetzen können.

OECTs funktionieren, indem sie den Dotierungszustand eines gemischten ionisch-elektronischen leitenden Kanals durch ionische Diffusion verändern, typischerweise gesteuert durch Anlegen einer Spannung an der Gate-Elektrode. Biologische oder Redoxreaktionen können jedoch auch die Leitfähigkeit des Kanals verändern, so dass OECTs auf eine Vielzahl von chemischen und biologischen Reizen reagieren können. Die Funktionalisierung von OECTs mit Lipiddoppelschichten, Ionenkanälen oder Biomolekülen ermöglicht den Nachweis spezifischer Analyten, was sie für Sensoranwendungen nützlich macht ^9,10. Zum Beispiel wurden OECTs mit redoxaktiven Enzymen wie Glukoseoxidase integriert, um Elektronen direkt auf den Kanal zu übertragen und seine Leitfähigkeit als Reaktion auf die Glukosekonzentration einzustellen¹¹. Während solche Konfigurationen für die Biosensorik effektiv sind, sind sie aufgrund des relativ einfachen Verhaltens einzelner Enzyme oder Proteine in ihrer Rechenkapazität begrenzt.

Im Gegensatz dazu bieten lebende Zellen, insbesondere Bakterien, eine vielseitige Plattform, die in der Lage ist, komplexe und robuste Berechnungen durchzuführen 4,12,13,14,15. Elektroaktive Bakterien wie Shewanella oneidensis und Geobacter sulfurreducens haben die einzigartige Fähigkeit, Elektronen über ihre Zellmembranen zu übertragen, und zwar in einem Prozess, der als extrazellulärer Elektronentransfer (EET) bekannt ist. Unter anaeroben Bedingungen koppeln diese Bakterien ihre Stoffwechselprozesse an die Reduktion oder Oxidation externer Elektronenakzeptoren, einschließlich Metallen, Metalloxiden und synthetischen Materialien wie leitenden Polymeren¹⁶ und Nanopartikeln¹⁷ (Abbildung 1A). Diese Fähigkeit wurde in mikrobiellen Brennstoffzellen zur Stromerzeugung genutzt und bietet das Potenzial für fortschrittlichere bioelektronische Anwendungen^18,19. Darüber hinaus haben Fortschritte in der synthetischen Biologie eine präzise genetische Manipulation von elektroaktiven Bakterien ermöglicht, um EET-Signalwege zu kontrollieren. Durch die Entwicklung genetischer Schaltkreise, die die Expression von EET-bezogenen Genen regulieren, können Forscher den Elektronenfluss als Reaktion auf spezifische Umweltreize oder computerlogische Operationen modulieren^20,21. Diese genetische Kontrolle über EET eröffnet Wege für die Schaffung biohybrider Systeme, bei denen bakterielle Berechnungen direkt mit elektronischen Geräten wie OECTs verbunden sind. Zum Beispiel könnten bakterielle genetische Schaltkreise so gestaltet werden, dass sie auf Kombinationen chemischer Eingaben reagieren, EET-Signalwege ein- oder ausschalten und dadurch die Leitfähigkeit eines OECT-Kanals modulieren. Dies würde direkte elektrische Auslesungen von bakteriellen Berechnungen ermöglichen, ohne dass Fluoreszenz- oder andere traditionelle biologische Reporter erforderlich wären.

Jüngste Fortschritte haben das Potenzial der Kopplung von OECTs mit elektroaktiven Bakterien gezeigt. Zum Beispiel verwendeten Méhes et al. S. oneidensis , um die Echtzeit-EET-Aktivität mit einem p-Typ-OECT zu überwachen, was zeigte, wie der bakterielle Stoffwechsel elektrisch verfolgt werden konnte²². Während diese Arbeit die Möglichkeit hervorhebt, OECTs zum Nachweis bakterieller Aktivität zu verwenden, ist das Potenzial des Hybridsystems für Biosensorik und Biocomputing noch wenig erforscht. Um dieses Problem zu lösen, haben wir kürzlich Hybridtransistoren entwickelt, die gentechnisch veränderte S. oneidensis in p-Typ-OECTs^{integrieren 23}. Die Ergebnisse zeigten, dass der OECT-Kanal durch bakterielle EET-Aktivitäten entdotiert werden konnte (Abbildung 1B). Um die Fähigkeiten der Biosensorik weiter zu verbessern und mechanistische Einblicke in den De-Doping-Prozess zu gewinnen, haben wir S . oneidensis-Stämme mit genetischen Schaltkreisen entwickelt, die den EET-Fluss regulieren. Dies führt zu vorhersehbaren Änderungen des OECT-Ausstoßes als Reaktion auf Umweltreize wie z. B. Induktionsmoleküle. Darüber hinaus ermöglichten wir durch die Integration der booleschen Logik in diese genetischen Schaltkreise direkte elektrische Auslesungen komplexer bakterieller Berechnungen.

Hier stellen wir das umfassende Protokoll für den Betrieb des Hybridtransistors vor, das die Herstellung des Geräts, die Vorbereitung der Zellkultur, die Messverfahren und die Datenanalyse abdeckt. Darüber hinaus befassen wir uns mit wichtigen Überlegungen wie Gerätereinigung, Wiederverwendbarkeit und dem Automatisierungspotenzial bei Hochdurchsatztests.

Protokoll

HINWEIS: Alle Chemikalien wurden ohne weitere Reinigung so verwendet, wie sie erhalten wurden. Falls nicht angegeben, wurden Chemikalien in analytischer Qualität verwendet.

1. Herstellung von OECT-Geräten

HINWEIS: Die OECTs werden auf Quarzmikroskop-Objektträgern unter Verwendung von Standard-Mikrofabrikationstechniken hergestellt, die aus früheren Arbeiten^{angepasst wurden 24}. Wie in Abbildung 2A gezeigt, sind acht OECT-Geräte auf einer einzigen Standardfolie angeordnet. Vorgeschnittene Polydimethylsiloxan (PDMS)-Platten werden auf den Objektträger gelegt, um OECT-Kammern und Zugangsöffnungen zu bilden. Für den OECT-Kanal und die Gate-Elektrode wird das p-Typ leitendes Polymer Poly(3,4-ethylendioxythiophen): Poly(styrolesulfonat) (PEDOT: PSS) verwendet, mit Abmessungen von 150 μm x 10 μm für den Kanal und 500 μm x 500 μm für die Gate-Spitze ( Abbildung 2B). Eine Zusammenfassung des Herstellungs- und Montageprozesses des OECT-Kanals ist in Abbildung 2C dargestellt.

1. Herstellung von Goldelektroden
   1. Reinigen Sie die Quarzobjektträger, indem Sie sie mit Aceton, Isopropylalkohol (IPA) und deionisiertem (DI) Wasser abspülen. Mit N₂ Gas trocken föhnen.
   2. Die O₂ -Plasmareinigung mit 50 sccm bei 150 W für 120 s durchführen.
   3. Spin-Coat-Fotolack AZ5209e (PR) mit 2 Stufen: erste bei 500 U/min, 100 U/min Beschleunigung für 5 s und zweite bei 2000 U/min, 1000 U/min Beschleunigung für 45 s.
   4. Bei 90 °C 150 s hart backen.
   5. Schalten Sie den Masken-Aligner (Süss MA6) ein und wählen Sie i-line (365 nm) als UV-Quelle, stellen Sie die Parameter ein: Belichtungszeit auf 3,5 s (13 W), Ausrichtungsabstand bei 15 μm, WEC-Typ auf Kontakt. und Expositionsart auf Hart.
   6. Legen Sie die Lithografiemaske und den Objektträger in den Aligner ein, richten Sie den Objektträger an der Maske aus und führen Sie dann die Erstbelichtung durch.
   7. Bei 110 °C 180s backen.
   8. Entfernen Sie die Lithografiemaske und führen Sie die Flutbelichtung mit den folgenden Parametern durch: Belichtungszeit als 25 s (13 W), Belichtungsart als Flut E.
   9. Entwickeln Sie die PR mit dem AZ 400K 1:4 Entwickler vom Hersteller vorverdünnt. Gießen Sie die entsprechende Menge des Entwicklers in eine Kristallisationsschale, um den Objektträger einzutauchen, und schütteln Sie die Schale 45 s lang ständig mit kreisenden Bewegungen. Entfernen Sie dann sofort den Objektträger und weichen Sie ihn 45 s lang in DI-Wasser ein, spülen Sie ihn mit DI-Wasser ab und föhnen Sie ihn mit N₂.
      HINWEIS: Der Vorgang kann hier pausiert werden.
   10. Schieben Sie die Objektträger in den E-Beam-Verdampfer. Pumpen Sie auf 2,7 x ^10-4 Pa (2 x ^10-6 T) oder weniger.
   11. Die Ti-Klebeschicht (10 nm) und Au (100 nm) nacheinander abscheiden. Die Abscheidungsgeschwindigkeit kann je nach verwendetem Verdampfer variieren. Eine Abscheidegeschwindigkeit von 0,1 nm/s wird empfohlen, um ein gutes Gleichgewicht zwischen Abscheidungsqualität und Verarbeitungszeit zu erreichen.
   12. Entfernen Sie das überschüssige Metall, indem Sie die Objektträger über Nacht in Aceton einweichen. Verwenden Sie nach dem Einweichen eine Pipette, um Acetonströme auf die Objektträgeroberfläche zu spritzen, um überschüssiges Metall zu entfernen. Die nach den obigen Schritten erhaltenen Quart-Objektträger werden als OECT-Elektroden-Objektträger bezeichnet.
       HINWEIS: Alternativ können Sie auch Ultraschall verwenden, um das überschüssige Metall zu entfernen.
2. PEDOT: Herstellung von PSS-Kanälen
   1. Reinigen Sie die Objektträger der OECT-Elektroden, indem Sie sie mit Aceton, IPA und DI-Wasser abspülen. Mit N₂ Gas trocken föhnen.
   2. Die Dias mindestens 5 min bei 160 °C backen. Lassen Sie die Objektträger abkühlen, bevor Sie sie schleudern.
   3. Schleudermantel AZ5209e PR mit 2 Stufen: zuerst bei 500 U/min, 100 U/min Beschleunigung für 5 s, gefolgt von 2000 U/min, 1000 U/min Beschleunigung bei 45 s.
   4. Bei 90 °C 150 s hart backen.
   5. Beginnen Sie die Erstbelichtung mit i-Line im Hartkontaktmodus für 3,5 s bei 13 W.
   6. Bei 110 °C 180 s backen.
   7. Führen Sie eine Flutbelichtung für 25 s bei 13 W durch.
   8. Entwickeln Sie mit dem AZ 400K 1:4 Entwickler für 45 s bei ständigem kreisförmigem Schütteln der Schale. Dann die Objektträger 45 s lang in DI-Wasser einweichen, mit DI-Wasser abspülen und mit N₂ föhnen.
      HINWEIS: Der Vorgang kann hier pausiert werden.
   9. Beschallen Sie die PEDOT: PSS-Dispergierung für 5 Minuten, indem Sie die Flasche auf einem DI-Wasserbad schwimmen, das bis zur Fülllinie des Ultraschallgeräts gefüllt ist. Filtern Sie die PEDOT: PSS-Dispersion mit einem 0,22 μm Filter, um Klumpen zu entfernen.
   10. Schleuderbeschichtung PEDOT: PSS bei 3500 U/min mit Beschleunigung bei 3500 U/min für 60 s. Bei 90 °C 15 Min. trocknen.
   11. Entfernen Sie überschüssigen PEDOT:PSS-Film, indem Sie die Objektträger 12 Minuten lang in Aceton einweichen, gefolgt von 1 Minute Beschallung.
   12. Die Objektträger mit Aceton und dann mit IPA abspülen und mit N₂ föhnen.
   13. Führen Sie eine Ethylenglykol (EG)-Behandlung durch, indem Sie die Objektträger bei 90 °C über die Heizplatte legen und dann genügend EG auftropfen lassen, um alle PEDOT: PSS für 5 Minuten zu bedecken. Mit DI-Wasser abspülen und mit N₂ föhnen. Die nach den obigen Schritten erhaltenen Quart-Objektträger werden als OECT-Objektträger bezeichnet.
3. Herstellung von PDMS-Gerätekammern
   1. Stellen Sie PDMS-Platten her, indem Sie die Basis und das Härter im Verhältnis 10:1 mischen. Gießen Sie die Lösung in die Form, um eine Dicke von 3 mm zu erreichen, und entgasen Sie sie 1 h lang in einer 2-Viertel-Entgasungskammer, die an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist.
   2. Härten Sie die Mischung aus, indem Sie die Form für 48 Stunden bei Raumtemperatur auf eine nivellierte Bank stellen, um glatte PDMS-Oberflächen zu gewährleisten. Decken Sie die Form ab, um eine Kontamination durch Schmutz in der Luft zu vermeiden.
   3. Schneiden Sie das PDMS mit Rasierklingen aus und erstellen Sie die Gerätekammern und Flüssigkeitsaustauschöffnungen mit kreisförmigen Lochern mit Durchmessern von 5 mm bzw. 1,5 mm. Stellen Sie sicher, dass die Höhe des PDMS 3 mm beträgt, wie beim Formguss kontrolliert (Schritt 1.3.1)

2. Vorbereitung der Medien

1. Autoklavieren Sie 500 ml Reinstwasser, vier Dosiernadeln aus Edelstahl, zwei Gummikolbenkappen (für die 250-ml-Rundkolben), zwei 250-ml-Rundkolben und eine 500-ml-Glasmedienflasche. Lagern Sie das sterile Reinstwasser bei 4 °C für die zukünftige Verwendung.
2. Bereiten Sie das 2x Shewanella Basalmedium (SBM) mit 2x Wolfe's Trace Mineral Mix 0,1% Casaminosäuren gemäß Tabelle 1 vor. Filter: Sterilisieren Sie das Medium mit einem Filter auf dem Flaschendeckel in den Boden des sterilen Glasmediums (erhalten in Schritt 2.1). Dieses Medium wird als 2x SBM++ bezeichnet, wobei jedes + die Zugabe von Spurenelementmischung und Casaminosäuren anzeigt. Für die zukünftige Verwendung bei 4 °C lagern.
3. Steriles Filtern (0,22 μm Filter) jeder der folgenden Chemikalien separat: 50 mL 1 M Natriumfumarat in ein steriles 50 mL Zentrifugenröhrchen; 1 ml 2,5 mg/ml Kanamycin (KAN), bezeichnet als 100x KAN, in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 1 ml 60 % w/w steriles Natriumlactat (wie erhalten) in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Alle vorbereiteten Lösungen bei 4 °C lagern.
4. 1 ml der folgenden Chemikalien werden separat in sterilen Mikrozentrifugenröhrchen hergestellt: 100 mM Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG), bezeichnet als 100x IPTG; 10 mM 3-Oxohexanoyl-homoserin-lacton (OC6), bezeichnet als 100x OC6; 1 mM Anhydrotetracyclinhydrochlorid (aTc), bezeichnet als 100x aTc. Für die zukünftige Verwendung bei 4 °C lagern.
5. Mit den sterilisierten Kolben, Gummikappen und Nadeln, die in Schritt 2.1 vorbereitet wurden, wird der mittlere Vorrat gespült. Verteilen Sie je 200 mL steriles 2X SBM++ und Reinstwasser in separate 250 mL Rundkolben. Verschließen Sie die Kolben mit Gummikappen und setzen Sie sterile Dosiernadeln ein, um eine Gaswaschanlage zu erstellen (Lufteinlassnadel in die Flüssigkeit eingetaucht; Gasaustrittsnadel über der Flüssigkeitsoberfläche). Spülen Sie mit N₂ für 15 min.
6. Übertragen Sie das gespülte 2x SBM++ und Reinstwasser, Laktat, 1 M Natriumfumarat, 100x KAN, 100x IPTG, 100x OC6 und 100x aTc in die Glovebox zur weiteren Verwendung mit dem OECT.

3. Überwachung der zellularen EET mit OECT-Geräten

HINWEIS: Um die Anaerobität zu gewährleisten, wird das OECT-Experiment in einer Glovebox ohne Feuchtigkeitskontrolle bei Raumtemperatur durchgeführt.

1. Tag 1
   1. Sterilisation und Vorbereitung des Geräts
      1. Autoklavieren Sie die OECT-Objektträger, PDMS-Platten und die Ag/AgCl-Referenzelektrode (RE) in separaten Behältern. Trocknen durch Backen bei 80 °C. Bringen Sie die autoklavierten OECT-Objektträger und Ag/AgCl RE in die Glovebox.
      2. Desorbieren Sie den eingeschlossenen Sauerstoff in den PDMS-Blättern, indem Sie ihn 4 h lang dem Vakuum in der Vorkammer des Handschuhfachs aussetzen. Bauen Sie das OECT-Gerät zusammen, indem Sie die PDMS-Blätter über die OECT-Objektträger im Handschuhfach legen.
      3. Injizieren Sie 45 μl des entsprechenden SBM-Mediums in jede OECT-Kammer. Verwenden Sie für die meisten Experimente 1x SBM++, ergänzt mit 20 mM Laktat. Bereiten Sie beispielsweise 1 ml 1x SBM++ vor, indem Sie 500 μl 2x SBM++, 497 μl steriles Reinstwasser und 2,85 μl 60 Gew.-% Natriumlaktat mischen.
      4. Decken Sie die Anschlüsse der OECT-Kammer mit PDMS-Platten ab, um Verdunstung und Kontamination des Mediums zu vermeiden.
      5. Überwachen Sie den OECT-Kanalstrom I_DS bei einer konstanten Kanalspannung V_DS von -0,05 V und der Gate-Spannung V_GS von 0,2 V, bis sich der Strom stabilisiert hat. Die Spannungsauswahl kann je nach OECT-Gerät oder biologischen Proben variieren. Verwenden Sie während der gesamten Messung die gleichen kontinuierlichen Bias-Spannungen für das Gate und den Kanal. Die Stabilisierung kann je nach Vakuumniveau und Desorptionsdauer in der Vorkammer Stunden bis zu einigen Tagen dauern.
   2. Zellkulturen
      1. Zellbestände (gelagert bei -80 °C) werden auf Agarplatten gestreift, die LB (für nicht-plasmidbeherbergende Stämme) oder LB mit 25 μg/ml Kanamycin (für plasmidbeherbergende Stämme) enthalten, und wachsen aerob über Nacht bei 30 °C ^20,23.
2. Tag 2
   1. Zellvorbereitung (aerobe Kulturen)
      1. Entnehmen Sie nach dem Zufallsprinzip einzelne Kolonien aus den LB-Agarplatten (erhalten in Schritt 3.1.2.1) in 2 mL 1x SBM++, ergänzt mit 20 mM Laktat in 15 mL Kulturröhrchen. Bewahren Sie die Zellen über Nacht bei 30 °C und 250 U/min unter Schütteln auf. Bereiten Sie 6 ml Wachstumsmedium ohne Zellen als abiotische Kontrolle vor, das später bei der Zellwäsche verwendet wird.
   2. Zellvorbereitung (anaerobe Kultur)
      1. Übertragen Sie die LB-Agarplatten mit den zu testenden Stämmen in die Glovebox.
      2. Entnahme von einzelnen Kolonien nach dem Zufallsprinzip aus LB-Agarplatten in 1 ml geeignetem SBM, ergänzt mit 20 mM Laktat und 40 mM Fumarat in 15 mL Kulturröhrchen. Bereiten Sie beispielsweise 1 ml Medium für den IPTG-induzierbaren Stamm vor, der 1 mM IPTG und 25 μg/ml KAN erfordert, indem Sie 500 μl 2x SBM++, 437 μl steriles Reinstwasser, 2,85 μl 60 % w/w Natriumlactat, 40 mM 1 M Natriumfumarat, 10 μl 100 mM IPTG und 10 μl 2,5 mg/ml KAN mischen.
      3. Halten Sie die Zellen 18 - 24 h lang bei 30 °C ohne Schütteln. Um die Vergleichbarkeit zwischen den Versuchschargen zu gewährleisten, sollten die Wachstumszeiten konstant bleiben.
3. Tag 3
   1. Erste elektrochemische OECT-Messung
      HINWEIS: Die Art der OECT-Charakterisierungen variiert von statischen Typen, wie z. B. Konstantspannungsvorspannung, bis hin zu dynamischen Typen, wie z. B. Gate-Pulsing. Hier verwenden wir den Gate-Spannungsstufentest, um sowohl dynamische als auch statische Eigenschaften zu erhalten. Die Neukonfiguration der elektrischen Verbindung zwischen OECTs und dem Instrument (in diesem Fall einem Mehrkanal-Potentiostaten) wird durch kundenspezifische manuelle Multiplex-Leiterplatten (MUX) unterstützt. Für die Hochdurchsatzmessung können automatisierte MUX-Boards entwickelt werden.
      1. Messen Sie den OECT-Kanalstrom I_DS entsprechend dem Gate-Spannungsschritt von 0 V bis 0,2 V mit den unten beschriebenen Einstellungen (genaue Bezeichnungen können je nach Gerät variieren).
      2. Instrumentenkanal 1 misst den Strom I_DS des OECT-Kanals. Legen Sie dazu den Namen der Technik fest: Schnelle Amperometrie; Äquilibrierungszeit: 1 s; Gleichgewichtsspannung: - 0,05 V; Bias-Spannung: -0,05 V; Laufzeit: 14 s; Abtastintervall: 0,5 ms.
      3. Instrumentenkanal 2 steuert die OECT-Gate-Spannung V_GS. Legen Sie dazu den Namen der Technik fest: Gemischter Modus; Zustandszeit: 1 s; Bedingungsspannung: 0 V; Modus Stufe 1: Konstante E; Vorspannung Stufe 1: 0 V; Laufzeit Stufe 1: 4 s; Modus Stufe 2: Konstante E; Vorspannung Stufe 2: 0,2 V; Laufzeit Stufe 2: 10 s; Abtastintervall: 0,5 ms.
      4. Wiederholen Sie den Gate-Spannungsstufentest (Schritte 3.3.1.1 bis 3.3.1.3) für alle OECTs. Dieser Schritt kann für Hochdurchsatztests automatisiert werden.
      5. Legen Sie bis zur Inokulation eine konstante Kanalspannung V_DS von -0,05 V und eine Gate-Spannung V_GS von 0,2 V an alle OECTs an. Stellen Sie sicher, dass die Vorspannungen mit denen übereinstimmen, die während der Gerätestabilisierung (Schritt 3.1.1.5) verwendet werden.
   2. Inokulumvorbereitung (aerobe Kulturen)
      1. Waschen Sie die Zellen dreifach, indem Sie sie 4 Minuten lang bei 1503 x g zentrifugieren und in 1 ml frischem Medium, das für das Zellwachstum verwendet wird, resuspendieren (Schritt 3.2.1.1). Nach dem letzten (3^.) Spin resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 ml (oder der Hälfte des ursprünglichen Kulturvolumens), um eine konzentrierte Zellsuspension bei OD₆₀₀ von 1 - 3,5 zu erhalten. Passen Sie die endgültige Aufhängungslautstärke entsprechend an.
      2. Übertragen Sie die Zellsuspension in die Glovebox.
      3. Um das Inokulum zu erhalten, verdünnen Sie die Zellen auf einen vorgesehenen OD₆₀₀ von 0,1 (oder das 10-fache der Inokulation OD₆₀₀). Das Wahnmedium hat die gleiche Konstitution wie das Wachstumsmedium, bereitet es aber frisch im Handschuhfach mit gereinigten Medienvorräten vor. Wenn zum Beispiel Zellen aerob in SBM++ gezüchtet wurden, die mit Laktat ergänzt wurden, bereiten Sie frisches SBM++, das mit Laktat ergänzt wurde, in der Glovebox für die Inokulumverdünnung vor.
      4. Stoppen Sie den Potentiostaten. Injizieren Sie 5 μl des Inokulums in die OECT-Kammer (mit 45 μl geeignetem SBM), um einen endgültigen OD₆₀₀ von 0,01 im OECT zu erreichen. Decken Sie die Anschlüsse der OECT-Kammer mit PDMS-Platten ab, um Verdunstung und Kontamination des Mediums zu vermeiden.
   3. Inokulumvorbereitung (anaerobe Kulturen)
      1. Um das Inokulum zu erhalten, verdünnen Sie die Zellkulturen 10-fach. Verwende ein Wahnmedium, das die gleiche Konstitution wie das Wachstumsmedium hat, aber das Fumarat fehlt. Wenn beispielsweise Zellen anaerob in SBM++ gezüchtet wurden, das mit Laktat, Fumarat, KAN und IPTG ergänzt wurde, bereiten Sie frisches SBM++ mit Laktat, KAN und IPTG in der Glovebox für die Inokulumverdünnung vor.
      2. Stoppen Sie den Potentiostaten. Injizieren Sie 5 μl des Inokulums in die OECT-Kammer (enthält 45 μl des entsprechenden SBM). Decken Sie die Anschlüsse der OECT-Kammer mit PDMS-Platten ab, um Verdunstung und Kontamination des Mediums zu vermeiden.
   4. Kontinuierliche Messung und Zeitpunkte
      1. Anlegen konstanter Bias-Spannungen an die OECT-Kanäle (V_DS = -0,05 V) und das Gate (V_GS = 0,2 V) während des gesamten Experiments, außer bei Zeitpunktmessungen, bei denen der Potentiostat zur Charakterisierung an einzelne OECTs angeschlossen ist.
      2. Führen Sie das Experiment nach der Inokulation 24 Stunden lang durch. Betrachten Sie die Messung vor der Inokulation (siehe Schritt 3.3.1) als 0-h-Zeitpunkt.
      3. Signifikante Veränderungen des Dotierungszustands des OECT-Kanals treten typischerweise während der ersten 8 Stunden auf. Wählen Sie 5-7 Zeitpunkte für Messungen in diesem Zeitraum, gefolgt von einer Messung zwischen 12 h und 16 h und dem letzten Zeitpunkt bei der 24-Stunden-Marke. Beispielzeitpunkte könnten unmittelbar nach der Inokulation und zu 1 h, 2 h, 3 h, 4,5 h, 6 h, 8 h, 18 h und 24 h Zeitpunkte nach der Inokulation sein.
      4. Um nächtliche Messungen zu vermeiden, beginnen Sie mit der Impfung (siehe Schritt 3.3.2 oder 3.3.3) früh am Tag, um die häufigen Messungen zu einem bestimmten Zeitpunkt in den ersten 8 Stunden zu ermöglichen.
      5. Wiederholen Sie den in 3.3.1 beschriebenen Schritt für jede Messung zum Zeitpunkt.
4. Tag 4
   1. Messung der Transferkurve zum letzten Zeitpunkt (24 h)
      1. Führen Sie das Ag/AgCl RE in die OECT-Kammer ein, indem Sie das RE vorsichtig drehen und durch die Flüssigkeitswechselöffnung drücken.
      2. Messen Sie die Übertragungskurven des OECT, indem Sie die Gate-Spannung von -0,1 V auf 0,6 V schwenken, während Sie den Kanalstrom I_DS mit konstanter Vorspannung V_DS bei -0,05 V überwachen. Messen Sie die genauen Gate- und Source-Elektrodenpotentiale gegen das Ag/AgCl RE.
      3. Konfigurieren Sie das Gerät wie unten beschrieben (die genauen Namen können je nach Gerät variieren).
      4. Gerätekanal 1 misst den Strom des OECT-Kanals I_DS, verwenden Sie die folgende Einstellung: Technikname: Chronoamperometrie (CA), Äquilibrierungszeit: 5 s, Äquilibrierungsspannung: - 0,05 V, Bias-Spannung: -0,05 V, Laufzeit: 35 s, Abtastintervall: 0,09915 s.
      5. Instrumentenkanal 2 steuert die OECT-Gate-Spannung V_GS, verwenden Sie die folgende Einstellung: Technikname: Lineare Sweep-Voltammetrie (LSV), Äquilibrierungszeit: 5 s, Äquilibrierungsspannung: - 0,1 V, Anfangsspannung: -0,1 V, Endspannung: 0,6 V, Spannungsschritt: 0,002 V, Abtastrate: 0,02 V/s.
      6. Gerätekanal 3 misst das OECT-Quellenpotential V_S gegen Ag/AgCl RE, verwenden Sie die folgende Einstellung: Technikname: Open Circuit Potentiometrie (OCP), Laufzeit: 40 s, Abtastintervall: 0,09915 s.
      7. Instrumentenkanal 4 misst das OECT-Gate-Potential V_G gegen Ag/AgCl RE, verwenden Sie die folgende Einstellung: Name der Technik: Open Circuit Potentiometrie (OCP), Laufzeit: 40 s, Abtastintervall: 0,09915 s.
      8. Wiederholen Sie die Messung der Übertragungskurve für alle OECTs. Spülen Sie die Ag/AgCl-Referenzelektrode (RE) nach jeder Messung mit 70 % Ethanol und wischen Sie sie mit einem neuen fusselarmen Handtuch ab. Das Ag/AgCl RE kann innerhalb derselben Probengruppe für die Triplikate wiederverwendet werden, sollte jedoch nicht zwischen verschiedenen Probengruppen wiederverwendet werden.

4. Datenanalyse

1. Datenextraktion
   1. Verwenden Sie benutzerdefinierten MATLAB-Code für die Datenverarbeitung, um die Extraktion und Protokollierung von Daten aus der nativen Software des Geräts zu automatisieren und so die Verarbeitungszeit erheblich zu verkürzen. MATLAB-Skripte sind im Texas Data Repository (https://doi.org/10.18738/T8/MNKO8D) verfügbar.
2. Datenverarbeitung
   1. Passen Sie die Daten des OECT-Kanalstroms I_DS an, um die Geschwindigkeitskonstanten k für weitere Analysen und Vergleiche zu erhalten (Abbildung 3). Für EET-fähige Zellproben ist aus unserer Sicht das einzelne Exponentialmodell am besten geeignet. Daher haben wir das einphasige exponentielle Zerfallsmodell in der Analysesoftware verwendet, um die I DS-Zeitreihendaten anzupassen und die angepasste Geschwindigkeitskonstante k zu erhalten. Diese I DS-Zeitreihendaten können der Rohwert sein oder auf den Zeitpunkt 0 h normiert werden, da die Geschwindigkeitskonstante k für die Änderungsrate und nicht für die absoluten Werte gilt.
   2. Ermitteln Sie den normierten I_DS , indem Sie die I_DS-Werte durch den 0-Stunden-Zeitpunktwert (I_DS0) dividieren, der als_{I DS}/I_DS0 bezeichnet wird.
3. Bestimmung der Kurskonstante k
   1. Öffnen Sie die Analysesoftware (Prism 10, GraphPad) und erstellen Sie ein neues Projekt, indem Sie auf Datei > Neu > Neue Projektdatei klicken. Wählen Sie auf der Registerkarte Create die Option XY aus. Legen Sie im Abschnitt Optionen X auf Zahlen und Y auf Eingabe fest, und zeichnen Sie für jeden Punkt einen einzelnen Y-Wert.
   2. Importieren Sie die aktuellen I_DS-Daten des OECT-Kanals in die Tabelle. Passen Sie die I_DS-Daten an das Modell des einphasigen exponentiellen Zerfalls an, indem Sie auf der Registerkarte Analyse auf Analysieren klicken. Suchen Sie die Methode Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung) in XY-Analysen. Stellen Sie sicher, dass Sie auf der rechten Seite Alle Datensätze auswählen, die angepasst werden müssen, und klicken Sie dann auf OK.
   3. Wählen Sie im neuen Parameterfenster in der Gruppe "Exponential" die Option " Einphasiges Zerfallsmodell " aus und klicken Sie dann auf "OK". Die Modellgleichung lautet wie folgt:
      Y=(Y0 - Plateau)*^e-k*X + Plateau
      Dabei gilt: Y ist der Strom I_DS des OECT-Kanals, T die Zeit und k die Ratenkonstante.
   4. Nachdem die k-Werte abgerufen wurden, überprüfen Sie die Anpassungsqualität, indem Sie den R-Quadrat-Wert für jede Anpassung überprüfen. Eine gute Armatur sollte einen R² größer als 0,95 haben.
4. Unpaariger zweiseitiger Student's t-Test
   1. Um die statistische Signifikanz zwischen den Stichprobengruppen zu bewerten, führen Sie unpaarige two-tailed Student's t-Tests durch.
   2. Öffnen Sie die Analysesoftware und erstellen Sie ein neues Projekt, indem Sie auf Datei > Neu > Neue Projektdatei klicken. Wählen Sie auf der Registerkarte Create die Option XY aus. Legen Sie im Abschnitt Optionen X auf Zahlen und Y auf Geben Sie 3 Replikationswerte in nebeneinander liegenden Unterspalten ein.
   3. Importieren Sie die Werte der angepassten Geschwindigkeitskonstante k in die Tabelle. Führen Sie den t-Test durch, indem Sie auf der Registerkarte Analyse auf Analysieren klicken. Suchen Sie die Methode t-Test (und nichtparametrische Tests) unter Spaltenanalysen. Stellen Sie sicher, dass Sie "Jedes Mal zwei Datensätze" auswählen, und klicken Sie dann auf "OK".
   4. Wählen Sie im Handbuch Experimentelles Design die Option Ungekoppelt, Ja aus. Verwenden Sie den parametrischen Test und den ungepaarten t-Test. Angenommen, beide Populationen verfügen über die gleichen SD-Optionen. Die p-Werte werden für jeden Vergleich generiert. In Abbildungen werden p-Werte wie folgt dargestellt: n.s.: p > 0,05 (nicht signifikant), *: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001, ****: p ≤ 0,0001.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 4.4.3 bis 4.4.4 für alle relevanten Datensätze.

5. Reinigung und Wiederverwendbarkeit von OECT-Geräten

1. Nach dem Experiment zerlegen Sie das Gerät und kochen die OECT-Objektträger in Seifenwasser (1:10, Seife: DI-Wasser) für 15 min.
2. Schieben Sie die Objektträger schnell in ein Becherglas mit raumwarmem DI-Wasser und warten Sie 5 Minuten, bis die Objektträger abgekühlt sind. Spülen Sie die Objektträger mit DI ab und föhnen Sie sie mit sauberer Luft.
3. Messen Sie den Widerstand des OECT-Kanals mit einem Multimeter. Liegt der Kanalwiderstand innerhalb von 400 % des ursprünglichen Wertes, kann das Gerät nach der Sterilisation (Schritt 3.1.1) für den Versuch wiederverwendet werden. Die OECT-Objektträger können auch mit den folgenden Schritten gereinigt werden und sind für die Kanalherstellung nach Schritt 1.2 geeignet.
   ACHTUNG: Piranha-Lösung ist stark korrosiv und kann erhebliche Hitze erzeugen. Verwenden Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel. Gehen Sie mit äußerster Vorsicht vor und befolgen Sie die Sicherheitshinweise der Institution.
4. Bereiten Sie die Piranha-Lösung in einem gut belüfteten Abzug vor. Vorsichtig und langsam 30 % (w/w) Wasserstoffperoxid zu 98 % Schwefelsäure im Verhältnis 1:4 unter Rühren hinzufügen, indem Sie die Kristallisationsschale vorsichtig hin und her kippen.
5. Stellen Sie die Kristallisationsschale auf eine auf 70 °C erhitzte Platte. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Objektträger zu bringen und 1 Minute lang in Piranha-Lösung zu tauchen.
6. Übertragen Sie die Objektträger vorsichtig in ein Becherglas mit DI-Wasser und lassen Sie sie mindestens 1 Minute ruhen. Spülen Sie die Objektträger gründlich mit DI-Wasser ab und föhnen Sie sie mit Luft.
7. Entsorgen Sie die Piranha-Lösung gemäß den Richtlinien für die Entsorgung chemischer Abfälle in der Anstalt. Neutralisieren Sie die Piranha-Lösung, indem Sie sie langsam in ein Becherglas geben, das ein Eis-Wasser-Gemisch enthält, das etwa das 4-fache Volumen der Lösung hat. Fügen Sie nach und nach ein Neutralisationsmittel (z. B. 10 M NaOH) hinzu und überwachen Sie den pH-Wert mit Teststreifen, bis er neutral ist.

Ergebnisse

Angepasste Geschwindigkeitskonstante k
Die angepasste Geschwindigkeitskonstante k des OECT-Kanalstroms I_DS dient als zuverlässige Metrik zur Beurteilung der EET-Aktivität der Probe. Während die konstanten Gate-Bias-Spannungen die Geschwindigkeitskonstanten beeinflussen würden, wählen wir 0,2 V, um eine positive Bias zu gewährleisten, um den bakteriellen Elektronentransfer zu fördern und gleichzeitig eine schnelle Entd...

Diskussion

Vergleich der elektrochemischen Zelle (EC)
Ein großer Vorteil der Anpassung der Ratenkonstante aus dem OECT-Kanalstrom besteht darin, dass die Variation des Bauteils minimiert wird, indem der Schwerpunkt auf der zugrunde liegenden Dynamik der I_{DS-Änderungen} und nicht auf der Rohausgabe liegt. In Kombination mit der inhärenten Signalverstärkungsfähigkeit von OECTs erhöht dieser Ansatz die Robustheit von hybriden OECT-Systemen im Vergleich zu herkömmli...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-oxohexanoyl-homoserine lactone	Sigma-Aldrich
anhydrotetracycline hydrochloride	VWR
casamino acids	VWR
Equipment
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich		anhydrous 99.8%,
HEPES buffer solution	VWR		1 M in water, pH = 7.3
isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside	Teknova
kanamycin sulfate	Growcells
Magnesium(II) sulfate heptahydrate	VWR
PEDOT:PSS aqueous suspension	Heraeus Epurio LLC	Clevios PH1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich
Potentiostat	PalmSens BV	MultiPalmSens4
Quartz microscopic slides	AdValue	FQ-S-003
Quartz microscopic slides
Sodium chloride	VWR
Sodium DL-lactate	TCI		60% in water
Sodium fumarate	VWR		98%
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich		95.0%-98.0%
Two-part silicone elastomer	Electron Microscopy Sciences	Sylgard184
Wolfe's Trace Mineral Mix	ATCC