Traduzindo atividades de transferência de elétrons extracelulares com transistores eletroquímicos orgânicos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de transistores eletroquímicos orgânicos (OECTs) para traduzir a atividade de transferência de elétrons extracelulares (EET) em Shewanella oneidensis em sinais elétricos. O sistema OECT híbrido oferece maior robustez, sensibilidade e potencial para testes rápidos e de alto rendimento, tornando-o uma ferramenta eficaz para medições de EET.

Resumo

A transferência extracelular de elétrons (EET) é um processo pelo qual certos microrganismos podem transferir elétrons através de suas membranas celulares para aceptores externos de elétrons, ligando o metabolismo celular ao seu ambiente. Embora Geobacter e Shewanella tenham sido os principais modelos para a pesquisa de EET, estudos emergentes revelam que as espécies ativas de EET também estão associadas à fermentação e ao microbioma intestinal humano. Aproveitando a capacidade do EET de unir sistemas biológicos e eletrônicos, apresentamos um protocolo para o uso de transistores eletroquímicos orgânicos (OECTs) para traduzir a atividade microbiana do EET em sinais elétricos facilmente detectáveis. Este sistema permite o uso de respostas celulares a estímulos externos para aplicações de biossensoriamento e biocomputação. Especificamente, demonstramos que a desdopagem do canal poli (3,4-etilenodioxitiofeno) do tipo p: poli (estirenossulfonato) (PEDOT: PSS) no OECT é impulsionada pelo EET celular de Shewanella oneidensis. Ao controlar transcricionalmente o fluxo de EET por circuitos genéticos, estabelecemos a capacidade de biossensoriamento deste sistema híbrido OECT para detectar estímulos químicos, como moléculas indutoras. Além disso, introduzimos portas lógicas booleanas baseadas em plasmídeo dentro das células, permitindo que elas processem sinais ambientais e conduzam mudanças de corrente nos OECTs, demonstrando ainda mais o potencial de biocomputação desses dispositivos. Este método fornece uma nova interface entre sistemas biológicos e eletrônicos, permitindo futuras aplicações de triagem, biossensoriamento e biocomputação de alto rendimento.

Introdução

Dispositivos que podem transduzir e amplificar atividades biológicas e químicas em sinais elétricos são cruciais em vários campos, como sensoriamento ^1,2, computação neuromórfica ^3,4 e eletrônica vestível⁵. Dentre estes, os transistores eletroquímicos orgânicos (OECTs) têm surgido como interfaces excepcionais entre sistemas biológicos e leituras eletrônicas devido à sua compatibilidade com ambientes aquosos e baixas tensões de operação ^6,7. Os OECTs diferem da eletrônica convencional por utilizar íons em um eletrólito para modular a condutividade de um canal orgânico, que acopla o transporte iônico e eletrônico para obter uma transcondutância excepcional⁸. Essas características tornam os OECTs ideais para a interface de sistemas biológicos com eletrônicos, pois podem amplificar sinais biológicos fracos e traduzi-los em leituras elétricas.

Os OECTs operam alterando o estado de dopagem de um canal condutor iônico-eletrônico misto por meio de difusão iônica, normalmente controlada pela aplicação de uma tensão no eletrodo da porta. No entanto, reações biológicas ou redox também podem alterar a condutividade do canal, permitindo que os OECTs respondam a uma variedade de estímulos químicos e biológicos. A funcionalização de OECTs com bicamadas lipídicas, canais iônicos ou biomoléculas permite que eles detectem analitos específicos, tornando-os úteis para aplicações de detecção ^9,10. Por exemplo, os OECTs foram integrados a enzimas redox-ativas, como a glicose oxidase, para transferir elétrons diretamente para o canal, ajustando sua condutividade em resposta à concentração de glicose¹¹. Embora tais configurações sejam eficazes para biossensoriamento, elas são limitadas em sua capacidade computacional devido ao comportamento relativamente simples de enzimas ou proteínas individuais.

Em contraste, as células vivas, particularmente as bactérias, oferecem uma plataforma versátil capaz de realizar cálculos complexos e robustos 4,12,13,14,15. Bactérias eletroativas como Shewanella oneidensis e Geobacter sulfurreducens têm a capacidade única de transferir elétrons através de suas membranas celulares em um processo conhecido como transferência de elétrons extracelular (EET). Em condições anaeróbicas, essas bactérias acoplam seus processos metabólicos à redução ou oxidação de aceptores externos de elétrons, incluindo metais, óxidos metálicos e materiais sintéticos como polímeros condutores¹⁶ e nanopartículas¹⁷ (Figura 1A). Essa capacidade tem sido explorada em células de combustível microbianas para geração de energia e oferece potencial para aplicações bioeletrônicas mais avançadas^18,19. Além disso, os avanços na biologia sintética permitiram a manipulação genética precisa de bactérias eletroativas para controlar as vias do EET. Ao projetar circuitos genéticos que regulam a expressão de genes relacionados ao EET, os pesquisadores podem modular o fluxo de elétrons em resposta a pistas ambientais específicas ou operações lógicas computacionais^20,21. Esse controle genético sobre o EET abre caminhos para a criação de sistemas bio-híbridos onde os cálculos bacterianos são diretamente interligados a dispositivos eletrônicos como OECTs. Por exemplo, os circuitos genéticos bacterianos podem ser projetados para responder a combinações de entradas químicas, ligando ou desligando as vias EET e, assim, modulando a condutividade de um canal OECT. Isso permitiria leituras elétricas diretas de cálculos bacterianos, ignorando a necessidade de repórteres fluorescentes ou outros repórteres biológicos tradicionais.

Avanços recentes demonstraram o potencial do acoplamento de OECTs com bactérias eletroativas. Por exemplo, Méhes et al. usaram S. oneidensis para monitorar a atividade de EET em tempo real com um OECT do tipo p, ilustrando como o metabolismo bacteriano poderia ser rastreado eletricamente²². Embora este trabalho destaque a possibilidade de usar OECTs para detectar atividade bacteriana, o potencial do sistema híbrido para biossensoriamento e biocomputação permanece pouco explorado. Para resolver isso, desenvolvemos recentemente transistores híbridos incorporando S. oneidensis geneticamente modificado em OECTs do tipo p²³. Os resultados demonstraram que o canal OECT pode ser desdopado por meio de atividades bacterianas de EET (Figura 1B). Para aprimorar ainda mais as capacidades de biossensoriamento e obter insights mecanicistas sobre o processo de desdopagem, projetamos cepas de S. oneidensis com circuitos genéticos que regulam o fluxo de EET. Isso resulta em mudanças previsíveis na saída do OECT em resposta a pistas ambientais, como moléculas indutoras. Além disso, ao integrar a lógica booleana a esses circuitos genéticos, permitimos leituras elétricas diretas de cálculos bacterianos complexos.

Aqui, apresentamos o protocolo abrangente para a operação do transistor híbrido, abrangendo a fabricação do dispositivo, preparação da cultura de células, procedimentos de medição e análise de dados. Além disso, abordamos considerações importantes, como limpeza de dispositivos, reutilização e o potencial de automação em testes de alto rendimento.

Protocolo

NOTA: Todos os produtos químicos foram usados como recebidos, sem purificação adicional. Se não especificado, produtos químicos de grau analítico foram usados.

1. Fabricação do dispositivo OECT

NOTA: Os OECTs são fabricados em lâminas de microscópio de quartzo usando técnicas de microfabricação padrão adaptadas de trabalhos anteriores²⁴. Conforme mostrado na Figura 2A, oito dispositivos OECT estão dispostos em uma única lâmina padrão. Folhas pré-cortadas de polidimetilsiloxano (PDMS) são colocadas na lâmina para formar câmaras OECT e portas de acesso. O polímero condutor tipo p poli(3,4-etilenodioxitiofeno): poli(estirenossulfonato) (PEDOT: PSS) é usado para o canal OECT e o eletrodo de porta, com dimensões de 150 μm x 10 μm para o canal e 500 μm x 500 μm para a ponta da porta ( Figura 2B). Um resumo do processo de fabricação do canal OECT e montagem do dispositivo é fornecido na Figura 2C.

1. Fabricação de eletrodos de ouro
   1. Limpe as lâminas de quartzo enxaguando-as com acetona, álcool isopropílico (IPA) e água deionizada (DI). Seque com gás N₂ .
   2. Execute a limpeza de plasma de O₂ com 50 sccm a 150 W por 120 s.
   3. Spin-coat AZ5209e fotorresistente (PR) com 2 estágios: primeiro a 500 rpm, aceleração de 100 rpm/s por 5 s, e o segundo a 2000 rpm, aceleração de 1000 rpm/s por 45 s.
   4. Asse duro a 90 °C por 150 s.
   5. Ligue o alinhador de máscara (Suss MA6) e selecione i-line (365 nm) como fonte UV, defina os parâmetros: tempo de exposição como 3.5 s (13 W), folga de alinhamento em 15 μm, tipo WEC para contato. e tipo de exposição a Difícil.
   6. Carregue a máscara de litografia e a lâmina no alinhador, alinhe a lâmina com a máscara e execute a exposição inicial.
   7. Asse ao contrário a 110 ° C por 180s.
   8. Remova a máscara de litografia e realize a exposição a inundações com os seguintes parâmetros: tempo de exposição como 25 s (13 W), tipo de exposição como Inundação E.
   9. Desenvolva o PR com o revelador AZ 400K 1:4 pré-diluído pelo fabricante. Despeje a quantidade apropriada do revelador em um prato de cristalização para submergir a lâmina e agite constantemente o prato com movimentos circulares por 45 s. Em seguida, remova imediatamente a lâmina e mergulhe-a em água DI por 45 s, enxágue com água DI e seque com N₂.
      NOTA: O processo pode ser pausado aqui.
   10. Mova as corrediças para o evaporador de feixe eletrônico. Bombeie para 2,7 x ^10-4 Pa (2 x ^10-6 T) ou menos.
   11. Depositar a camada adesiva de Ti (10 nm) e Au (100 nm) sequencialmente. A velocidade de deposição pode variar dependendo do evaporador específico usado. Recomenda-se uma velocidade de deposição de 0,1 nm/s para alcançar um bom equilíbrio entre a qualidade da deposição e o tempo de processamento.
   12. Remova o excesso de metal embebendo as lâminas em acetona durante a noite. Após a imersão, use uma pipeta para jato de acetona na superfície da lâmina para desalojar qualquer excesso de metal restante. As lâminas de um quarto obtidas após as etapas acima são chamadas de lâminas de eletrodo OECT.
       NOTA: Como alternativa, use a sonicação para ajudar a desalojar o excesso de metal.
2. PEDOT: Fabricação de canais PSS
   1. Limpe as lâminas do eletrodo OECT enxaguando-as com acetona, IPA e água DI. Seque com gás N₂ .
   2. Asse as lâminas por pelo menos 5 min a 160 °C. Deixe as lâminas esfriarem antes de centrifugar o revestimento.
   3. Spin-coat AZ5209e PR com 2 estágios: primeiro a 500 rpm, aceleração de 100 rpm/s por 5 s, seguido de 2000 rpm, aceleração de 1000 rpm/s a 45 s.
   4. Asse duro a 90 °C por 150 s.
   5. Inicie a exposição inicial com i-line no modo de contato rígido por 3.5 s a 13 W.
   6. Assar ao contrário a 110 °C por 180 s.
   7. Realize a exposição a inundações por 25 s a 13 W.
   8. Desenvolver com revelador AZ 400K 1:4 por 45 s com agitação circular constante do prato. Em seguida, mergulhe as lâminas em água DI por 45 s, enxágue com água DI e seque com N₂.
      NOTA: O processo pode ser pausado aqui.
   9. Sonicar a dispersão PEDOT: PSS por 5 min flutuando a garrafa em banho-maria DI cheio até a linha de enchimento do sonicador. Filtre a dispersão PEDOT: PSS com um filtro de 0,22 μm para remover aglomerados.
   10. Spin-coat PEDOT: PSS a 3500 rpm com aceleração a 3500 rpm/s por 60 s. Seque a 90 °C por 15 min.
   11. Remova o excesso de filme PEDOT:PSS embebendo as lâminas em acetona por 12 min, seguido de 1 min de sonicação.
   12. Enxágue as lâminas com acetona e depois IPA e seque com N₂.
   13. Realize o tratamento com etilenoglicol (EG) colocando as lâminas sobre a placa quente a 90 °C e, em seguida, coloque EG suficiente para cobrir todo o PEDOT: PSS por 5 min. Enxágue com água DI e seque com N₂. As lâminas de um quarto obtidas após as etapas acima são chamadas de lâminas OECT.
3. Fabricação de câmaras de dispositivos PDMS
   1. Faça folhas PDMS misturando a base e o agente de cura na proporção de 10:1. Lançar a solução no molde para atingir uma espessura de 3 mm e desgaseificar durante 1 h numa câmara de desgaseia de 2 quartos ligada a uma bomba de vácuo.
   2. Cure a mistura colocando o molde em uma bancada nivelada por 48 h em temperatura ambiente para garantir superfícies PDMS lisas. Cubra o molde para evitar a contaminação por detritos transportados pelo ar.
   3. Corte o PDMS com lâminas de barbear e crie as câmaras do dispositivo e as portas de troca de fluido com punções circulares com diâmetros de 5 mm e 1,5 mm, respectivamente. Certifique-se de que a altura do PDMS seja de 3 mm, conforme controlado durante a fundição do molde (etapa 1.3.1)

2. Preparação de mídia

1. Autoclave 500 mL de água ultrapura, quatro agulhas dispensadoras de aço inoxidável, duas tampas de frasco de borracha (para os frascos de fundo redondo de 250 mL), dois frascos de fundo redondo de 250 mL e um frasco de mídia de vidro de 500 mL. Armazene a água ultrapura estéril a 4 °C para uso futuro.
2. Prepare o meio basal 2x Shewanella (SBM) corrigido com 2x Wolfe's Trace Mineral Mix 0,1% de casamino ácidos de acordo com a Tabela 1. Filtre esterilize o meio no fundo do meio de vidro estéril (obtido na Etapa 2.1) com um filtro superior do frasco. Este meio é referido como 2x SBM++, com cada + indicando a adição de Trace Mineral Mix e casaminoácidos. Conservar a 4 °C para utilização futura.
3. Filtre estéril (filtro de 0,22 μm) cada um dos seguintes produtos químicos separadamente: 50 mL de fumarato de sódio 1 M em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL; 1 mL de 2,5 mg/mL de canamicina (KAN), referido como 100x KAN em um tubo de microcentrífuga estéril. Aloque 1 mL de lactato de sódio estéril a 60% p/p (usado como recebido) em um tubo de microcentrífuga. Armazene todas as soluções preparadas a 4 °C.
4. Prepare separadamente 1 mL dos seguintes produtos químicos em tubos de microcentrífuga estéreis: 100 mM de isopropilo ß-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG), referido como 100x IPTG; 10 mM 3-oxohexanoil-homoserina lactona (OC6), referida como 100x OC6; Cloridrato de anidrotetraciclina 1 mM (aTc), referido como 100x aTc. Conservar a 4 °C para utilização futura.
5. Usando os frascos esterilizados, tampas de borracha e agulhas preparados na Etapa 2.1, purgue o estoque médio. Aloque 200 mL de água estéril 2X SBM++ e ultrapura em frascos separados de fundo redondo de 250 mL. Sele os frascos com tampas de borracha e insira agulhas de distribuição estéreis para criar uma configuração de lavagem de gás (agulha de entrada de ar submersa no líquido; agulha de saída de gás acima da superfície do líquido). Purgue com N₂ por 15 min.
6. Transfira o 2x SBM++ purgado e água ultrapura, lactato, fumarato de sódio 1 M, 100x KAN, 100x IPTG, 100x OC6 e 100x aTc para o porta-luvas para uso posterior com o OECT.

3. Monitoramento de EET celular com dispositivos OECT

NOTA: Para garantir a anaerobicidade, o experimento OECT é conduzido em um porta-luvas sem controle de umidade à temperatura ambiente.

1. Dia 1
   1. Esterilização e preparação de dispositivos
      1. Autoclave as lâminas OECT, as folhas PDMS e o eletrodo de referência Ag/AgCl (RE) em recipientes separados. Seque cozendo a 80 °C. Traga as corrediças OECT autoclavadas e Ag/AgCl RE para o porta-luvas.
      2. Dessorve o oxigénio retido nas folhas de PDMS, submetendo-o ao vácuo na antecâmara do porta-luvas durante 4 h. Monte o dispositivo OECT colocando as folhas PDMS sobre as corrediças OECT no porta-luvas.
      3. Injectar 45 μL de meio SBM adequado em cada câmara OECT. Para a maioria dos experimentos, use 1x SBM++ suplementado com 20 mM de lactato. Por exemplo, prepare 1 mL de 1x SBM++ misturando 500 μL de 2x SBM++, 497 μL de água ultrapura estéril e 2,85 μL de lactato de sódio a 60% p/p.
      4. Cubra as portas da câmara OECT com folhas PDMS para evitar evaporação e contaminação do meio.
      5. Monitore a corrente do canal OECT I_DS sob uma tensão de canal constante V_DS de -0,05 V e tensão de porta V_GS de 0,2 V até que a corrente se estabilize. A seleção de tensão pode variar dependendo do dispositivo OECT ou amostras biológicas. Use as mesmas tensões de polarização contínuas para a porta e o canal durante toda a medição. A estabilização pode levar de horas a alguns dias, dependendo do nível de vácuo e da duração da dessorção na antecâmara.
   2. Culturas de células
      1. Colocar as células silvestres (armazenadas a -80 °C) em placas de ágar contendo LB (para as estirpes que não contêm plasmídeos) ou LB com 25 μg/ml de canamicina (para as estirpes que contêm plasmídeos) e crescer aeróbico-durante a noite a 30 °C^20,23.
2. Dia 2
   1. Preparação celular (culturas aeróbias)
      1. Escolha aleatoriamente colônias únicas das placas de ágar LB (obtidas na etapa 3.1.2.1) em 2 mL de 1x SBM++ suplementado com 20 mM de lactato em tubos de cultura de 15 mL. Mantenha as células durante a noite a 30 °C e agitação de 250 rpm. Prepare 6 mL de meio de crescimento sem célula como controle abiótico que será usado posteriormente na lavagem celular.
   2. Preparação celular (cultura anaeróbia)
      1. Transfira as placas de ágar LB contendo as cepas a serem testadas para o porta-luvas.
      2. Escolha aleatoriamente colônias únicas de placas de ágar LB em 1 mL de SBM apropriado suplementado com 20 mM de lactato e 40 mM de fumarato em tubos de cultura de 15 mL. Por example, prepare 1 mL de meio para cepa induzível IPTG que requer 1 mM IPTG e 25 μg/mL de KAN misturando 500 μL de 2x SBM++, 437 μL de água ultrapura estéril, 2.85 μL de 60% p/p de lactato de sódio, 40 mM de fumarato de sódio 1 M, 10 μL de 100 mM IPTG e 10 μL de 2.5 mg/mL KAN.
      3. Mantenha as células a 30 °C por 18 - 24 h sem agitar. Para garantir a comparabilidade entre lotes de experimentos, mantenha tempos de crescimento consistentes.
3. Dia 3
   1. Medição eletroquímica inicial do OECT
      NOTA: O tipo de caracterizações OECT varia de tipos estáticos, como polarização de tensão constante, a tipos dinâmicos, como pulsação de porta. Aqui, usamos o teste de etapa de tensão de porta para obter características dinâmicas e estáticas. A reconfiguração da conexão elétrica entre os OECTs e o instrumento (um potenciostato multicanal neste caso) é assistida por placas de circuito multiplex manual (MUX) personalizadas. Placas MUX automatizadas podem ser desenvolvidas para medição de alto rendimento.
      1. Meça a corrente do canal OECT I_DS correspondente ao passo de tensão da porta de 0 V a 0.2 V com as configurações descritas abaixo (os nomes exatos podem variar dependendo do instrumento).
      2. O canal 1 do instrumento mede a corrente do canal OECT I_DS. Para isso, defina o nome da técnica: Fast Amperometry; Tempo de equilíbrio: 1 s; Tensão de equilíbrio: - 0,05 V; Tensão de polarização: -0,05 V; Tempo de execução: 14 s; Intervalo de amostragem: 0,5 ms.
      3. O canal do instrumento 2 controla a tensão da porta OECT V_GS. Para isso, defina o nome da técnica: Modo Misto; Tempo de condição: 1 s; Tensão de condição: 0 V; Modo de estágio 1: Constante E; Tensão de polarização do estágio 1: 0 V; Tempo de execução do estágio 1: 4 s; Modo de estágio 2: Constante E; Tensão de polarização do estágio 2: 0,2 V; Tempo de execução do estágio 2: 10 s; Intervalo de amostragem: 0,5 ms.
      4. Repetir o ensaio do passo da tensão da porta (passos 3.3.1.1 a 3.3.1.3) para todos os OECT. Esta etapa pode ser automatizada para testes de alto rendimento.
      5. Aplicar tensão de canal constante V_DS de -0,05 V e tensão de porta V_GS de 0,2 V a todos os OECTs até a inoculação. Certifique-se de que as tensões de polarização sejam as mesmas usadas durante a estabilização do dispositivo (etapa 3.1.1.5).
   2. Preparação do inóculo (culturas aeróbias)
      1. Lave três vezes as células centrifugando a 1503 x g por 4 min e ressuspendendo em 1 mL de meio fresco usado para o crescimento celular (etapa 3.2.1.1). Após a última (^3ª) centrifugação, ressuspenda as células em 0,5 mL (ou metade do volume de cultura original) para obter uma suspensão celular concentrada a OD₆₀₀ de 1 - 3,5. Ajuste o volume final da suspensão de acordo.
      2. Transfira a suspensão da célula para o porta-luvas.
      3. Para obter o inóculo, dilua as células para um OD₆₀₀ pretendido de 0,1 (ou 10x o OD_{de inoculação 600}). O meio de ilusão tem a mesma constituição que o meio de crescimento, mas prepare-o fresco no porta-luvas com estoques de mídia purgados. Por exemplo, se as células foram cultivadas aeróbica em SBM++ suplementado com lactato, prepare SBM++ fresco suplementado com lactato no porta-luvas para a diluição do inóculo.
      4. Pare o potenciostato. Injectar 5 μl do inóculo na câmara do OECT (contendo 45 μl de SBM adequado) para obter um OD₆₀₀ final de 0,01 no OECT. Cubra as portas da câmara OECT com folhas PDMS para evitar evaporação e contaminação do meio.
   3. Preparação do inóculo (culturas anaeróbias)
      1. Para obter o inóculo, diluir as culturas de células em 10 vezes. Use um meio ilusório que tenha a mesma constituição que o meio de crescimento, mas não tenha o fumarato. Por exemplo, se as células foram cultivadas anaeróbia em SBM++ suplementado com lactato, fumarato, KAN e IPTG, prepare SBM++ fresco suplementado com lactato, KAN e IPTG no porta-luvas para a diluição do inóculo.
      2. Pare o potenciostato. Injectar 5 μl do inóculo na câmara do OECT (contendo 45 μl de SBM adequado). Cubra as portas da câmara OECT com folhas PDMS para evitar evaporação e contaminação do meio.
   4. Medição contínua e pontos de tempo
      1. Aplicar tensões de polarização constantes aos canais OECT (V_DS = -0,05 V) e porta (V_GS = 0,2 V) ao longo do experimento, exceto durante as medições de ponto de tempo, quando o potenciostato é conectado a OECTs individuais para caracterização.
      2. Executar o experimento por 24 h após a inoculação. Considere a medição antes da inoculação (ver passo 3.3.1) como o ponto de tempo de 0 h.
      3. Mudanças significativas no estado de dopagem do canal OECT geralmente ocorrem durante as 8 h iniciais. Selecione 5-7 pontos de tempo para medições durante este período, seguido por uma medição entre 12 h e 16 h, e o ponto de tempo final na marca de 24 h. Exemplos de pontos de tempo podem incluir imediatamente após a inoculação e em pontos de tempo de 1 h, 2 h, 3 h, 4,5 h, 6 h, 8 h, 18 h e 24 h após a inoculação.
      4. Para evitar medições noturnas, inicie a inoculação (consulte as etapas 3.3.2 ou 3.3.3) no início do dia para acomodar as medições frequentes durante as primeiras 8 h.
      5. Repita o passo descrito em 3.3.1 para cada medição de ponto de tempo.
4. Dia 4
   1. Medição da curva de transferência no último ponto de tempo (24 h)
      1. Insira o Ag/AgCl RE na câmara OECT girando e empurrando suavemente o RE através da porta de troca de fluido.
      2. Meça as curvas de transferência do OECT varrendo a tensão da porta de -0,1 V a 0,6 V enquanto monitora a corrente do canal I_DS com polarização constante V_DS a -0,05 V. Meça os potenciais precisos da porta e do eletrodo da fonte em relação ao Ag/AgCl RE.
      3. Configure o instrumento conforme descrito abaixo (os nomes exatos podem variar dependendo do instrumento).
      4. O canal do instrumento 1 mede a corrente do canal OECT I_DS, use a seguinte configuração: Nome da técnica: Cronoamperometria (CA), Tempo de equilíbrio: 5 s, Tensão de equilíbrio: - 0,05 V, Tensão de polarização: -0,05 V, Tempo de execução: 35 s, Intervalo de amostragem: 0,09915 s.
      5. O canal do instrumento 2 controla a tensão da porta OECT V_GS, use a seguinte configuração: Nome da técnica: Voltametria de varredura linear (LSV), Tempo de equilíbrio: 5 s, Tensão de equilíbrio: - 0,1 V, Tensão inicial: -0,1 V, Tensão final: 0,6 V, Etapa de tensão: 0,002 V, Taxa de varredura: 0,02 V/s.
      6. O canal do instrumento 3 mede o potencial da fonte OECT V_S contra Ag/AgCl RE, use a seguinte configuração: Nome da técnica: Potenciometria de circuito aberto (OCP), Tempo de execução: 40 s, Intervalo de amostragem: 0.09915 s.
      7. O canal do instrumento 4 mede o potencial da porta OECT V_G contra Ag/AgCl RE, use a seguinte configuração: Nome da técnica: Potenciometria de circuito aberto (OCP), Tempo de execução: 40 s, Intervalo de amostragem: 0,09915 s.
      8. Repetir a medição da curva de transferência para todos os OECT. Após cada medição, enxágue o eletrodo de referência Ag/AgCl (RE) com etanol a 70% e limpe-o com uma nova toalha de baixa formação em cotão O Ag/AgCl RE pode ser reutilizado dentro do mesmo grupo de amostra para os triplicados, mas não deve ser reutilizado entre diferentes grupos de amostra.

4. Análise dos dados

1. Extração de dados
   1. Use código MATLAB personalizado para processamento de dados para automatizar a extração e o registro de dados do software nativo do instrumento, reduzindo significativamente o tempo de processamento. Os scripts MATLAB estão disponíveis no Texas Data Repository (https://doi.org/10.18738/T8/MNKO8D).
2. Processamento de dados
   1. Ajustar os dados I_DS da corrente do canal OECT para obter as constantes de velocidade k para posterior análise e comparação (figura 3). Para amostras de células compatíveis com EET, encontramos o modelo exponencial único fornecido o melhor ajuste. Portanto, usamos o modelo de decaimento exponencial monofásico em software de análise para ajustar os dados da série temporal I_DS e obter a constante de taxa ajustada k. Esses dados de séries temporais I_DS podem ser o valor bruto ou normalizados para o ponto de tempo de 0 h, pois a constante de taxa k reflete a taxa de variação em vez dos valores absolutos.
   2. Obtenha o I_DS normalizado dividindo os valores de I_DS pelo valor do ponto de tempo 0 h (I_DS0), referido como I_DS / I_DS0.
3. Determinando a constante de taxa k
   1. Abra o software de análise (Prism 10, GraphPad) e crie um novo projeto clicando em Arquivo > Novo > Novo Arquivo de Projeto. Na guia Criar, escolha XY. Na seção Opções, defina X como Números e Y como Enter e plote um único valor Y para cada ponto.
   2. Importe os dados I_DS atuais do canal OECT para a tabela. Ajuste os dados do I_DS com o modelo de decaimento exponencial de uma fase clicando em Analisar na guia Análise. Encontre o método de regressão não linear (ajuste de curva) em análises XY. Certifique-se de selecionar Todos os conjuntos de dados que precisam ser ajustados à direita e clique em OK.
   3. Na nova janela Parâmetros, selecione Modelo de decaimento de uma fase no grupo Exponencial e clique em OK. A equação do modelo é a seguinte:
      Y=(Y0 - Platô)*^e-k*X + Platô
      Onde: Y é a corrente I_DS do canal OECT, T é o tempo, k é a constante de taxa.
   4. Depois que os valores k forem obtidos, revise a qualidade do ajuste verificando o valor de R ao quadrado para cada ajuste. Um bom encaixe deve ter um R² superior a 0,95.
4. Teste t de Student bicaudal não pareado
   1. Para avaliar a significância estatística entre os grupos amostrais, realizar testes t de Student bicaudais não pareados.
   2. Abra o software de análise e crie um novo projeto clicando em Arquivo > Novo > Novo Arquivo de Projeto. Na guia Criar, escolha XY. Na seção Opções, defina X como Números e Y para Inserir 3 valores replicados em subcolunas lado a lado.
   3. Importe os valores k da constante de taxa ajustada para a tabela. Execute o teste t clicando em Analisar na guia Análise. Encontre o método de teste t (e testes não paramétricos) em Análises de coluna. Certifique-se de selecionar Dois conjuntos de dados de cada vez e clique em OK.
   4. No manual do Projeto Experimental, selecione Não emparelhado, Sim. Use o teste paramétrico e o teste t não pareado. Suponha que ambas as populações tenham as mesmas opções de DS. Os valores de p serão gerados para cada comparação. Nas figuras, os valores de p são representados da seguinte forma: n.s.: p > 0,05 (não significativo), *: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001, ****: p ≤ 0,0001.
   5. Repita as etapas 4.4.3 a 4.4.4 para todos os conjuntos de dados relevantes.

5. Limpeza e reutilização do dispositivo OECT

1. Após o experimento, desmonte o dispositivo e ferva as lâminas OECT em água com sabão (1:10, sabão: água DI) por 15 min.
2. Mova rapidamente as lâminas para um béquer contendo água DI à temperatura ambiente e espere 5 minutos para que as lâminas esfriem. Enxágue as lâminas com DI e seque com ar limpo.
3. Meça a resistência do canal OECT com um multímetro. Se a resistência do canal estiver dentro de 400% do valor original, o dispositivo pode ser reutilizado para o experimento após a esterilização (Etapa 3.1.1). As lâminas OECT também podem ser limpas usando as etapas a seguir e são adequadas para fabricação de canais usando a Etapa 1.2.
   CUIDADO: A solução de piranha é altamente corrosiva e pode gerar calor significativo. Sempre use equipamento de proteção individual (EPI) adequado, incluindo luvas, óculos de proteção e jaleco. Manuseie com extremo cuidado e obedeça às orientações de segurança da instituição.
4. Preparar a solução de piranha numa hotte bem ventilada. Com cuidado e lentamente, adicione 30% (p / p) de peróxido de hidrogênio a 98% de ácido sulfúrico na proporção de 1: 4, mexendo suavemente inclinando o prato cristalizador para frente e para trás.
5. Coloque o prato de cristalização em uma placa quente aquecida a 70 °C. Use uma pinça para trazer e submergir as lâminas em solução de piranha por 1 min.
6. Transfira cuidadosamente as lâminas para um copo contendo água DI e deixe-as descansar por pelo menos 1 min. Enxágue bem as lâminas com água DI e seque com ar.
7. Descarte a solução de piranha de acordo com as diretrizes institucionais de descarte de resíduos químicos. Neutralize a solução de piranha adicionando-a lentamente a um béquer contendo uma mistura de água gelada com cerca de 4x o volume da solução. Adicione gradualmente um agente neutralizante (por exemplo, NaOH 10 M) enquanto monitora o pH com tiras de teste até o neutro.

Resultados

Constante de taxa ajustada k
A constante de taxa ajustada k da corrente do canal OECT I_DS serve como uma métrica confiável para avaliar a atividade de EET da amostra. Embora as tensões de polarização de porta constantes afetem as constantes de taxa, escolhemos 0,2 V para garantir a polarização positiva para estimular a transferência de elétrons bacterianos, evitando a desdopagem rápida em tensões de porta mais alt...

Discussão

Comparação de células eletroquímicas (EC)
Uma grande vantagem de ajustar a constante de taxa da corrente do canal OECT é que ela minimiza a variação do dispositivo, concentrando-se na dinâmica subjacente das mudanças de I_DS em vez da saída bruta. Combinada com a capacidade inerente de amplificação de sinal dos OECTs, essa abordagem aumenta a robustez dos sistemas OECT híbridos em comparação com as células eletroquímicas tradicionais (EC). P...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-oxohexanoyl-homoserine lactone	Sigma-Aldrich
anhydrotetracycline hydrochloride	VWR
casamino acids	VWR
Equipment
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich		anhydrous 99.8%,
HEPES buffer solution	VWR		1 M in water, pH = 7.3
isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside	Teknova
kanamycin sulfate	Growcells
Magnesium(II) sulfate heptahydrate	VWR
PEDOT:PSS aqueous suspension	Heraeus Epurio LLC	Clevios PH1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich
Potentiostat	PalmSens BV	MultiPalmSens4
Quartz microscopic slides	AdValue	FQ-S-003
Quartz microscopic slides
Sodium chloride	VWR
Sodium DL-lactate	TCI		60% in water
Sodium fumarate	VWR		98%
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich		95.0%-98.0%
Two-part silicone elastomer	Electron Microscopy Sciences	Sylgard184
Wolfe's Trace Mineral Mix	ATCC