Organik Elektrokimyasal Transistörler ile Hücre Dışı Elektron Transfer Aktivitelerinin Çevrilmesi

Özet

Burada, Shewanella oneidensis'teki hücre dışı elektron transferi (EET) aktivitesini elektrik sinyallerine çevirmek için organik elektrokimyasal transistörlerin (OECT'ler) kullanılması için bir protokol sunuyoruz. Hibrit OECT sistemi, hızlı, yüksek verimli testler için gelişmiş sağlamlık, hassasiyet ve potansiyel sağlayarak onu EET ölçümleri için etkili bir araç haline getirir.

Özet

Hücre dışı elektron transferi (EET), belirli mikroorganizmaların elektronları hücre zarları boyunca harici elektron alıcılarına aktarabildiği ve hücresel metabolizmayı çevrelerine bağlayabildiği bir süreçtir. Geobacter ve Shewanella , EET araştırmaları için birincil modeller olsa da, ortaya çıkan çalışmalar, EET aktif türlerin fermantasyon ve insan bağırsak mikrobiyomu ile de ilişkili olduğunu ortaya koymaktadır. EET'nin biyolojik ve elektronik sistemler arasında köprü kurma yeteneğinden yararlanarak, mikrobiyal EET aktivitesini kolayca tespit edilebilir elektrik sinyallerine dönüştürmek için organik elektrokimyasal transistörler (OECT'ler) kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Bu sistem, biyoalgılama ve biyohesaplama uygulamaları için dış uyaranlara hücresel tepkilerin kullanılmasını sağlar. Spesifik olarak, OECT'deki p-tipi poli (3,4-etilendioksitiyofen): poli (stirensülfonat) (PEDOT: PSS) kanalının dopingden arındırıldığını gösterdik, Shewanella oneidensis'ten hücresel EET tarafından tahrik edilir. EET akısını genetik devreler tarafından transkripsiyonel olarak kontrol ederek, indükleyici moleküller gibi kimyasal uyaranları tespit etmek için bu hibrit OECT sisteminin biyoalgılama yeteneğini oluşturuyoruz. Ayrıca, hücrelerin içine plazmid tabanlı Boolean mantık kapıları ekleyerek, çevresel sinyalleri işlemelerine ve OECT'lerdeki mevcut değişiklikleri yönlendirmelerine olanak tanıyarak bu cihazların biyo-hesaplama potansiyelini daha da gösteriyoruz. Bu yöntem, biyolojik sistemler ve elektronikler arasında yeni bir arayüz sağlayarak gelecekteki yüksek verimli tarama, biyoalgılama ve biyobilgi işlem uygulamalarını mümkün kılar.

Giriş

Biyolojik ve kimyasal aktiviteleri elektrik sinyallerine dönüştürebilen ve yükseltebilen cihazlar, algılama ^1,2, nöromorfik bilgi işlem ^3,4 ve giyilebilir elektronik⁵ gibi çeşitli alanlarda çok önemlidir. Bunlar arasında, organik elektrokimyasal transistörler (OECT'ler), sulu ortamlarla uyumlulukları ve düşük çalışma voltajları nedeniyle biyolojik sistemler ve elektronik okumalar arasında istisnai arayüzler olarak ortaya çıkmıştır ^6,7. OECT'ler, olağanüstü iletkenlik elde etmek için iyonik ve elektronik taşımayı birleştiren bir organik kanalın iletkenliğini modüle etmek için bir elektrolitteki iyonları kullanarak geleneksel elektroniklerden farklıdır⁸. Bu özellikler, OECT'leri biyolojik sistemleri elektronikle arayüzlemek için ideal kılar, çünkü zayıf biyolojik sinyalleri yükseltebilir ve bunları elektrik okumalarına çevirebilirler.

OECT'ler, tipik olarak kapı elektroduna bir voltaj uygulanarak kontrol edilen iyonik difüzyon yoluyla karışık bir iyonik-elektronik iletken kanalın doping durumunu değiştirerek çalışır. Bununla birlikte, biyolojik veya redoks reaksiyonları da kanalın iletkenliğini değiştirerek OECT'lerin çeşitli kimyasal ve biyolojik uyaranlara yanıt vermesini sağlayabilir. OECT'leri lipid çift katmanları, iyon kanalları veya biyomoleküller ile işlevselleştirmek, bunların belirli analitleri tespit etmelerini sağlar ve bu da onları algılama uygulamaları için kullanışlı hale getirir ^9,10. Örneğin, OECT'ler, elektronları doğrudan kanala aktarmak için glikoz oksidaz gibi redoks aktif enzimlerle entegre edilmiştir ve iletkenliğini glikoz konsantrasyonuna yanıt olarak ayarlar¹¹. Bu tür konfigürasyonlar biyoalgılama için etkili olsa da, bireysel enzimlerin veya proteinlerin nispeten basit davranışları nedeniyle hesaplama kapasiteleri sınırlıdır.

Buna karşılık, canlı hücreler, özellikle bakteriler, karmaşık ve sağlam hesaplamalar yapabilen çok yönlü bir platform sunar 4,12,13,14,15. Shewanella oneidensis ve Geobacter sulfurreducens gibi elektroaktif bakteriler, hücre dışı elektron transferi (EET) olarak bilinen bir süreçte elektronları hücre zarları boyunca transfer etme konusunda benzersiz bir yeteneğe sahiptir. Anaerobik koşullar altında, bu bakteriler metabolik süreçlerini metaller, metal oksitler ve iletken polimerler¹⁶ ve nanopartiküller¹⁷ gibi sentetik malzemeler dahil olmak üzere dış elektron alıcılarının indirgenmesi veya oksidasyonu ile birleştirir (Şekil 1A). Bu yetenek, enerji üretimi için mikrobiyal yakıt hücrelerinde kullanılmıştır ve daha gelişmiş biyoelektronik uygulamalar için potansiyel sunmaktadır^18,19. Ek olarak, sentetik biyolojideki gelişmeler, EET yollarını kontrol etmek için elektroaktif bakterilerin hassas genetik manipülasyonunu mümkün kılmıştır. Araştırmacılar, EET ile ilişkili genlerin ekspresyonunu düzenleyen genetik devreleri tasarlayarak, belirli çevresel ipuçlarına veya hesaplamalı mantık işlemlerine yanıt olarak elektron akısını modüle edebilirler^20,21. EET üzerindeki bu genetik kontrol, bakteriyel hesaplamaların OECT'ler gibi elektronik cihazlarla doğrudan arayüzlendiği biyo-hibrit sistemler oluşturmak için yollar açar. Örneğin, bakteriyel genetik devreler, kimyasal girdilerin kombinasyonlarına yanıt vermek, EET yollarını açmak veya kapatmak ve böylece bir OECT kanalının iletkenliğini modüle etmek için tasarlanabilir. Bu, floresan veya diğer geleneksel biyolojik raportörlere olan ihtiyacı atlayarak, bakteriyel hesaplamaların doğrudan elektriksel okumalarına izin verecektir.

Son gelişmeler, OECT'leri elektroaktif bakterilerle birleştirme potansiyelini göstermiştir. Örneğin, Méhes ve ark. S. oneidensis'i p-tipi bir OECT ile gerçek zamanlı EET aktivitesini izlemek için kullandılar ve bakteri metabolizmasının elektriksel olarak nasıl izlenebileceğini gösterdiler²². Bu çalışma, bakteri aktivitesini tespit etmek için OECT'leri kullanma olasılığını vurgularken, biyo-algılama ve biyo-hesaplama için hibrit sistemin potansiyeli yeterince araştırılmamıştır. Bunu ele almak için, yakın zamanda genetik olarak tasarlanmış S. oneidensis'i p-tipi OECTs^23'e dahil eden hibrit transistörler geliştirdik. Sonuçlar, OECT kanalının bakteriyel EET aktiviteleri yoluyla katkısızlaştırılabileceğini göstermiştir (Şekil 1B). Biyo-algılama yeteneklerini daha da geliştirmek ve dopingden arındırma sürecine ilişkin mekanik içgörüler elde etmek için, EET akışını düzenleyen genetik devrelere sahip S. oneidensis suşlarını tasarladık. Bu, indükleyici moleküller gibi çevresel ipuçlarına yanıt olarak öngörülebilir OECT çıktı değişiklikleri ile sonuçlanır. Ayrıca, Boole mantığını bu genetik devrelere entegre ederek, karmaşık bakteri hesaplamalarının doğrudan elektriksel okumalarını mümkün kıldık.

Burada, cihaz üretimini, hücre kültürü hazırlığını, ölçüm prosedürlerini ve veri analizini kapsayan hibrit transistör çalışması için kapsamlı protokolü sunuyoruz. Ek olarak, cihaz temizleme, yeniden kullanılabilirlik ve yüksek verimli testlerde otomasyon potansiyeli gibi önemli hususları ele alıyoruz.

Protokol

NOT: Tüm kimyasallar daha fazla saflaştırılmadan alındığı gibi kullanılmıştır. Belirtilmemişse, analitik dereceli kimyasallar kullanılmıştır.

1. OECT cihazı imalatı

NOT: OECT'ler, önceki çalışmalardan uyarlanan standart mikrofabrikasyon teknikleri kullanılarak kuvars mikroskop slaytları üzerinde üretilmiştir²⁴. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, sekiz OECT cihazı tek bir standart slayt üzerinde düzenlenmiştir. Önceden kesilmiş polidimetilsiloksan (PDMS) tabakaları, OECT odaları ve erişim portları oluşturmak için slayt üzerine yerleştirilir. P-tipi iletken polimer poli(3,4-etilendioksitiyofen): poli(stirensülfonat) (PEDOT: PSS), OECT kanalı ve kapı elektrotu için kullanılır, kanal için 150 μm x 10 μm ve kapı ucu için 500 μm x 500 μm boyutlarında (Şekil 2B). OECT kanal imalatı ve cihaz montaj sürecinin bir özeti Şekil 2C'de verilmiştir.

1. Altın elektrot imalatı
   1. Kuvars slaytları aseton, izopropil alkol (IPA) ve deiyonize (DI) su ile durulayarak temizleyin. N₂ gazı ile fön çekin.
   2. 120 saniye boyunca 150 W'ta 50 sccm ile O₂ plazma temizliği gerçekleştirin.
   3. 2 kademeli AZ5209e fotorezist (PR): ilki 500 rpm'de, 5 sn boyunca 100 rpm/s hızlanma ve ikincisi 2000 rpm'de, 45 sn için 1000 rpm/s hızlanma.
   4. 90 °C'de 150 sn sert fırında pişirilir.
   5. Maske hizalayıcıyı (Suss MA6) açın ve UV kaynağı olarak i-line'ı (365 nm) seçin, parametreleri ayarlayın: maruz kalma süresi 3.5 s (13 W), hizalama aralığı 15 μm, WEC tipi Temas olarak. ve pozlama türü Zor'a ayarlanır.
   6. Litografi maskesini ve slaytı hizalayıcıya yerleştirin, slaytı maskeyle hizalayın ve ardından ilk pozlamayı gerçekleştirin.
   7. 110 °C'de 180 saniye ters fırında pişirin.
   8. Litografi maskesini çıkarın ve aşağıdaki parametrelerle sel maruziyeti gerçekleştirin: maruz kalma süresi 25 s (13 W), maruz kalma türü Flood E.
   9. PR'yi, üretici tarafından önceden seyreltilmiş AZ 400K 1:4 geliştirici ile geliştirin. Slaytı daldırmak için uygun miktarda geliştiriciyi kristalleşen bir kabın içine dökün ve kabı 45 saniye boyunca dairesel hareketlerle sürekli sallayın. Ardından, sürgüyü hemen çıkarın ve 45 saniye boyunca DI suda bekletin, DI su ile durulayın ve_N2 ile kurutun.
      NOT: İşlem buradan duraklatılabilir.
   10. Kızakları e-kiriş evaporatörüne taşıyın. 2,7 x ^10-4 Pa (2 x ^10-6 T) veya daha düşük bir değere pompalayın.
   11. Ti yapışkan tabakayı (10 nm) ve Au'yu (100 nm) sırayla biriktirin. Biriktirme hızı, kullanılan spesifik evaporatöre bağlı olarak değişebilir. Biriktirme kalitesi ve işleme süresi arasında iyi bir denge sağlamak için 0,1 nm/sn'lik bir biriktirme hızı önerilir.
   12. Slaytları gece boyunca asetona batırarak fazla metali çıkarın. Suya batırdıktan sonra, kalan fazla metali çıkarmak için slayt yüzeyindeki aseton akışlarını püskürtmek için bir pipet kullanın. Yukarıdaki adımlardan sonra elde edilen kuantör slaytları, OECT elektrot slaytları olarak adlandırılır.
       NOT: Alternatif olarak, aşırı metalin yerinden çıkmasına yardımcı olmak için sonikasyon kullanın.
2. PEDOT: PSS kanal imalatı
   1. OECT elektrot kızaklarını aseton, IPA ve DI su ile durulayarak temizleyin. N₂ gazı ile fön çekin.
   2. Slaytları 160 °C'de en az 5 dakika pişirin. Sıkma kaplamadan önce slaytların soğumasını bekleyin.
   3. 2 kademeli AZ5209e PR spin-coat : önce 500 rpm'de, 5 sn boyunca 100 rpm/s hızlanma, ardından 2000 rpm, 45 s'de 1000 rpm/s hızlanma.
   4. 90 °C'de 150 sn sert fırında pişirilir.
   5. i-line ile sert temas modunda 3,5 W'ta 13 saniye ile ilk pozlamayı başlatın.
   6. 110 °C'de 180 saniye ters fırında pişirin.
   7. 25 W'ta 13 saniye boyunca sele maruz kalma gerçekleştirin.
   8. AZ 400K 1:4 geliştirici ile çanağı sürekli dairesel sallayarak 45 saniye boyunca geliştirin. Daha sonra slaytları 45 saniye DI suda bekletin, DI su ile durulayın ve_N2 ile kurutun.
      NOT: İşlem buradan duraklatılabilir.
   9. PEDOT'u sonikleştirin: Şişeyi sonikatörün doldurma hattına doldurulmuş DI su banyosu üzerinde yüzdürerek 5 dakika boyunca PSS dispersiyonu. Topakları gidermek için PEDOT: PSS dispersiyonunu 0,22 μm filtre ile filtreleyin.
   10. Spin-coat PEDOT: 60 sn boyunca 3500 rpm/s'de hızlanma ile 3500 rpm'de PSS. 90 °C'de 15 dakika kurutun.
   11. Slaytları 12 dakika boyunca asetonda bekleterek ve ardından 1 dakika sonikasyon yaparak aşırı PEDOT: PSS filmini çıkarın.
   12. Slaytları aseton ve ardından IPA ile durulayın ve_N2 ile kurutun.
   13. Slaytları 90 ° C'de sıcak plakanın üzerine yerleştirerek etilen glikol (EG) işlemi yapın, ardından 5 dakika boyunca tüm PEDOT: PSS'yi kaplayacak kadar EG bırakın. DI su ile durulayın ve N₂ ile kurutun. Yukarıdaki adımlardan sonra elde edilen litre slaytlar, OECT slaytları olarak adlandırılır.
3. PDMS cihaz haznesi imalatı
   1. Baz ve sertleştirici maddeyi 10:1 oranında karıştırarak PDMS levhaları yapın. Çözeltiyi 3 mm kalınlığa ulaşacak şekilde kalıba dökün ve bir vakum pompasına bağlı 2 dörtte birlik bir gaz giderme odasında 1 saat boyunca gazdan arındırın.
   2. Pürüzsüz PDMS yüzeyleri sağlamak için kalıbı oda sıcaklığında 48 saat boyunca düz bir tezgah üzerine yerleştirerek karışımı sertleştirin. Havadaki kalıntılardan kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için kalıbın üzerini örtün.
   3. PDMS'yi tıraş bıçaklarıyla kesin ve sırasıyla 5 mm ve 1,5 mm çapında dairesel delgeçlerle cihaz odalarını ve sıvı değişim portlarını oluşturun. Kalıp dökümü sırasında kontrol edildiği gibi PDMS'nin yüksekliğinin 3 mm olduğundan emin olun (adım 1.3.1)

2. Medya hazırlığı

1. Otoklav 500 mL ultra saf su, dört paslanmaz çelik dağıtım iğnesi, iki lastik şişe kapağı (250 mL yuvarlak tabanlı şişeler için), iki 250 mL yuvarlak tabanlı şişe ve bir 500 mL cam ortam şişesi. Steril ultra saf suyu ileride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
2. Tablo 2'e göre 2x Wolfe's Trace Mineral Mix, %0.1 kasamino asitler ile modifiye edilmiş 2x Shewanella bazal ortamını (SBM) hazırlayın. Filtre: Ortamı steril cam ortam tabanına (Adım 2.1'de elde edilmiştir) bir şişe üst filtre ile sterilize edin. Bu besiyerine 2x SBM++ denir ve her + + eser Mineral Karışımı ve kasamino asitlerin ilavesini gösterir. İleride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
3. Aşağıdaki kimyasalların her birini ayrı ayrı steril (0.22 μm filtre) filtreleyin: 50 mL 1 M sodyum fumarat steril 50 mL santrifüj tüpüne; 1 mL 2.5 mg / mL kanamisin (KAN), steril bir mikrosantrifüj tüpüne 100x KAN olarak adlandırılır. 1 mL %60 w / w steril sodyum laktat (alındığı gibi kullanılır) bir mikrosantrifüj tüpüne tahsis edin. Hazırlanan tüm solüsyonları 4 °C'de saklayın.
4. Steril mikrosantrifüj tüplerinde aşağıdaki kimyasallardan 1 mL ayrı ayrı hazırlayın: 100x IPTG olarak adlandırılan 100 mM izopropil ß-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG); 100x OC6 olarak adlandırılan 10 mM 3-oksoheksanoil-homoserin lakton (OC6); 100x aTc olarak adlandırılan 1 mM anhidrotetrasiklin hidroklorür (aTc). İleride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
5. Adım 2.1'de hazırlanan sterilize edilmiş şişeleri, lastik kapakları ve iğneleri kullanarak orta stoğu boşaltın. Steril 2X SBM++ ve ultra saf suyun her birini 200 mL'lik ayrı 250 mL'lik yuvarlak tabanlı şişelere ayırın. Şişeleri lastik kapaklarla kapatın ve bir gaz yıkama kurulumu oluşturmak için steril dağıtım iğnelerini yerleştirin (sıvıya batırılmış hava giriş iğnesi; sıvı yüzeyinin üzerinde gaz çıkış iğnesi). N₂ ile 15 dakika boyunca temizleyin.
6. Temizlenmiş 2x SBM++ ve ultra saf su, laktat, 1 M sodyum fumarat, 100x KAN, 100x IPTG, 100x OC6 ve 100x aTc'yi OECT ile daha fazla kullanım için torpido gözüne aktarın.

3. OECT cihazları ile hücresel EET'nin izlenmesi

NOT: Anaerobikliği sağlamak için, OECT deneyi, oda sıcaklığında nem kontrolü olmayan bir torpido gözünde gerçekleştirilir.

1. 1. Gün
   1. Cihaz sterilizasyonu ve hazırlanması
      1. OECT slaytlarını, PDMS levhalarını ve Ag/AgCl referans elektrodunu (RE) ayrı kaplarda otoklavlayın. 80 °C'de fırınlanarak kurutulur. Otoklavlanmış OECT slaytlarını ve Ag/AgCl RE'yi torpido gözüne getirin.
      2. PDMS levhalarında hapsolmuş oksijeni, torpido gözünün ön bölmesindeki vakuma 4 saat boyunca maruz bırakarak desorbe edin. PDMS levhalarını torpido gözündeki OECT kızaklarının üzerine yerleştirerek OECT cihazını monte edin.
      3. Her OECT odasına 45 μL uygun SBM ortamı enjekte edin. Çoğu deney için, 20 mM laktat ile desteklenmiş 1x SBM++ kullanın. Örneğin, 500 μL 2x SBM++, 497 μL steril ultra saf su ve 2,85 μL %60 w/w sodyum laktatı karıştırarak 1 mL 1x SBM++ hazırlayın.
      4. Orta buharlaşma ve kirlenmeyi önlemek için OECT odası portlarını PDMS levhalarıyla kapatın.
      5. Akım stabilize olana kadar OECT kanal akımı I_DS'yi -0,05 V'luk V_{DS V DS} ve 0,2 V'luk V_GS geçit voltajı altında izleyin. Voltaj seçimi, OECT cihazına veya biyolojik numunelere bağlı olarak değişebilir. Ölçüm boyunca kapı ve kanal için aynı sürekli önyargı voltajlarını kullanın. Stabilizasyon, vakum seviyesine ve ön odadaki desorpsiyon süresine bağlı olarak saatler ila birkaç gün sürebilir.
   2. Hücre kültürleri
      1. Çizgi hücre stoklarını (-80 °C'de saklanır) LB (plazmid barındırmayan suşlar için) veya 25 μg/mL kanamisin (plazmid barındıran suşlar için) içeren LB içeren agar plakalarına dökün ve gece boyunca 30 °C'de aerobik olarak büyür^20,23.
2. 2. Gün
   1. Hücre hazırlama (aerobik kültürler)
      1. 15 mL kültür tüplerinde 20 mM laktat ile desteklenmiş 2 mL 1x SBM++ içinde LB agar plakalarından (adım 3.1.2.1'de elde edilir) rastgele tek koloniler seçin. Hücreleri gece boyunca 30 °C'de ve 250 rpm'de sallayarak tutun. Daha sonra hücre yıkamada kullanılacak olan abiyotik kontrol olarak hücresiz 6 mL büyüme ortamı hazırlayın.
   2. Hücre hazırlama (anaerobik kültür)
      1. Test edilecek suşları içeren LB agar plakalarını torpido gözüne aktarın.
      2. 15 mL kültür tüplerinde 20 mM laktat ve 40 mM fumarat ile desteklenmiş 1 mL uygun SBM'de LB agar plakalarından rastgele tek koloniler seçin. Örneğin, 500 μL 2x SBM++, 437 μL steril ultra saf su, 2.85 μL %60 w/w sodyum laktat, 40 mM 1 M sodyum fumarat, 10 μL 100 mM IPTG ve 10 μL 2.5 mg/mL KAN karıştırarak 1 mM IPTG ve 25 μg/mL KAN gerektiren IPTG ile indüklenebilir suş için 1 mL ortam hazırlayın.
      3. Hücreleri sallamadan 18 - 24 saat boyunca 30 ° C'de tutun. Deney grupları arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak için tutarlı büyüme sürelerini koruyun.
3. 3. Gün
   1. İlk OECT elektrokimyasal ölçümü
      NOT: OECT karakterizasyonlarının türü, sabit voltaj yanlılığı gibi statik tiplerden kapı darbesi gibi dinamik tiplere kadar değişir. Burada, hem dinamik hem de statik özellikleri elde etmek için kapı voltajı adım testini kullanıyoruz. OECT'ler ve cihaz arasındaki elektrik bağlantısının yeniden yapılandırılması (bu durumda çok kanallı bir potansiyostat), özelleştirilmiş manuel multipleks (MUX) devre kartları tarafından desteklenir. Yüksek verimli ölçüm için otomatik MUX kartları geliştirilebilir.
      1. Aşağıda açıklanan ayarlarla 0 V ila 0.2 V arasındaki geçit voltajı adımına karşılık gelen OECT kanal akımı I_DS'yi ölçün (tam adlar cihaza bağlı olarak değişebilir).
      2. Alet kanalı 1, OECT kanal akımı I_DS'yi ölçer. Bunun için Teknik adını ayarlayın: Hızlı Amperometri; Dengeleme süresi: 1 s; Dengeleme voltajı: - 0,05 V; Önyargı voltajı: -0,05 V; Çalışma süresi: 14 sn; Örnek aralığı: 0,5 ms.
      3. Enstrüman kanalı 2, OECT kapısı voltajını V_GS'yi kontrol eder. Bunun için Teknik adını ayarlayın: Karışık Mod; Durum süresi: 1 s; Durum voltajı: 0 V; Aşama 1 modu: Sabit E; Aşama 1 öngerilim voltajı: 0 V; Aşama 1 çalışma süresi: 4 sn; Aşama 2 modu: Sabit E; Aşama 2 öngerilim voltajı: 0,2 V; Aşama 2 çalışma süresi: 10 sn; Örnek aralığı: 0,5 ms.
      4. Tüm OECT'ler için kapı voltajı adım testini (3.3.1.1 ila 3.3.1.3 arasındaki adımlar) tekrarlayın. Bu adım, yüksek verimli test için otomatikleştirilebilir.
      5. Aşılama kadar tüm OECT'lere -0,05 V'luk sabit kanal voltajı V_DS ve 0,2 V'luk V_GS kapı voltajı uygulayın. Öngerilim voltajlarının cihaz stabilizasyonu sırasında kullanılanlarla aynı olduğundan emin olun (adım 3.1.1.5).
   2. Aşı hazırlama (aerobik kültürler)
      1. 4 dakika boyunca 1503 x g'da santrifüjleyerek ve hücre büyümesi için kullanılan 1 mL taze ortamda yeniden süspanse ederek hücreleri üç kez yıkayın (adım 3.2.1.1). Son (3.) dönüşten sonra, OD₆₀₀ 1 - 3.5'te konsantre hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri 0.5 mL'de (veya orijinal kültür hacminin yarısı) yeniden süspanse edin. Son süspansiyon hacmini buna göre ayarlayın.
      2. Hücre süspansiyonunu torpido gözüne aktarın.
      3. İnokulumu elde etmek için, hücreleri amaçlanan OD_600'ü 0.1'e (veya aşılama OD_600'ün 10 katı) seyreltin. Sanrı ortamı, büyüme ortamı ile aynı yapıya sahiptir, ancak onu temizlenmiş medya stokları ile torpido gözünde taze olarak hazırlayın. Örneğin, hücreler laktat ile desteklenmiş SBM++ içinde aerobik olarak büyütülmüşse, aşı seyreltmesi için torpido gözünde laktat ile takviye edilmiş taze SBM++ hazırlayın.
      4. Potansiyostatı durdurun. OECT'de 0.01'lik bir nihai OD₆₀₀ elde etmek için OECT odasına (45 μL uygun SBM içeren) 5 μL aşı enjekte edin. Orta buharlaşma ve kirlenmeyi önlemek için OECT odası portlarını PDMS levhalarıyla kapatın.
   3. İnokulum hazırlama (anaerobik kültürler)
      1. İnokulumu elde etmek için hücre kültürlerini 10 kat seyreltin. Büyüme ortamı ile aynı yapıya sahip olan ancak fumarattan yoksun bir yanılsama ortamı kullanın. Örneğin, hücreler laktat, fumarat, KAN ve IPTG ile desteklenmiş SBM ++ 'da anaerobik olarak büyütüldüyse, aşı seyreltmesi için torpido gözünde laktat, KAN ve IPTG ile desteklenmiş taze SBM ++ hazırlayın.
      2. Potansiyostatı durdurun. OECT odasına (45 μL uygun SBM içeren) 5 μL inokülum enjekte edin. Orta buharlaşma ve kirlenmeyi önlemek için OECT odası portlarını PDMS levhalarıyla kapatın.
   4. Sürekli ölçüm ve zaman noktaları
      1. Potansiyostatın karakterizasyon için ayrı OECT'lere bağlandığı zaman noktası ölçümleri dışında, deney boyunca OECT kanallarına (V_DS = -0.05 V) ve kapıya (V_GS = 0.2 V) sabit öngerilim voltajları uygulayın.
      2. Aşılamadan sonra deneyi 24 saat boyunca çalıştırın. Aşılamadan önceki ölçümü (bkz. adım 3.3.1) 0 saatlik zaman noktası olarak düşünün.
      3. OECT kanalı doping durumundaki önemli değişiklikler tipik olarak ilk 8 saat içinde meydana gelir. Bu süre zarfında ölçümler için 5-7 zaman noktası seçin, ardından 12 saat ile 16 saat arasında bir ölçüm yapın ve 24 saat işaretinde son zaman noktasını seçin. Örnek zaman noktaları, aşılamadan hemen sonra ve aşılamadan sonra 1 saat, 2 saat, 3 saat, 4.5 saat, 6 saat, 8 saat, 18 saat ve 24 saat zaman noktalarını içerebilir.
      4. Gece geç saatlerde yapılan ölçümlerden kaçınmak için, ilk 8 saat boyunca sık zaman noktası ölçümlerine uyum sağlamak için aşılamaya günün erken saatlerinde başlayın (bkz. adım 3.3.2 veya 3.3.3).
      5. Her zaman noktası ölçümü için 3.3.1'de belirtilen adımı tekrarlayın.
4. 4. Gün
   1. Son zaman noktasında transfer eğrisi ölçümü (24 saat)
      1. RE'yi hafifçe çevirerek ve sıvı değişim portundan iterek Ag/AgCl RE'yi OECT odasına yerleştirin.
      2. Kapı voltajını -0,1 V'tan 0,6 V'a kadar süpürerek OECT'nin transfer eğrilerini ölçün ve kanal akımı I_DS'yi -0,05 V'ta sabit önyargı V_DS ile izleyin. Ag/AgCl RE'ye karşı doğru geçit ve kaynak elektrot potansiyellerini ölçün.
      3. Cihazı aşağıda açıklandığı gibi yapılandırın (tam adlar cihaza bağlı olarak değişebilir).
      4. Alet kanalı 1, OECT kanal akımı I_{DS'yi ölçer,} aşağıdaki ayarı kullanın: Teknik adı: Kronoamperometri (CA), Dengeleme süresi: 5 sn, Dengeleme voltajı: - 0,05 V, Önyargı voltajı: -0,05 V, Çalışma süresi: 35 s, Örnekleme aralığı: 0,09915 s.
      5. Alet kanalı 2, OECT kapısı voltajı V_GS'yi kontrol eder, aşağıdaki ayarı kullanın: Teknik adı: Doğrusal Süpürme Voltametrisi (LSV), Dengeleme süresi: 5 s, Dengeleme voltajı: - 0,1 V, Başlangıç voltajı: -0,1 V, Bitiş voltajı: 0,6 V, Voltaj adımı: 0,002 V, Tarama hızı: 0,02 V/s.
      6. Cihaz kanalı 3, Ag/AgCl RE'ye karşı OECT kaynak potansiyeli_VS'yi ölçer, aşağıdaki ayarı kullanın: Teknik adı: Açık Devre Potansiyometrisi (OCP), Çalışma süresi: 40 sn, Örnekleme aralığı: 0.09915 s.
      7. Alet kanalı 4, Ag/AgCl RE'ye karşı OECT geçit potansiyeli_VG'yi ölçer, aşağıdaki ayarı kullanın: Teknik adı: Açık Devre Potansiyometrisi (OCP), Çalışma süresi: 40 sn, Örnekleme aralığı: 0.09915 s.
      8. Tüm OECT'ler için transfer eğrisi ölçümünü tekrarlayın. Her ölçümden sonra Ag/AgCl referans elektrodunu (RE) %70 etanol ile durulayın ve az tüy bırakan yeni bir havluyla silin. Ag/AgCl RE, üçlü kopyalar için aynı örnek grubu içinde yeniden kullanılabilir, ancak farklı örnek grupları arasında yeniden kullanılmamalıdır.

4. Veri analizi

1. Veri ayıklama
   1. Cihazın yerel yazılımından verilerin çıkarılmasını ve günlüğe kaydedilmesini otomatikleştirmek için veri işleme için özel MATLAB kodu kullanın ve işlem süresini önemli ölçüde azaltın. MATLAB komut dosyaları Texas Data Repository'de (https://doi.org/10.18738/T8/MNKO8D) mevcuttur.
2. Bilgi işlem
   1. Daha fazla analiz ve karşılaştırma için k hız sabitlerini elde etmek için OECT kanal akımı I_DS verilerini sığdırın (Şekil 3). EET özellikli hücre örnekleri için, tek üstel modelin en uygun şekilde sağlandığını görüyoruz. Bu nedenle, I_DS zaman serisi verilerine uymak ve takılan hız sabiti k'yi elde etmek için analiz yazılımında tek fazlı üstel bozunma modelini kullandık. Bu I_DS zaman serisi verileri, ham değer olabilir veya 0 h zaman noktasına normalleştirilebilir, çünkü oran sabiti k, mutlak değerler yerine değişim oranını yansıtır.
   2. I_DS değerlerini, I_{DS/I DS0} olarak adlandırılan 0 h zaman noktası değerine (I_DS0) bölerek normalleştirilmiş I_DS'yi elde edin.
3. Oran sabiti k'nin belirlenmesi
   1. Analiz yazılımını (Prism 10, GraphPad) açın ve Dosya > Yeni > Yeni Proje Dosyası'na tıklayarak yeni bir proje oluşturun. Oluştur sekmesi altında XY'yi seçin. Seçenekler bölümünde, X'i Sayılar olarak ayarlayın ve Y'yi Enter olarak ayarlayın ve her nokta için tek bir Y değeri çizin.
   2. OECT kanalı mevcut I_DS verilerini tabloya aktarın. Analiz sekmesinde Analiz Et'e tıklayarak I_DS verilerini tek fazlı üstel bozunma modeliyle eşleştirin. XY analizlerinde doğrusal olmayan regresyon (eğri uyumu) yöntemini bulunuz. Sağ Tarafa Takılması Gereken Tüm Veri Kümelerini seçtiğinizden emin olun ve ardından Tamam'a tıklayın.
   3. Yeni Parametreler penceresinde, Üstel grubunda Bir faz bozunma modeli'ni seçin ve ardından Tamam'a tıklayın. Model denklemi aşağıdaki gibidir:
      Y=(Y0 - Plato)*^e-k*X + Yayla
      Nerede: Y, OECT kanalının mevcut I_DS'sidir, T zamandır, k hız sabitidir.
   4. K değerleri elde edildikten sonra, her uyum için R kare değerini kontrol ederek uyum kalitesini gözden geçirin. İyi bir bağlantı parçası, 0,95'ten daha yüksek bir^R2'ye sahip olmalıdır.
4. Eşlenmemiş iki kuyruklu Öğrenci t-testi
   1. Örneklem grupları arasındaki istatistiksel anlamlılığı değerlendirmek için, eşleştirilmemiş iki kuyruklu öğrenci t-testleri yapın.
   2. Analiz yazılımını açın ve Dosya > Yeni > Yeni Proje Dosyası'na tıklayarak yeni bir proje oluşturun. Oluştur sekmesi altında XY'yi seçin. Seçenekler bölümünde, X'i Sayılar olarak ayarlayın ve Y'yi yan yana alt sütunlarda 3 çoğaltma değeri girmek için ayarlayın.
   3. Takılan oran sabiti k değerlerini tabloya aktarın. Analiz sekmesinde Analiz Et'e tıklayarak t-testini gerçekleştirin. Kolon analizlerinde t-testi (ve parametrik olmayan testler) yöntemini bulun. Her Seferinde İki Veri Kümesi'ni seçtiğinizden emin olun ve ardından Tamam'a tıklayın.
   4. Deneysel Tasarım kılavuzunda, Eşleştirilmemiş, Evet'i seçin. Parametrik test ve Eşleştirilmemiş t-testi kullanın. Her iki popülasyonun da aynı SD seçeneklerine sahip olduğunu varsayalım. Her karşılaştırma için p değerleri oluşturulacaktır. Şekillerde, p değerleri şu şekilde temsil edilir: n.s.: p > 0.05 (anlamlı değil), *: p ≤ 0.05, **: p ≤ 0.01, ***: p ≤ 0.001, ****: p ≤ 0.0001.
   5. İlgili tüm veri setleri için 4.4.3 -4.4.4 adımlarını tekrarlayın.

5. OECT cihazının temizlenmesi ve yeniden kullanılabilirliği

1. Deneyden sonra cihazı sökün ve OECT slaytlarını sabunlu suda (1:10, sabun: DI su) 15 dakika kaynatın.
2. Slaytları hızlı bir şekilde oda sıcaklığında DI su içeren bir behere taşıyın ve slaytların soğuması için 5 dakika bekleyin. Slaytları DI ile durulayın ve temiz hava ile kurutun.
3. OECT kanalının direncini bir multimetre ile ölçün. Kanal direnci orijinal değerin %400'ü içindeyse, cihaz sterilizasyondan sonra deney için yeniden kullanılabilir (Adım 3.1.1). OECT kızakları aşağıdaki adımlar kullanılarak da temizlenebilir ve Adım 1.2 kullanılarak kanal imalatı için uygundur.
   DİKKAT: Piranha çözeltisi oldukça aşındırıcıdır ve önemli ölçüde ısı üretebilir. Daima eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. Son derece dikkatli davranın ve kurumun güvenlik yönergelerine uyun.
4. Piranha çözeltisini iyi havalandırılan bir davlumbazda hazırlayın. Kristalleşme kabını hafifçe ileri geri eğerek karıştırırken 1:4 oranında %30 (a/a) hidrojen peroksiti %98 sülfürik aside dikkatlice ve yavaşça ekleyin.
5. Kristalizasyon kabını 70 °C'de ısıtılmış sıcak bir tabağa yerleştirin. Slaytları 1 dakika boyunca piranha çözeltisine getirmek ve batırmak için cımbız kullanın.
6. Slaytları dikkatlice DI su içeren bir behere aktarın ve en az 1 dakika bekletin. Slaytları DI suyla iyice durulayın ve hava ile kurutun.
7. Piranha çözeltisini kurumsal kimyasal atık imha yönergelerine göre atın. Piranha çözeltisini, çözeltinin hacminin yaklaşık 4 katı olan bir buz-su karışımı içeren bir behere yavaşça ekleyerek nötralize edin. Nötr olana kadar pH'ı test şeritleriyle izlerken yavaş yavaş nötralize edici bir ajan (örn. 10 M NaOH) ekleyin.

Sonuçlar

Takılan hız sabiti k
OECT kanal akımı I_DS'nin takılan hız sabiti k, numunenin EET aktivitesini değerlendirmek için güvenilir bir metrik görevi görür. Sabit kapı önyargı voltajları hız sabitlerini etkilerken, daha yüksek kapı voltajlarında hızlı dopingden kaçınırken ve bakteri hücreleri üzerinde elektrokimyasal stresi sağlayıp en aza indirirken bakteriyel elektron transferini teşvik etmek için p...

Tartışmalar

Elektrokimyasal Hücre (EC) Karşılaştırması
Hız sabitini OECT kanal akımından uydurmanın en büyük avantajlarından biri, ham çıktıdan ziyade I_DS değişikliklerinin altında yatan dinamiklere odaklanarak cihaz varyasyonunu en aza indirmesidir. OECT'lerin doğal sinyal amplifikasyon yeteneği ile birleştiğinde, bu yaklaşım, geleneksel elektrokimyasal hücrelere (EC) kıyasla hibrit OECT sistemlerinin sağlamlığını artırır. Örneğin, ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-oxohexanoyl-homoserine lactone	Sigma-Aldrich
anhydrotetracycline hydrochloride	VWR
casamino acids	VWR
Equipment
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich		anhydrous 99.8%,
HEPES buffer solution	VWR		1 M in water, pH = 7.3
isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside	Teknova
kanamycin sulfate	Growcells
Magnesium(II) sulfate heptahydrate	VWR
PEDOT:PSS aqueous suspension	Heraeus Epurio LLC	Clevios PH1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich
Potentiostat	PalmSens BV	MultiPalmSens4
Quartz microscopic slides	AdValue	FQ-S-003
Quartz microscopic slides
Sodium chloride	VWR
Sodium DL-lactate	TCI		60% in water
Sodium fumarate	VWR		98%
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich		95.0%-98.0%
Two-part silicone elastomer	Electron Microscopy Sciences	Sylgard184
Wolfe's Trace Mineral Mix	ATCC