基于血流动力学变化和高血压的改良颅内动脉瘤小鼠模型

摘要

使用高血压和血流动力学变化的危险因素在小鼠中构建颅内动脉瘤 （IA）。血流动力学变化是通过结扎颈动脉的分支诱导的，而高血压是通过结扎肾动脉的后支来实现的。通过磁共振血管造影、立体显微镜和病理分析检测 IA 的形成。

摘要

由于与动脉瘤破裂相关的发病率和死亡率，颅内动脉瘤 （IA） 构成重大健康风险。然而，IA 发展的分子机制仍不清楚，需要合适的小鼠模型。通过结扎翼腭动脉 （PPA） 诱导加性血流动力学变化，结合高血压诱导，建立 IA 小鼠模型。在 C57BL/6 雄性小鼠中，结扎血管，包括右侧 PPA、颈外动脉 （ECA）、枕动脉 （OcA） 和左侧对侧颈总动脉 （CCA），以诱导血流动力学变化。一周后，结扎双侧肾动脉后支 （pRA），并引入 8% 盐饮食以诱导高血压。进行磁共振血管造影 （MRA） 、立体显微镜和免疫组织化学 （IHC） 染色，以评估诱导后 3 个月 IA 的形态和病理变化。在实验组中，4 只小鼠在初始诱导后死亡。在剩余的 11 只小鼠中的 5 只中检测到不同位置的 IA。显微镜检查和 MRA 检查均证实了 IA 的形成。病理学和 IHC 分析显示内部弹性层破裂、胶原纤维断开和 CD86 阳性 M1 巨噬细胞浸润，结果与在人类 IA 中观察到的结果一致。这种 IA 小鼠模型复制了在人类样本中观察到的病理变化，可作为研究 IA 形成和进展的分子机制的宝贵工具。

引言

颅内动脉瘤 （IA） 的患病率估计占总人群的 3.2%¹。IA 由于其高相关的发病率和死亡率，构成重大的健康风险。IA 是一种复杂的多维病理状况，受血流动力学变化、炎症和血管重塑的影响 ^2,3。血流动力学变化和高血压与动脉瘤的形成和进展有关 ^4,5。IA 经常发生在血流动力学剪切应力升高的大脑分叉处⁶，而窄角的分叉被认为是人类 IA 发展的危险因素⁷。尽管血管内治疗和手术策略取得了进步，但 IA 破裂引起的蛛网膜下腔出血仍然是灾难性的。因此，探索药物治疗是预防动脉瘤破裂的一种很有前途的方法⁸。然而，IA 病理形成和进展的潜在机制仍不清楚。根据人类风险因素开发适合 IA 形成和进展的小鼠模型，对于揭示潜在机制和确定潜在治疗靶点至关重要。本研究旨在构建一个模拟人类 IA 特征的小鼠无破裂的 IA 形成模型。

Willis 环 （CW） 连接并连通右颈内动脉 （ICA）、左 ICA 和双侧椎基底动脉。CW 在 ICA 或椎动脉闭塞或狭窄的情况下用作代偿机制⁹。翼腭动脉 （PPA） 是 ICA 的一个分支，为大脑外部供血¹⁰。基于 CW 的代偿功能，PPA 闭塞会增加 ICA 中的血流量。左颈总动脉 （CCA）、右颈外动脉 （ECA） 和枕动脉 （OcA） 的联合结扎导致 CW 中的血流量增加，尤其是在窄角时，导致血流动力学变化。在这个模型中，大脑的血液供应由椎基底动脉和右侧 ICA 支持。PPA 连接不会导致小鼠的死亡率¹¹。

为了诱导基于弹性蛋白酶注射的 IA 模型，通过 Alzet 泵或醋酸脱氧皮质酮 （DOCA） 盐释放血管紧张素 II （Ang-II） 诱导高血压^12,13。在涉及大量动物的实验中，应考虑 Alzet 和 DOCA 的高成本。双侧肾动脉后支和下支结扎或仅双侧肾动脉后支结扎之间达到的高血压水平无显著差异。然而，前一种方法导致更大的肾功能不全¹⁴。因此，对于大多数研究人员来说，双侧后肾动脉 （pRA） 结扎被认为是一种合理的方法。

通过单次立体定向注射将弹性蛋白酶注射到右侧基底池的脑脊液中¹²。基于弹性蛋白酶注射的 IA 模型在注射 3 周后导致 60%-80% 的 IA 破裂^15,16，这对于研究 IA 的形成和发展来说太短了。此外，没有证据表明在 IA 形成过程中人类弹性蛋白酶水平升高。此外，将立体定向注射到右侧水箱与小鼠的高死亡率和残疾有关，对新手构成重大挑战。

在本研究中，基于人类危险因素构建了 3 个月内无破裂的 IA 小鼠模型。这种模式消除了与 DOCA 和 Alzet 相关的高成本。此外，它只能使用立体显微镜进行，并且新手可以轻松掌握。

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研究方案

小鼠的所有作程序均符合伦理审查委员会的标准，并得到了上海交通大学机构动物护理和使用委员会的批准。将 C57BL/6 雄性小鼠 （8 周龄，20-25 g） 饲养在 22 °C 的温度下，光照/黑暗循环 12 h/12 h。作过程如图 1A 所示。简而言之，在麻醉动物中，连接左颈总动脉 （CCA）、右颈外动脉 （ECA）、枕动脉 （OcA） 和翼腭动脉 （PPA） 以诱导血流动力学变化。随后在血流动力学变化开始一周后通过结扎双侧肾动脉 （bRA） 诱发高血压，并给动物喂食含 8% 盐的饮食。血流动力学变化和 IA 形成如图 1B 所示。材料 表中提供了本研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 基于血流动力学变化和高血压的小鼠 UIA 的建立

注意：小鼠在手术前禁食 12 小时。通过将手术器械浸泡在 70% 酒精中至少 30 分钟来消毒手术器械。

1. 使用小型动物麻醉机进行麻醉（遵循机构批准的方案），在保持在 37 °C 的加热垫上吸入 O₂ （1 L/min） 的混合物中 2% 异氟醚。
2. 连扎左侧 CCA
   1. 沿颈椎中线做一个 1 cm 的线性切口。解剖皮下组织和颈阔肌以暴露气管。
   2. 拉开颈静脉并沿气管找到颈动脉鞘（图 2A i，ii）。将左侧 CCA 与迷走神经分开。用 6-0 丝缝合线连接左侧 CCA（图 2A iii，iv）。
3. 连接正确的 ECA 和 OcA
   1. 暴露右侧 CCA、ICA、ECA、OcA、迷走神经和舌下神经的解剖结构。用 6-0 丝缝合线连接右侧 ECA（图 2A iii，iv）。
   2. 分离 OcA 并用 8-0 连接丝缝合线（图 2A v - viii）。使用两个直的微型镊子断开 OcA。
      注意：从 ECA 近端产生的 OcA 位于舌下神经下方（图 2A v - viii）。剖析 OcA 有助于有效地暴露 PPA 解剖结构。
4. 连接正确的 PPA
   1. 将舌下神经与 ICA 隔离。在舌下神经和 ICA 之间放置手术棉，以保护神经免受与手术相关的损伤。
   2. 使用显微镊子解剖 PPA 周围的血管周围组织。夹住 PPA 并暂时轻轻将其向上拉。放置 8-0PPA 和 ICA 之间的丝缝合线以连接 PPA（图 2A ix，x）。
   3. 连接 PPA 并在连接部位和 PPA 起点之间保持足够的距离，以确保血液在 Willis 圈内流动（图 2A x）。
      注意：此步骤的主要挑战是在极其狭窄的作空间内连接 PPA，而不会损害周围神经和血管结构。避免在 PPA 暴露期间压迫气管。
5. 完成作
   1. 用聚维酮碘对手术区域进行消毒并缝合伤口。监测小鼠，直到它们从麻醉中恢复。
6. 诱发高血压
   1. 在背部^{第 2 椎} 体水平做一个 12 厘米长的中线切口。切开背肌，露出肾脏。使用镊子夹住肾脏周围的脂肪组织，并将肾脏固定在肌肉切口内（图 2B i，ii）。
   2. 隔离肾蒂周围的脂肪组织。识别与肾静脉密切接触的 pRA（图 2B iii，iv）。夹住 pRA 并使用直的微型镊子将其拉起。使用另一个微型镊子解剖 pRA 和肾静脉之间的筋膜（图 2B v，vi）。
      注意： 小心作，以防止肾静脉损伤，这可能导致灾难性出血。
   3. 用 6-0 丝缝合线连接 pRA（图 2B vii、viii）。结扎后，立即观察肾脏上部形成的缺血病灶（图 2B ix，x）。缝合肌肉和皮肤切口。

2. 通过 MRA 和体视显微镜 进行 IA 检查

1. 在动脉瘤诱导后 3 个月进行飞行时间 （TOF） 7.0 T 磁共振血管造影 （MRA），以评估 IA 的形成。
   1. 异氟醚麻醉后 通过 放血和宫颈脱位对小鼠实施安乐死（遵循机构批准的方案）。如前所述，在立体显微镜下检测 IA¹⁷.
   2. 用冷却的 PBS 注入样品，然后注入 4% 多聚甲醛，然后用 Microfil 进行成像，以观察血管和动脉瘤。
   3. 将动脉瘤定义为比载瘤动脉大 1.5 倍的向外凸出，正如两位独立的神经外科医生所观察到的那样 ^8,18。

3. 组织学和免疫组化分析

1. 在显微镜下分离 Willis 的圆圈。用 4% 多聚甲醛在 4 °C 下固定标本 24 小时¹⁹。
2. 将标本加工成石蜡和冰冻切片，用于组织学和免疫荧光染色。根据制造商的说明用 EVG 和 Masson 染色剂对石蜡切片进行染色¹⁹.
3. 用封闭溶液孵育石蜡切片，以尽量减少非特异性结合。
4. 将切片与抗 CD86 的一抗在 4 °C 下孵育过夜。 与二抗孵育后，通过将切片与 DAB²⁰ 反应而形成棕色。
5. 用苏木精进行复染，并用水封片剂²⁰.

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结果

IA 形成率
在实验组 （n = 15） 中，2 只小鼠在初始手术后第一周内因未知原因死亡。一只小鼠在第二次手术后的第 3 天死于背部伤口感染，另一只小鼠在第 38 天因未知原因死亡，未检测到动脉瘤。在对照组 （n = 5） 中，所有 5 只小鼠都存活到处死。在实验组存活的小鼠 （n = 11） 中，诱导后 3 个月的收缩压显著高于诱导前（90 ± 1.39 毫米汞柱 vs. 126.63...

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讨论

本研究提出了一种改进的方法，通过连接 PPA 来构建 IA 小鼠模型，以诱导与高血压结合的附加血流动力学变化。MRA 成像和显微镜分析显示 Willis 环内有明显的动脉瘤变化。在该模型中观察到的病理改变与在人类样本中发现的一致。这种小鼠模型可以作为研究 IA 形成和发展的分子机制的宝贵工具。

通过连接左侧 CCA、ECA、OcA、PPA 和双侧肾后动脉 （pRA）...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
7.0 T magnetic resonance angiography	Bruker	BioSpec 70/20
C57BL/6 mice	Charles River Laboratories		sex: male
CD86 antibody	CST	91882
Elastic Van Gieson (EVG)stain	Solarbio	G1597
Masson	Solarbio	G1340
Micro forcep	Shanghai Jinzhong Instrument Company
Microfil	Flow Tech Inc.	MV-120
Small animal anesthesia machine	RWD	R500
Stereo microscope	Shanghai Optical Instrument Company	XYH-6B
Suture	Shanghai Jinhuan Medical Company		6-0, 8-0