Ein modifiziertes Mausmodell des intrakraniellen Aneurysmas basierend auf hämodynamischer Veränderung und Hypertonie

Zusammenfassung

Das intrakranielle Aneurysma (IA) wurde bei Mäusen unter Verwendung der Risikofaktoren für Bluthochdruck und hämodynamische Veränderungen konstruiert. Hämodynamische Veränderungen wurden durch die Ligatierung der Äste der Halsschlagader induziert, während die Hypertonie durch die Ligatur der hinteren Äste der Nierenarterie erreicht wurde. Die IA-Bildung wurde durch Magnetresonanzangiographie, Stereomikroskopie und pathologische Analyse nachgewiesen.

Zusammenfassung

Das intrakranielle Aneurysma (IA) stellt aufgrund der Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit einer Aneurysmaruptur ein erhebliches Gesundheitsrisiko dar. Die molekularen Mechanismen, die der Entwicklung von IA zugrunde liegen, sind jedoch noch unklar, und ein geeignetes Mausmodell ist erforderlich. Ein Mausmodell der IA wurde durch Ligation der Arteria pterygopalatinin (PPA) etabliert, um additive hämodynamische Veränderungen in Kombination mit einer Hypertonie-Induktion zu induzieren. Bei männlichen Mäusen mit C57BL/6 wurden Gefäße, einschließlich der rechten PPA, der Arteria carotis externa (ECA), der Arteria occipitalis (OcA) und der linken kontralateralen Arteria carotis communis (CCA), ligiert, um hämodynamische Veränderungen zu induzieren. Eine Woche später wurden die bilateralen hinteren Äste der Nierenarterie (pRA) ligiert und eine 8%ige Salzdiät eingeführt, um Bluthochdruck zu induzieren. Magnetresonanzangiographie (MRA), Stereomikroskopie und immunhistochemische (IHC) Färbung wurden durchgeführt, um die morphologischen und pathologischen Veränderungen der IA drei Monate nach der Induktion zu bewerten. In der Versuchsgruppe starben vier Mäuse nach der ersten Induktion. IA an verschiedenen Stellen wurde bei fünf der elf verbleibenden Mäuse nachgewiesen. Sowohl mikroskopische als auch MRA-Untersuchungen bestätigten die IA-Bildung. Pathologische und IHC-Analysen zeigten eine Störung der inneren elastischen Lamina, eine Trennung der Kollagenfasern und eine Infiltration von CD86-positiven M1-Makrophagen, Ergebnisse, die mit denen übereinstimmen, die bei humanen IA beobachtet wurden. Dieses Mausmodell der IA repliziert die pathologischen Veränderungen, die in menschlichen Proben beobachtet wurden, und kann als wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der IA-Bildung und -Progression dienen.

Einleitung

Die Prävalenz des intrakraniellen Aneurysmas (IA) wird auf 3,2 % der Allgemeinbevölkerung geschätzt¹. Die IA stellt aufgrund ihrer hohen Morbidität und Mortalität ein erhebliches Gesundheitsrisiko dar. IA ist eine komplexe und mehrdimensionale pathologische Erkrankung, die durch hämodynamische Veränderungen, Entzündungen und vaskulären Umbau beeinflusst wird ^2,3. Hämodynamische Veränderungen und Hypertonie sind an der Bildung und dem Fortschreiten von Aneurysmen beteiligt ^4,5. IA tritt häufig an zerebralen Bifurkationen mit erhöhter hämodynamischer Scherspannung^{auf 6}, und Bifurkationen mit engen Winkeln werden als Risikofaktoren für die Entwicklung von IA beim Menschen identifiziert⁷. Trotz Fortschritten bei endovaskulären Behandlungen und chirurgischen Strategien ist die durch eine IA-Ruptur verursachte Subarachnoidalblutung nach wie vor katastrophal. Daher ist die Erforschung pharmakologischer Behandlungen ein vielversprechender Ansatz zur Vorbeugung von Aneurysmarupturen⁸. Die Mechanismen, die der pathologischen Entstehung und dem Fortschreiten der IA zugrunde liegen, sind jedoch unklar. Die Entwicklung eines geeigneten Mausmodells für die Bildung und Progression von IA, das auf humanen Risikofaktoren basiert, ist entscheidend, um die zugrunde liegenden Mechanismen aufzudecken und potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren. Ziel dieser Studie ist es, ein Modell der IA-Bildung ohne Bruch bei Mäusen zu konstruieren, das menschliche IA-Merkmale nachahmt.

Der Willis-Zirkel (CW) verbindet und kommuniziert die rechte Arteria carotis interna (ICA), die linke ICA und die bilateralen Arterien vertebrobasilaris. Die CW dient als Kompensationsmechanismus bei Verschlüssen oder Stenosen der ICA oder der Wirbelarterie⁹. Die Arteria pterygopalatinin (PPA) ist ein Ast der ICA, der den äußeren Teil des Gehirns mit Blut versorgt¹⁰. Basierend auf der kompensatorischen Funktion des CW erhöht der PPA-Verschluss den Blutfluss im ICA. Die Kombination der Ligatur der linken Arteria carotis communis (CCA), der rechten Arteria carotis externa (ECA) und der Arteria occipitalis (OcA) führt zu einem erhöhten Blutfluss in der CW, insbesondere bei verengten Winkeln, was zu hämodynamischen Veränderungen führt. In diesem Modell wird die Blutversorgung des Gehirns durch die Arteria vertebrobasilaris und die rechte ICA unterstützt. Die PPA-Ligation trug bei den Mäusen nicht zur Mortalität bei¹¹.

Um ein IA-Modell auf der Grundlage einer Elastase-Injektion zu induzieren, wurde die Hypertonie durch Freisetzung von Angiotensin-II (Ang-II) über eine Alzet-Pumpe oder Desoxycorticosteronacetat (DOCA)-Salz^{induziert 12,13}. Die hohen Kosten von Alzet und DOCA sollten bei Versuchen mit einer großen Anzahl von Tieren berücksichtigt werden. Die erreichten Hypertoniewerte unterschieden sich nicht signifikant zwischen der Ligatur der hinteren und unteren Äste der bilateralen Nierenarterien oder nur der hinteren Äste der bilateralen Nierenarterien. Der erste Ansatz führte jedoch zu einer stärkeren Nierenfunktionsstörung¹⁴. Daher wird die Ligatur der bilateralen hinteren Nierenarterien (pRA) für die meisten Forscher als rationale Methode angesehen.

Elastase wurde über eine einzige stereotaktische Injektion¹² in die Zerebrospinalflüssigkeit an der rechten basalen Zisterne injiziert. Das auf Elastase-Injektion basierende IA-Modell verursachte drei Wochen nach der Injektion eine Ruptur von 60 % bis 80 % IA^15,16, was zu kurz ist, um die IA-Bildung und -Entwicklung zu untersuchen. Darüber hinaus gibt es keine Hinweise auf erhöhte Elastasespiegel beim Menschen während der IA-Bildung. Darüber hinaus ist die stereotaktische Injektion in die rechte Zisterne bei Mäusen mit einer hohen Mortalität und Behinderung verbunden, was für Anfänger eine große Herausforderung darstellt.

In dieser Studie wurde ein Mausmodell der IA ohne Ruptur innerhalb von drei Monaten auf der Grundlage von humanen Risikofaktoren konstruiert. Dieses Modell eliminiert die hohen Kosten, die mit DOCA und Alzet verbunden sind. Darüber hinaus kann es nur mit einem Stereomikroskop durchgeführt werden und kann von Anfängern leicht beherrscht werden.

Protokoll

Alle operativen Verfahren an Mäusen entsprachen den Kriterien des Ethical Review Committee und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Shanghai Jiaotong University genehmigt. C57BL/6 männliche Mäuse (8 Wochen alt, 20-25 g) wurden bei einer Temperatur von 22 °C mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 h/12 h untergebracht. Der Betriebsprozess ist in Abbildung 1A dargestellt. Kurz gesagt, bei anästhesierten Tieren wurden die linke Arteria carotis communis (CCA), die rechte Arteria carotis externa (ECA), die Arteria occipitalis (OcA) und die Arteria pterygopalatinin (PPA) ligiert, um hämodynamische Veränderungen zu induzieren. Eine Woche nach Beginn der hämodynamischen Veränderungen wurde anschließend durch Ligatur der bilateralen Nierenarterien (bRA) Hypertonie induziert, und die Tiere erhielten ein Futter mit 8 % Salz. Hämodynamische Veränderungen und die IA-Bildung sind in Abbildung 1B dargestellt. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle enthalten.

1. Etablierung von Maus-UIA basierend auf hämodynamischen Veränderungen und Bluthochdruck

HINWEIS: Die Mäuse wurden vor der Operation 12 Stunden lang gefastet. Chirurgische Instrumente wurden sterilisiert, indem sie mindestens 30 Minuten lang in 70%igem Alkohol eingeweicht wurden.

1. Verabreichen Sie die Anästhesie (nach institutionell anerkannten Protokollen) mit einem Kleintieranästhesiegerät mit 2 % Isofluran-Inhalation in einer Mischung aus O₂ (1 l/min) auf einem beheizten Kissen, das bei 37 °C gehalten wird.
2. Likette den linken CCA
   1. Machen Sie einen 1 cm langen linearen Schnitt entlang der zervikalen Mittellinie. Präparieren Sie Unterhautgewebe und Platysma, um die Luftröhre freizulegen.
   2. Ziehen Sie die Halsvene weg und lokalisieren Sie die Halsschlagaderscheide entlang der Luftröhre (Abbildung 2A i, ii). Trennen Sie den linken CCA vom Vagusnerv. Ligattieren Sie die linke CCA mit einer 6-0 Seidennaht (Abbildung 2A iii,iv).
3. Verhandeln Sie die richtigen ECA und OCA
   1. Legen Sie die anatomische Struktur des CCA, ICA, ECA, OcA, des Vagusnervs und des Nervus hypoglossus auf der rechten Seite frei. Lizieren Sie die rechte ECA mit einer 6-0 Seidennaht (Abbildung 2A iii,iv).
   2. Isolieren Sie den OcA und ligieren Sie ihn mit einem 8-0 Seidennaht (Abbildung 2A v - viii). Trennen Sie die OcA mit zwei geraden Mikrozangen.
      HINWEIS: Der OcA, der proximal von der ECA ausgeht, liegt unterhalb des Nervus hypoglossus (Abbildung 2A v - viii). Das Präparieren des OcA hilft, die PPA-Anatomie effektiv freizulegen.
4. Verhandeln Sie das richtige PPA
   1. Isolieren Sie den Nervus hypoglossus aus dem ICA. Legen Sie chirurgische Watte zwischen den Nervus hypoglossus und den ICA, um den Nerv vor Eingriffsschäden zu schützen.
   2. Präparieren Sie das perivaskuläre Gewebe um das PPA herum mit einer Mikrozange. Klemmen Sie das PPA ein und ziehen Sie es vorübergehend leicht nach oben. Platzieren Sie einen 8-0 Seidennaht zwischen PPA und ICA, um das PPA zu ligieren (Abbildung 2A ix,x).
   3. Lilizieren Sie das PPA und halten Sie einen ausreichenden Abstand zwischen der Ligaturstelle und dem Ursprung des PPA ein, um den Blutfluss im Willis-Kreis sicherzustellen (Abbildung 2A x).
      HINWEIS: Die primäre Herausforderung in diesem Schritt besteht darin, das PPA in einem extrem engen Operationsraum zu ligieren, ohne periphere Nerven und Gefäßstrukturen zu beeinträchtigen. Vermeiden Sie es, die Luftröhre während der PPA-Exposition zu komprimieren.
5. Schließen Sie den Vorgang ab
   1. Das Operationsfeld mit Povidon-Jod sterilisieren und die Wunde vernähen. Überwachen Sie Mäuse, bis sie sich von der Narkose erholen.
6. Induzieren Sie Bluthochdruck
   1. Machen Sie einen 2 cm langen Schnitt in der Mittellinie auf Höhe des 12^. Wirbels auf dem Rücken. Durchtrennen Sie die Rückenmuskulatur, um die Niere freizulegen. Klemmen Sie das Fettgewebe mit einer Pinzette um die Niere und fixieren Sie die Niere im Muskelschnitt (Abbildung 2B i,ii).
   2. Isolieren Sie das Fettgewebe um den Nierenstiel. Identifizieren Sie die pRA in engem Kontakt mit der Nierenvene (Abbildung 2B iii, iv). Klemmen Sie die pRA ein und ziehen Sie sie mit einer geraden Mikrozange nach oben. Präparieren Sie die Faszie zwischen der pRA und der Nierenvene mit einer weiteren Mikrozange (Abbildung 2B v,vi).
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um Schäden an der Nierenvene zu vermeiden, die zu katastrophalen Blutungen führen könnten.
   3. Litarieren Sie die pRA mit einer 6-0 Seidennaht (Abbildung 2B vii, viii). Unmittelbar nach der Ligatur ist zu beobachten, wie sich ischämische Herde im oberen Teil der Niere bilden (Abbildung 2B ix,x). Nähen Sie die Muskel- und Hautschnitte.

2. IA-Untersuchung mittels MRA und Stereomikroskop

1. Führen Sie drei Monate nach der Aneurysma-Induktion eine Time-of-Flight (TOF) 7,0 T Magnetresonanzangiographie (MRA) durch, um die IA-Bildung zu beurteilen.
   1. Euthanasthan der Mäuse durch Exsanguination und Zervixluxation nach Isofluran-Anästhesie (nach institutionell anerkannten Protokollen). Erkennen Sie IA unter einem Stereomikroskop, wie zuvor berichtet¹⁷.
   2. Infinzieren Sie die Proben mit gekühltem PBS, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd und dann Microfil, um Gefäße und Aneurysmen sichtbar zu machen.
   3. Definieren Sie ein Aneurysma als nach außen gewölbt, 1,5-mal größer als die Mutterarterie, wie von zwei unabhängigen Neurochirurgen beobachtet ^8,18.

3. Histologische und immunhistochemische Analysen

1. Isolieren Sie die Kreise von Willis unter einem Mikroskop. Fixieren Sie die Proben mit 4% Paraformaldehyd bei 4 °C für 24 h¹⁹.
2. Verarbeiten Sie die Proben zu Paraffin- und Schnellschnitten für die histologische und Immunfluoreszenzfärbung. Paraffinabschnitte mit EVG- und Masson-Beizen gemäß den Herstellerangaben^{färben 19}.
3. Inkubieren Sie die Paraffinabschnitte mit einer Blockierungslösung, um unspezifische Bindungen zu minimieren.
4. Abschnitte mit Primärantikörpern gegen CD86 über Nacht bei 4 °C inkubieren. Nach der Inkubation mit einem Sekundärantikörper wird durch Reaktion der Schnitte mit DAB²⁰ eine braune Farbe entwickelt.
5. Eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin wird durchgeführt und die Schnitte mit einer wässrigen Einbettlösung²⁰ eingefasst.

Ergebnisse

Rate der IA-Bildung
In der Versuchsgruppe (n = 15) starben 2 Mäuse innerhalb der ersten Woche nach dem initialen Eingriff aus unbekannten Gründen. Eine Maus starb am dritten Tag nach dem zweiten Eingriff an einer Infektion in der Rückenwunde, und eine weitere Maus starb am Tag 38 aus unbekannten Gründen, ohne dass Aneurysmen festgestellt wurden. In der Kontrollgruppe (n = 5) überlebten alle 5 Mäuse bis zur Tötung. Bei den überlebenden Mäusen der Versuchsgrupp...

Diskussion

Diese Arbeit stellt einen modifizierten Ansatz zur Konstruktion eines Mausmodells der IA durch Ligation des PPA vor, um additive hämodynamische Veränderungen in Kombination mit Hypertonie zu induzieren. MRA-Bildgebung und mikroskopische Analyse zeigten signifikante aneurysmatische Veränderungen im Kreis von Willis. Die pathologischen Veränderungen, die in diesem Modell beobachtet wurden, stimmen mit denen überein, die in menschlichen Proben gefunden wurden. Dieses Mausmodell kann al...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
7.0 T magnetic resonance angiography	Bruker	BioSpec 70/20
C57BL/6 mice	Charles River Laboratories		sex: male
CD86 antibody	CST	91882
Elastic Van Gieson (EVG)stain	Solarbio	G1597
Masson	Solarbio	G1340
Micro forcep	Shanghai Jinzhong Instrument Company
Microfil	Flow Tech Inc.	MV-120
Small animal anesthesia machine	RWD	R500
Stereo microscope	Shanghai Optical Instrument Company	XYH-6B
Suture	Shanghai Jinhuan Medical Company		6-0, 8-0