Un modelo murino modificado de aneurisma intracraneal basado en el cambio hemodinámico y la hipertensión

Resumen

El aneurisma intracraneal (AI) se construyó en ratones utilizando los factores de riesgo de hipertensión y cambios hemodinámicos. Los cambios hemodinámicos fueron inducidos por la ligadura de las ramas de la arteria carótida, mientras que la hipertensión se logró mediante la ligadura de las ramas posteriores de la arteria renal. La formación de IA se detectó mediante angiografía por resonancia magnética, microscopía estereoscópica y análisis anatomopatológico.

Resumen

El aneurisma intracraneal (AI) representa un riesgo significativo para la salud debido a la morbilidad y mortalidad asociadas con la ruptura del aneurisma. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo de la IA siguen sin estar claros y se requiere un modelo de ratón adecuado. Se estableció un modelo murino de IA mediante la ligadura de la arteria pterigopalatina (PPA) para inducir cambios hemodinámicos aditivos, combinados con inducción de hipertensión. En ratones machos C57BL/6, se ligaron vasos, incluyendo la PPA derecha, la arteria carótida externa (ECA), la arteria occipital (OcA) y la arteria carótida común contralateral izquierda (CCA), para inducir cambios hemodinámicos. Una semana después, se ligaron las ramas posteriores bilaterales de la arteria renal (ARP) y se introdujo una dieta con sal al 8% para inducir hipertensión. Se realizó angiografía por resonancia magnética (ARM), estereomicroscopía y tinción inmunohistoquímica (IHQ) para evaluar los cambios morfológicos y patológicos en la AI tres meses después de la inducción. En el grupo experimental, cuatro ratones murieron después de la inducción inicial. Se detectó IA en diferentes localizaciones en cinco de los once ratones restantes. Tanto los exámenes microscópicos como los de ARM confirmaron la formación de IA. Los análisis anatomopatológicos y de IHQ revelaron disrupción de la lámina elástica interna, desconexión de las fibras de colágeno e infiltración de macrófagos M1 CD86 positivos, hallazgos consistentes con los observados en la AI humana. Este modelo de ratón de IA replica los cambios patológicos observados en muestras humanas y puede servir como una herramienta valiosa para investigar los mecanismos moleculares de la formación y progresión de IA.

Introducción

La prevalencia de aneurisma intracraneal (AI) se estima en 3,2% de la población general¹. La AI representa un riesgo significativo para la salud debido a su alta morbilidad y mortalidad asociadas. La AI es una condición patológica compleja y multidimensional influenciada por cambios hemodinámicos, inflamación y remodelación vascular ^2,3. Los cambios hemodinámicos y la hipertensión están implicados en la formación y progresión de los aneurismas ^4,5. La IA ocurre frecuentemente en bifurcaciones cerebrales con esfuerzo de cizallamiento hemodinámico elevado⁶, y las bifurcaciones con ángulos estrechos se identifican como factores de riesgo para el desarrollo de IA en humanos⁷. A pesar de los avances en los tratamientos endovasculares y las estrategias quirúrgicas, la hemorragia subaracnoidea causada por la ruptura de la AI sigue siendo catastrófica. Por lo tanto, la exploración de tratamientos farmacológicos es un enfoque prometedor para la prevención de la rotura de un aneurisma⁸. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la formación patológica y la progresión de la AI siguen sin estar claros. El desarrollo de un modelo de ratón adecuado para la formación y progresión de la IA, basado en los factores de riesgo humanos, es crucial para descubrir los mecanismos subyacentes e identificar posibles dianas terapéuticas. Este estudio tiene como objetivo construir un modelo de formación de IA sin ruptura en ratones que imite las características de la IA humana.

El círculo de Willis (CW) conecta y comunica la arteria carótida interna derecha (ICA), la ICA izquierda y las arterias vertebrobasilares bilaterales. La CW sirve como mecanismo compensatorio en casos de oclusión o estenosis de la ACI o de la arteria vertebral⁹. La arteria pterigopalatina, es una rama de la ACI que suministra sangre a la parte externa del cerebro¹⁰. Sobre la base de la función compensatoria de la CW, la oclusión de PPA aumenta el flujo sanguíneo en la ACI. La combinación de la ligadura de la arteria carótida común izquierda (ACC), la arteria carótida externa derecha (ECA) y la arteria occipital (OcA) da como resultado un aumento del flujo sanguíneo en la CW, particularmente en ángulos estrechos, lo que conduce a cambios hemodinámicos. En este modelo, el suministro de sangre al cerebro está respaldado por la arteria vertebrobasilar y la ICA derecha. La ligadura de PPA no contribuyó a la mortalidad en los ratones¹¹.

Para inducir un modelo de AI basado en la inyección de elastasa, la hipertensión fue inducida por liberación de angiotensina-II (Ang-II) a través de una bomba de Alzet o acetato de desoxicorticosterona (DOCA)-sal^12,13. El alto costo de Alzet y DOCA debe tenerse en cuenta en experimentos con un gran número de animales. Los niveles de hipertensión alcanzados no fueron significativamente diferentes entre la ligadura de las ramas posterior e inferior de las arterias renales bilaterales o solo las ramas posteriores de las arterias renales bilaterales. Sin embargo, el primer abordaje resultó en una mayor disfunción renal¹⁴. Por lo tanto, la ligadura de las arterias renales posteriores bilaterales (ARPr) se considera un método racional para la mayoría de los investigadores.

La elastasa se inyectó en el líquido cefalorraquídeo en la cisterna basal derecha mediante una única inyección estereotáxica¹². El modelo de IA basado en la inyección de elastasa causó una ruptura de IA del 60% al 80% tres semanas después de la inyección^15,16, que es demasiado corto para estudiar la formación y el desarrollo de IA. Además, no hay evidencia que sugiera niveles elevados de elastasa en humanos durante la formación de IA. Además, la inyección estereotáxica en la cisterna derecha se asocia con una alta mortalidad y discapacidad en ratones, lo que plantea desafíos significativos para los novatos.

En este estudio, se construyó un modelo murino de IA sin ruptura en un plazo de tres meses basado en factores de riesgo humanos. Este modelo elimina el alto costo asociado con DOCA y Alzet. Además, se puede realizar usando solo un microscopio estereoscópico y puede ser fácilmente dominado por principiantes.

Protocolo

Todos los procedimientos operativos en ratones se adhirieron a los criterios del Comité de Revisión Ética y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Jiaotong de Shanghai. Los ratones machos C57BL/6 (8 semanas de edad, 20-25 g) se alojaron a una temperatura de 22 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h. El proceso operativo se muestra en la Figura 1A. Brevemente, en animales anestesiados, la arteria carótida común izquierda (ACC), la arteria carótida externa derecha (ECA), la arteria occipital (OcA) y la arteria pterigopalatina (PPA) fueron ligadas para inducir cambios hemodinámicos. Posteriormente, la hipertensión se indujo mediante la ligadura de las arterias renales bilaterales (ARb) una semana después del inicio de los cambios hemodinámicos, y los animales fueron alimentados con una dieta que contenía un 8% de sal. Los cambios hemodinámicos y la formación de IA se representan en la Figura 1B. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Establecimiento de AIU en ratón basado en cambios hemodinámicos e hipertensión

NOTA: Los ratones se ayunaron durante 12 h antes de la operación. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizaron sumergiéndolos en alcohol al 70% durante al menos 30 min.

1. Administrar la anestesia (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) utilizando una máquina de anestesia para animales pequeños con inhalación de isoflurano al 2% en una mezcla de_O2 (1 L/min) sobre una almohadilla calefactada mantenida a 37 °C.
2. Ligar el CCA izquierdo
   1. Realice una incisión lineal de 1 cm a lo largo de la línea media cervical. Diseccionar el tejido subcutáneo y el platisma para exponer la tráquea.
   2. Retire la vena yugular y ubique la vaina carotídea a lo largo de la tráquea (Figura 2A i,ii). Separe el CCA izquierdo del nervio vago. Ligue el CCA izquierdo con una sutura de seda 6-0 (Figura 2A iii, iv).
3. Lijar el ECA y OcA correctos
   1. Exponga la estructura anatómica del CCA, ICA, ECA, OcA, el nervio vago y el nervio hipogloso en el lado derecho. Limine el ECA derecho con una sutura de seda 6-0 (Figura 2A iii, iv).
   2. Aislar el OcA y ligarlo con un 8-0 sutura de seda (Figura 2A v - viii). Desconecte el OcA con dos micropinzas rectas.
      NOTA: El OcA, que surge proximalmente del ECA, se encuentra debajo del nervio hipogloso (Figura 2A v - viii). La disección del OcA ayuda a exponer la anatomía del PPA de manera efectiva.
4. Ligar el PPA correcto
   1. Aislar el nervio hipogloso de la ICA. Coloque algodón quirúrgico entre el nervio hipogloso y la ICA para proteger el nervio de lesiones relacionadas con el procedimiento.
   2. Diseccionar el tejido perivascular alrededor de la PPA con micropinzas. Sujete el PPA y tire temporalmente hacia arriba ligeramente. Coloca un 8-0 sutura de seda entre el PPA y el ICA para ligar el PPA (Figura 2A, ix,x).
   3. Libar el PPA y mantener una distancia suficiente entre el sitio de ligadura y el origen del PPA para asegurar el flujo sanguíneo en el círculo de Willis (Figura 2A x).
      NOTA: El desafío principal en este paso es ligar el PPA dentro de un espacio quirúrgico extremadamente estrecho sin dañar los nervios periféricos y las estructuras vasculares. Evite comprimir la tráquea durante la exposición al PPA.
5. Finalizar la operación
   1. Esterilizar el campo operacional con povidona yodada y suturar la herida. Monitoree a los ratones hasta que se recuperen de la anestesia.
6. Inducir hipertensión
   1. Realizar una incisión de 2 cm de largo en la^{línea media a} nivel 12 de la vértebra en la espalda. Corta los músculos dorsales para exponer el riñón. Pinzar el tejido adiposo alrededor del riñón con pinzas y fijar el riñón dentro de la incisión muscular (Figura 2B i,ii).
   2. Aísla el tejido adiposo alrededor del pedículo renal. Identificar el ARPp en estrecho contacto con la vena renal (Figura 2B iii,iv). Sujete el pRA y tire de él hacia arriba con micropinzas rectas. Diseccionar la fascia entre la ARP y la vena renal con otra micropinza (Figura 2B v,vi).
      NOTA: Tenga cuidado para evitar daños en la vena renal, lo que podría provocar una hemorragia catastrófica.
   3. Lime el pRA con una sutura de seda 6-0 (Figura 2B vii, viii). Inmediatamente después de la ligadura, observar la formación de focos isquémicos en la parte superior del riñón (Figura 2B ix,x). Suturar el músculo y las incisiones en la piel.

2. Examen de IA mediante ARM y microscopio estereoscópico

1. Realizar una angiografía por resonancia magnética (ARM) de 7,0 T con tiempo de vuelo (TOF) tres meses después de la inducción del aneurisma para evaluar la formación de IA.
   1. Eutanasia de los ratones mediante exanguinación y luxación cervical después de la anestesia con isoflurano (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Detectar IA bajo un microscopio estereoscópico como se informó anteriormente¹⁷.
   2. Infundir las muestras con PBS enfriado, seguido de paraformaldehído al 4%, y luego Microfil para visualizar vasos y aneurismas.
   3. Definir un aneurisma como una protuberancia hacia afuera 1,5 veces más grande que la arteria madre, según lo observado por dos neurocirujanos independientes ^8,18.

3. Análisis histológicos e inmunohistoquímicos

1. Aísla los círculos de Willis bajo un microscopio. Fijar las muestras con paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 24 h¹⁹.
2. Procese las muestras en secciones de parafina y congeladas para la tinción histológica y de inmunofluorescencia. Teñir las secciones de parafina con las tinciones EVG y Masson de acuerdo con las instrucciones del fabricante¹⁹.
3. Incubar las secciones de parafina con una solución de bloqueo para minimizar la unión inespecífica.
4. Incubar secciones con anticuerpos primarios contra CD86 durante la noche a 4 °C. Después de la incubación con un anticuerpo secundario, desarrolla un color marrón al reaccionar las secciones con DAB²⁰.
5. Realizar la contratinción con hematoxilina y montar las secciones con una solución de montaje acuosa²⁰.

Resultados

Tasa de formación de IA
En el grupo experimental (n = 15), 2 ratones murieron dentro de la primera semana después del procedimiento inicial por razones desconocidas. Un ratón murió de una infección en la herida posterior al tercer día después del segundo procedimiento, y otro ratón murió el día 38 por razones desconocidas, sin que se detectaran aneurismas. En el grupo de control (n = 5), los 5 ratones sobrevivieron hasta el sacrificio. Entre los ratones supe...

Discusión

Este estudio presenta un enfoque modificado para la construcción de un modelo murino de IA a través de la ligadura de la PPA para inducir cambios hemodinámicos aditivos en combinación con la hipertensión. Las imágenes de resonancia magnética y el análisis microscópico demostraron cambios significativos en los aneurismas en el círculo de Willis. Las alteraciones patológicas observadas en este modelo son consistentes con las encontradas en muestras humanas. Este modelo de ratón...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
7.0 T magnetic resonance angiography	Bruker	BioSpec 70/20
C57BL/6 mice	Charles River Laboratories		sex: male
CD86 antibody	CST	91882
Elastic Van Gieson (EVG)stain	Solarbio	G1597
Masson	Solarbio	G1340
Micro forcep	Shanghai Jinzhong Instrument Company
Microfil	Flow Tech Inc.	MV-120
Small animal anesthesia machine	RWD	R500
Stereo microscope	Shanghai Optical Instrument Company	XYH-6B
Suture	Shanghai Jinhuan Medical Company		6-0, 8-0