Un modello murino modificato di aneurisma intracranico basato sul cambiamento emodinamico e sull'ipertensione

Riepilogo

L'aneurisma intracranico (IA) è stato costruito nei topi utilizzando i fattori di rischio di ipertensione e cambiamenti emodinamici. I cambiamenti emodinamici sono stati indotti legando i rami dell'arteria carotide, mentre l'ipertensione è stata ottenuta legando i rami posteriori dell'arteria renale. La formazione di IA è stata rilevata attraverso l'angiografia a risonanza magnetica, la stereomicroscopia e l'analisi patologica.

Abstract

L'aneurisma intracranico (IA) rappresenta un rischio significativo per la salute a causa della morbilità e della mortalità associate alla rottura dell'aneurisma. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo dell'IA rimangono poco chiari ed è necessario un modello murino adatto. Un modello murino di IA è stato stabilito legando l'arteria pterigopalatina (PPA) per indurre cambiamenti emodinamici additivi, combinati con l'induzione dell'ipertensione. Nei topi maschi C57BL/6, i vasi, tra cui la PPA destra, l'arteria carotide esterna (ECA), l'arteria occipitale (OcA) e l'arteria carotide comune controlaterale sinistra (CCA), sono stati legati per indurre cambiamenti emodinamici. Una settimana dopo, i rami posteriori bilaterali dell'arteria renale (pRA) sono stati legati ed è stata introdotta una dieta a base di sale all'8% per indurre l'ipertensione. L'angiografia a risonanza magnetica (MRA), la stereomicroscopia e la colorazione immunoistochimica (IHC) sono state eseguite per valutare i cambiamenti morfologici e patologici nell'IA tre mesi dopo l'induzione. Nel gruppo sperimentale, quattro topi sono morti dopo l'induzione iniziale. L'IA in diverse località è stata rilevata in cinque degli undici topi rimanenti. Sia l'esame microscopico che l'esame MRA hanno confermato la formazione di IA. Le analisi patologiche e IHC hanno rivelato l'interruzione della lamina elastica interna, la disconnessione delle fibre di collagene e l'infiltrazione dei macrofagi M1 CD86-positivi, risultati coerenti con quelli osservati nell'IA umana. Questo modello murino di IA replica i cambiamenti patologici osservati nei campioni umani e può servire come strumento prezioso per studiare i meccanismi molecolari della formazione e della progressione dell'IA.

Introduzione

La prevalenza dell'aneurisma intracranico (IA) è stimata al 3,2% della popolazione generale¹. L'IA rappresenta un rischio significativo per la salute a causa dell'elevata morbilità e mortalità associate. L'IA è una condizione patologica complessa e multidimensionale influenzata da alterazioni emodinamiche, infiammazione e rimodellamento vascolare ^2,3. I cambiamenti emodinamici e l'ipertensione sono implicati nella formazione e nella progressione degli aneurismi ^4,5. L'IA si verifica frequentemente nelle biforcazioni cerebrali con elevato sforzo di taglio emodinamico⁶ e le biforcazioni con angoli stretti sono identificate come fattori di rischio per lo sviluppo dell'IA nell'uomo⁷. Nonostante i progressi nei trattamenti endovascolari e nelle strategie chirurgiche, l'emorragia subaracnoidea causata dalla rottura dell'IA rimane catastrofica. Pertanto, l'esplorazione di trattamenti farmacologici è un approccio promettente per prevenire la rottura dell'aneurisma⁸. Tuttavia, i meccanismi alla base della formazione patologica e della progressione dell'IA rimangono poco chiari. Lo sviluppo di un modello murino adatto per la formazione e la progressione dell'IA, basato sui fattori di rischio nell'uomo, è fondamentale per scoprire i meccanismi sottostanti e identificare potenziali bersagli terapeutici. Questo studio mira a costruire un modello di formazione di IA senza rottura in topi che imitano le caratteristiche dell'IA umana.

Il circolo di Willis (CW) collega e comunica l'arteria carotide interna destra (ICA), l'ICA sinistra e le arterie vertebrobasilari bilaterali. La CW funge da meccanismo di compensazione in caso di occlusione o stenosi dell'ICA o dell'arteria vertebrale⁹. L'arteria pterigopalatina (PPA) è una branca dell'ICA che fornisce sangue alla parte esterna del cervello¹⁰. Sulla base della funzione compensatoria della CW, l'occlusione PPA aumenta il flusso sanguigno nell'ICA. La combinazione della legatura dell'arteria carotide comune sinistra (CCA), dell'arteria carotide esterna destra (ECA) e dell'arteria occipitale (OcA) provoca un aumento del flusso sanguigno nella CW, in particolare ad angoli ristretti, portando a cambiamenti emodinamici. In questo modello, l'afflusso di sangue al cervello è supportato dall'arteria vertebrobasilare e dall'ICA destro. La legatura PPA non ha contribuito alla mortalità nei topi¹¹.

Per indurre un modello di IA basato sull'iniezione di elastasi, l'ipertensione è stata indotta dal rilascio di angiotensina-II (Ang-II) tramite una pompa Alzet o un sale^12,13 di desossicorticosterone acetato (DOCA). L'alto costo di Alzet e DOCA dovrebbe essere considerato negli esperimenti che coinvolgono un gran numero di animali. I livelli di ipertensione raggiunti non erano significativamente diversi tra la legatura dei rami posteriori e inferiori delle arterie renali bilaterali o solo i rami posteriori delle arterie renali bilaterali. Tuttavia, il primo approccio ha portato a una maggiore disfunzione renale¹⁴. Pertanto, la legatura delle arterie renali posteriori bilaterali (pRA) è considerata un metodo razionale per la maggior parte dei ricercatori.

L'elastasi è stata iniettata nel liquido cerebrospinale nella cisterna basale destra tramite una singola iniezione stereotassica¹². Il modello IA basato sull'iniezione di elastasi ha causato una rottura dell'IA del 60%-80% tre settimane dopo l'iniezione^15,16, che è troppo breve per studiare la formazione e lo sviluppo dell'IA. Inoltre, non ci sono prove che suggeriscano livelli elevati di elastasi nell'uomo durante la formazione di IA. Inoltre, l'iniezione stereotassica nella cisterna destra è associata a un'elevata mortalità e disabilità nei topi, ponendo sfide significative per i principianti.

In questo studio, è stato costruito un modello murino di IA senza rottura entro tre mesi sulla base di fattori di rischio nell'uomo. Questo modello elimina l'alto costo associato a DOCA e Alzet. Inoltre, può essere eseguito utilizzando solo uno stereomicroscopio e può essere facilmente padroneggiato dai principianti.

Protocollo

Tutte le procedure operative nei topi hanno aderito ai criteri del Comitato di revisione etica e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università Jiaotong di Shanghai. I topi maschi C57BL/6 (8 settimane di età, 20-25 g) sono stati alloggiati a una temperatura di 22 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore. Il processo operativo è illustrato nella Figura 1A. In breve, negli animali anestetizzati, l'arteria carotide comune sinistra (CCA), l'arteria carotide esterna destra (ECA), l'arteria occipitale (OcA) e l'arteria pterigopalatina (PPA) sono state legate per indurre cambiamenti emodinamici. L'ipertensione è stata successivamente indotta legando le arterie renali bilaterali (bRA) una settimana dopo l'inizio dei cambiamenti emodinamici e gli animali sono stati alimentati con una dieta contenente l'8% di sale. I cambiamenti emodinamici e la formazione di IA sono illustrati nella Figura 1B. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Determinazione dell'UIA murino basata sulle alterazioni emodinamiche e sull'ipertensione

NOTA: I topi sono stati digiunati per 12 ore prima dell'operazione. Gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati immergendoli in alcol al 70% per almeno 30 minuti.

1. Somministrare l'anestesia (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) utilizzando una macchina per anestesia per piccoli animali con inalazione di isoflurano al 2% in una miscela di O₂ (1 L/min) su un tampone riscaldato mantenuto a 37 °C.
2. Contenzioso il CCA sinistro
   1. Praticare un'incisione lineare di 1 cm lungo la linea mediana cervicale. Sezionare il tessuto sottocutaneo e il platisma per esporre la trachea.
   2. Estrarre la vena giugulare e individuare la guaina carotidea lungo la trachea (Figura 2A i,ii). Separare il CCA sinistro dal nervo vago. Legare il CCA sinistro con una sutura di seta 6-0 (Figura 2A iii,iv).
3. Contestare l'ECA e l'OcA corretti
   1. Esporre la struttura anatomica del CCA, ICA, ECA, OcA, nervo vago e nervo ipoglosso sul lato destro. Legare l'ECA destro con una sutura di seta 6-0 (Figura 2A iii,iv).
   2. Isolare l'OcA e ligarla con un 8-0 sutura di seta (Figura 2A v - viii). Scollegare l'OcA utilizzando due micro pinze diritte.
      NOTA: L'OcA, che nasce prossimalmente dall'ECA, si trova al di sotto del nervo ipoglosso (Figura 2A v - viii). La dissezione dell'OcA aiuta a esporre efficacemente l'anatomia della PPA.
4. Contesta il PPA giusto
   1. Isolare il nervo ipoglosso dall'ICA. Posizionare del cotone chirurgico tra il nervo ipoglosso e l'ICA per proteggere il nervo da lesioni correlate alla procedura.
   2. Sezionare il tessuto perivascolare attorno alla PPA utilizzando una micropinza. Clamp il PPA e tirarlo temporaneamente verso l'alto leggermente. Piazzare un 8-0 sutura di seta tra il PPA e l'ICA per legare il PPA (Figura 2A ix,x).
   3. Legare la PPA e mantenere una distanza sufficiente tra il sito di legatura e l'origine della PPA per garantire il flusso sanguigno nel cerchio di Willis (Figura 2A x).
      NOTA: La sfida principale in questa fase è legare la PPA all'interno di uno spazio operatorio estremamente ristretto senza compromettere i nervi periferici e le strutture vascolari. Evitare di comprimere la trachea durante l'esposizione alla PPA.
5. Finalizzare l'operazione
   1. Sterilizzare il campo operatorio con iodio povidone e suturare la ferita. Monitora i topi fino a quando non si riprendono dall'anestesia.
6. Indurre l'ipertensione
   1. Praticare un'incisione della linea mediana lunga 2 cm al 12^° livello vertebrale sulla schiena. Taglia i muscoli dorsali per esporre il rene. Bloccare il tessuto adiposo attorno al rene con una pinza e fissare il rene all'interno dell'incisione muscolare (Figura 2B i,ii).
   2. Isolare il tessuto adiposo attorno al peduncolo renale. Identificare il pRA a stretto contatto con la vena renale (Figura 2B iii,iv). Bloccare il pRA e tirarlo verso l'alto utilizzando una micro pinza diritta. Sezionare la fascia tra il pRA e la vena renale utilizzando un'altra micro pinza (Figura 2B v,vi).
      NOTA: Prestare attenzione per prevenire danni alla vena renale, che potrebbero portare a sanguinamento catastrofico.
   3. Legare il pRA con una sutura di seta 6-0 (Figura 2B vii,viii). Subito dopo la legatura, osservare la formazione di focolai ischemici nella parte superiore del rene (Figura 2B ix,x). Sutura il muscolo e le incisioni cutanee.

2. Esame IA tramite MRA e stereomicroscopio

1. Eseguire l'angiografia a risonanza magnetica (MRA) a tempo di volo (TOF) 7.0 T tre mesi dopo l'induzione dell'aneurisma per valutare la formazione di IA.
   1. Eutanasia dei topi tramite dissanguamento e lussazione cervicale dopo anestesia con isoflurano (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Rilevare l'IA con uno stereomicroscopio come precedentemente riportato¹⁷.
   2. Infondere i campioni con PBS raffreddato, seguito da paraformaldeide al 4%, quindi Microfil per visualizzare vasi e aneurismi.
   3. Definisci un aneurisma come un rigonfiamento verso l'esterno 1,5 volte più grande dell'arteria madre, come osservato da due neurochirurghi indipendenti ^8,18.

3. Analisi istologiche e immunoistochimiche

1. Isolare i cerchi di Willis al microscopio. Fissare i campioni con paraformaldeide al 4% a 4 °C per 24 h¹⁹.
2. Processare i campioni in sezioni di paraffina e congelate per la colorazione istologica e in immunofluorescenza. Colorare le sezioni di paraffina con coloranti EVG e Masson secondo le istruzioni del produttore¹⁹.
3. Incubare le sezioni di paraffina con una soluzione bloccante per ridurre al minimo il legame aspecifico.
4. Incubare le sezioni con anticorpi primari contro CD86 per una notte a 4 °C. Dopo l'incubazione con un anticorpo secondario, sviluppare un colore marrone facendo reagire le sezioni con DAB²⁰.
5. Eseguire la controcolorazione con ematossilina e montare le sezioni con una soluzione di montaggio acquosa²⁰.

Risultati

Tasso di formazione di IA
Nel gruppo sperimentale (n = 15), 2 topi sono morti entro la prima settimana dopo la procedura iniziale per ragioni sconosciute. Un topo è morto per un'infezione nella ferita alla schiena il terzo giorno dopo la seconda procedura e un altro topo è morto il giorno 38 per ragioni sconosciute, senza che siano stati rilevati aneurismi. Nel gruppo di controllo (n = 5), tutti e 5 i topi sono sopravvissuti fino al sacrificio. Tra i topi sopravviss...

Discussione

Questo studio presenta un approccio modificato alla costruzione di un modello murino di IA attraverso la legatura della PPA per indurre cambiamenti emodinamici additivi in combinazione con l'ipertensione. L'imaging MRA e l'analisi microscopica hanno dimostrato cambiamenti significativi nell'aneurisma nel cerchio di Willis. Le alterazioni patologiche osservate in questo modello sono coerenti con quelle riscontrate nei campioni umani. Questo modello murino può servire come strumento prezi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
7.0 T magnetic resonance angiography	Bruker	BioSpec 70/20
C57BL/6 mice	Charles River Laboratories		sex: male
CD86 antibody	CST	91882
Elastic Van Gieson (EVG)stain	Solarbio	G1597
Masson	Solarbio	G1340
Micro forcep	Shanghai Jinzhong Instrument Company
Microfil	Flow Tech Inc.	MV-120
Small animal anesthesia machine	RWD	R500
Stereo microscope	Shanghai Optical Instrument Company	XYH-6B
Suture	Shanghai Jinhuan Medical Company		6-0, 8-0