Un modèle murin modifié d’anévrisme intracrânien basé sur le changement hémodynamique et l’hypertension

Résumé

L’anévrisme intracrânien (AI) a été construit chez la souris en utilisant les facteurs de risque d’hypertension et de changements hémodynamiques. Les changements hémodynamiques ont été induits par la ligature des branches de l’artère carotide, tandis que l’hypertension a été obtenue par la ligature des branches postérieures de l’artère rénale. La formation d’IA a été détectée par angiographie par résonance magnétique, stéréomicroscopie et analyse pathologique.

Résumé

L’anévrisme intracrânien (AI) présente un risque important pour la santé en raison de la morbidité et de la mortalité associées à la rupture d’anévrisme. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement de l’IA restent incertains, et un modèle murin approprié est nécessaire. Un modèle murin d’IA a été établi en ligaturant l’artère ptérygo-palatine (PPA) pour induire des changements hémodynamiques additifs, combinés à l’induction de l’hypertension. Chez les souris mâles C57BL/6, les vaisseaux, y compris l’APP droite, l’artère carotide externe (ECA), l’artère occipitale (OcA) et l’artère carotide commune controlatérale gauche (CCA), ont été ligaturés pour induire des changements hémodynamiques. Une semaine plus tard, les branches postérieures bilatérales de l’artère rénale (pRA) ont été ligaturées et un régime à 8 % de sel a été introduit pour induire l’hypertension. Une angiographie par résonance magnétique (ARM), une stéréomicroscopie et une coloration immunohistochimique (IHC) ont été réalisées pour évaluer les changements morphologiques et pathologiques de l’IA trois mois après l’induction. Dans le groupe expérimental, quatre souris sont mortes après l’induction initiale. L’IA à différents endroits a été détectée chez cinq des onze souris restantes. Les examens microscopiques et ARM ont confirmé la formation d’IA. Les analyses pathologiques et IHC ont révélé une perturbation de la lame élastique interne, une déconnexion des fibres de collagène et une infiltration de macrophages M1 CD86-positifs , des résultats cohérents avec ceux observés dans l’IA humaine. Ce modèle murin d’IA reproduit les changements pathologiques observés dans les échantillons humains et peut servir d’outil précieux pour étudier les mécanismes moléculaires de la formation et de la progression de l’IA.

Introduction

La prévalence de l’anévrisme intracrânien (AI) est estimée à 3,2 % de la population générale¹. L’AI pose un risque important pour la santé en raison de la morbidité et de la mortalité élevées qui y sont associées. L’IA est une affection pathologique complexe et multidimensionnelle influencée par des changements hémodynamiques, une inflammation et un^{remodelage vasculaire2,3}. Les modifications hémodynamiques et l’hypertension sont impliquées dans la formation et la progression des anévrismes ^4,5. L’IA se produit fréquemment au niveau des bifurcations cérébrales avec une contrainte de cisaillement hémodynamique élevée⁶, et les bifurcations avec des angles étroits sont identifiées comme des facteurs de risque pour le développement de l’IA chez l’homme⁷. Malgré les progrès réalisés dans les traitements endovasculaires et les stratégies chirurgicales, l’hémorragie sous-arachnoïdienne causée par la rupture de l’IA reste catastrophique. Par conséquent, l’exploration de traitements pharmacologiques est une approche prometteuse pour prévenir la rupture d’anévrisme⁸. Cependant, les mécanismes sous-jacents à la formation pathologique et à la progression de l’IA restent incertains. Le développement d’un modèle murin approprié pour la formation et la progression de l’AI, basé sur les facteurs de risque humains, est crucial pour découvrir les mécanismes sous-jacents et identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Cette étude vise à construire un modèle de formation d’IA sans rupture chez la souris qui imite les caractéristiques humaines de l’IA.

Le cercle de Willis (CW) relie et communique l’artère carotide interne droite (ICA), l’ICA gauche et les artères vertébrobasilaires bilatérales. La CW sert de mécanisme compensatoire en cas d’occlusion ou de sténose de l’ICA ou de l’artère vertébrale⁹. L’artère ptérygo-palatine (PPA) est une branche de l’ICA qui fournit du sang à la partie externe du cerveau¹⁰. Sur la base de la fonction compensatoire de la CW, l’occlusion de la PPA augmente le flux sanguin dans l’ICA. La combinaison de la ligature de l’artère carotide commune gauche (ACC), de l’artère carotide externe droite (ECA) et de l’artère occipitale (OcA) entraîne une augmentation du flux sanguin dans la CW, en particulier aux angles rétrécis, entraînant des changements hémodynamiques. Dans ce modèle, l’apport sanguin au cerveau est soutenu par l’artère vertébrobasilaire et l’ICA droite. La ligature de l’APP n’a pas contribué à la mortalité chez les souris¹¹.

Pour induire un modèle IA basé sur l’injection d’élastase, l’hypertension a été induite par la libération d’angiotensine-II (Ang-II) via une pompe Alzet ou un sel d’acétate de désoxycorticostérone (DOCA)^12,13. Le coût élevé d’Alzet et de DOCA doit être pris en compte dans les expériences impliquant un grand nombre d’animaux. Les niveaux d’hypertension atteints n’étaient pas significativement différents entre la ligature des branches postérieure et inférieure des artères rénales bilatérales ou seulement les branches postérieures des artères rénales bilatérales. Cependant, la première approche a entraîné une augmentation de la dysfonction rénale¹⁴. Par conséquent, la ligature des artères rénales postérieures bilatérales (pRA) est considérée comme une méthode rationnelle pour la plupart des investigateurs.

L’élastase a été injecté dans le liquide céphalo-rachidien au niveau de la citerne basale droite par une seule injection stéréotaxique¹². Le modèle IA basé sur l’injection d’élastase a provoqué une rupture de 60 à 80 % de l’IA trois semaines après l’injection^15,16, ce qui est trop court pour étudier la formation et le développement de l’IA. De plus, il n’y a aucune preuve suggérant des niveaux élevés d’élastase chez l’homme pendant la formation de l’AI. De plus, l’injection stéréotaxique dans la citerne droite est associée à une mortalité et à une invalidité élevées chez les souris, ce qui pose des défis importants aux novices.

Dans cette étude, un modèle murin d’AI sans rupture dans les trois mois a été construit sur la base de facteurs de risque humains. Ce modèle élimine le coût élevé associé à DOCA et Alzet. De plus, il peut être réalisé à l’aide d’un stéréomicroscope uniquement et peut être facilement maîtrisé par les novices.

Protocole

Toutes les procédures opérationnelles chez la souris ont adhéré aux critères du comité d’examen éthique et ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Jiaotong de Shanghai. Des souris mâles C57BL/6 (âgées de 8 semaines, 20-25 g) ont été logées à une température de 22 °C avec un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h. Le processus opérationnel est illustré à la figure 1A. En bref, chez les animaux anesthésiés, l’artère carotide commune gauche (ACC), l’artère carotide externe droite (ECA), l’artère occipitale (OcA) et l’artère ptérygo-palatine (PPA) ont été ligaturées pour induire des changements hémodynamiques. L’hypertension a ensuite été induite par la ligature des artères rénales bilatérales (artères rénales bilatérales) une semaine après le début des changements hémodynamiques, et les animaux ont été nourris avec un régime contenant 8 % de sel. Les changements hémodynamiques et la formation d’IA sont représentés à la figure 1B. Des détails sur les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont fournis dans la table des matériaux.

1. Etablissement de l’AIU de souris basé sur les modifications hémodynamiques et l’hypertension

REMARQUE : Les souris ont été jeûnées pendant 12 h avant l’opération. Les instruments chirurgicaux ont été stérilisés en les trempant dans de l’alcool à 70 % pendant au moins 30 min.

1. Administrer l’anesthésie (conformément aux protocoles approuvés par l’établissement) à l’aide d’un appareil d’anesthésie pour petits animaux avec inhalation d’isoflurane à 2 % dans un mélange_d’O2 (1 L/min) sur un coussin chauffant maintenu à 37 °C.
2. Plaider le CCA gauche
   1. Faites une incision linéaire de 1 cm le long de la ligne médiane cervicale. Disséquer le tissu sous-cutané et le platysma pour exposer la trachée.
   2. Retirez la veine jugulaire et localisez la gaine carotidienne le long de la trachée (Figure 2A i,ii). Séparez l’ACC gauche du nerf vague. Lister l’ACC gauche avec une suture en soie 6-0 (Figure 2A iii,iv).
3. Plaidez pour l’ECA et l’OcA appropriés
   1. Exposez la structure anatomique de l’ACC, de l’ICA, de l’ECA, de l’OcA, du nerf vague et du nerf hypoglosse du côté droit. Lister l’ECA droit avec une suture en soie 6-0 (Figure 2A iii,iv).
   2. Isolez l’OcA et ligaturez-le avec un 8-0 suture en soie (figure 2A v - viii). Débranchez l’OcA à l’aide de deux micro-pinces droites.
      REMARQUE : L’OcA, qui naît proximale de l’ECA, se trouve sous le nerf hypoglosse (Figure 2A v - viii). La dissection de l’OcA permet d’exposer efficacement l’anatomie de l’APP.
4. Plaidez le bon PPA
   1. Isolez le nerf hypoglosse de l’ICA. Placez du coton chirurgical entre le nerf hypoglosse et l’ICA pour protéger le nerf des blessures liées à l’intervention.
   2. Disséquez le tissu périvasculaire autour de l’APP à l’aide d’une micropince. Serrez le PPA et tirez-le temporairement vers le haut légèrement. Placez un 8-0 suture en soie entre le PPA et l’ICA pour ligaturer le PPA (Figure 2A ix,x).
   3. Lister l’APP et maintenir une distance suffisante entre le site de ligature et l’origine de l’APP pour assurer la circulation sanguine dans le cercle de Willis (Figure 2A x).
      REMARQUE : Le principal défi de cette étape est de ligaturer le PPA dans un espace opératoire extrêmement restreint sans altérer les nerfs périphériques et les structures vasculaires. Évitez de comprimer la trachée pendant l’exposition au PPA.
5. Finaliser l’opération
   1. Stérilisez le champ opératoire avec de la povidone iodée et suturez la plaie. Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles se remettent de l’anesthésie.
6. Induire l’hypertension
   1. Faites une incision médiane de 2 cm de long au niveau vertébral du 12^e sur le dos. Coupez les muscles dorsaux pour exposer le rein. Clampez le tissu adipeux autour du rein à l’aide d’une pince et fixez le rein à l’intérieur de l’incision musculaire (Figure 2B i,ii).
   2. Isolez le tissu adipeux autour du pédicule rénal. Identifier l’ARP en contact étroit avec la veine rénale (Figure 2B iii,iv). Serrez le pRA et tirez-le vers le haut à l’aide d’une micro-pince droite. Disséquez le fascia entre l’AP et la veine rénale à l’aide d’une autre micro-pince (Figure 2B v,vi).
      REMARQUE : Faites preuve de prudence pour éviter d’endommager la veine rénale, ce qui pourrait entraîner des saignements catastrophiques.
   3. Lister le pRA avec une suture en soie 6-0 (Figure 2B vii,viii). Immédiatement après la ligature, observez la formation de foyers ischémiques dans la partie supérieure du rein (Figure 2B ix,x). Suturez les incisions musculaires et cutanées.

2. Examen IA par ARM et stéréomicroscope

1. Effectuer une angiographie par résonance magnétique (ARM) à temps de vol (TOF) de 7,0 T trois mois après l’induction de l’anévrisme pour évaluer la formation de l’IA.
   1. Euthanasier les souris par exsanguination et luxation cervicale après une anesthésie à l’isoflurane (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Détection de l’IA au stéréomicroscope, comme indiqué précédemment¹⁷.
   2. Infusez les échantillons avec du PBS refroidi, suivi de 4 % de paraformaldéhyde, puis de Microfil pour visualiser les vaisseaux et les anévrismes.
   3. Définir un anévrisme comme un renflement vers l’extérieur 1,5 fois plus grand que l’artère mère, comme observé par deux neurochirurgiens indépendants ^8,18.

3. Analyses histologiques et immunohistochimiques

1. Isolez les cercles de Willis au microscope. Fixer les échantillons avec 4 % de paraformaldéhyde à 4 °C pendant 24 h¹⁹.
2. Transformez les échantillons en paraffine et en coupes congelées pour la coloration histologique et par immunofluorescence. Teindre les sections de paraffine avec des colorants EVG et Masson selon les instructions du fabricant¹⁹.
3. Incuber les sections de paraffine avec une solution de blocage pour minimiser la liaison non spécifique.
4. Incuber des sections avec des anticorps primaires contre CD86 pendant la nuit à 4 °C. Après incubation avec un anticorps secondaire, développer une couleur brune en faisant réagir les sections avec du DAB²⁰.
5. Effectuez une contre-coloration à l’hématoxyline et montez les sections avec une solution de montage aqueuse²⁰.

Résultats

Taux de formation d’IA
Dans le groupe expérimental (n = 15), 2 souris sont mortes dans la première semaine après la procédure initiale pour des raisons inconnues. Une souris est morte d’une infection dans la plaie dorsale le troisième jour après la deuxième procédure, et une autre souris est morte le 38e jour pour des raisons inconnues, sans qu’aucun anévrisme n’ait été détecté. Dans le groupe témoin (n = 5), les 5 souris ont survécu jusqu’au ...

Discussion

Cette étude présente une approche modifiée de la construction d’un modèle murin d’IA par ligature du PPA pour induire des changements hémodynamiques additifs en combinaison avec l’hypertension. L’imagerie par IRM et l’analyse microscopique ont révélé des changements anévrismaux significatifs dans le cercle de Willis. Les altérations pathologiques observées dans ce modèle sont cohérentes avec celles trouvées dans les échantillons humains. Ce modèle murin peut ser...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
7.0 T magnetic resonance angiography	Bruker	BioSpec 70/20
C57BL/6 mice	Charles River Laboratories		sex: male
CD86 antibody	CST	91882
Elastic Van Gieson (EVG)stain	Solarbio	G1597
Masson	Solarbio	G1340
Micro forcep	Shanghai Jinzhong Instrument Company
Microfil	Flow Tech Inc.	MV-120
Small animal anesthesia machine	RWD	R500
Stereo microscope	Shanghai Optical Instrument Company	XYH-6B
Suture	Shanghai Jinhuan Medical Company		6-0, 8-0