АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Внутричерепная аневризма (ИА) была построена у мышей с использованием факторов риска гипертензии и гемодинамических изменений. Гемодинамические изменения индуцировались лигированием ветвей сонной артерии, в то время как гипертензия достигалась лигированием задних ветвей почечной артерии. Образование ИА выявляли с помощью магнитно-резонансной ангиографии, стереомикроскопии и патологоанатомического анализа.

Аннотация

Внутричерепная аневризма (ИА) представляет значительный риск для здоровья из-за заболеваемости и смертности, связанных с разрывом аневризмы. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе развития IA, остаются неясными, и требуется подходящая мышиная модель. Мышиная модель ИА была создана путем лигирования крыло-нёбной артерии (ППА) для индуцирования аддитивных гемодинамических изменений в сочетании с индукцией гипертензии. У самцов мышей C57BL/6 сосуды, включая правую PPA, наружную сонную артерию (ECA), затылочную артерию (OcA) и левую контралатеральную общую сонную артерию (CCA), лигировали для индуцирования гемодинамических изменений. Через неделю двусторонние задние ветви почечной артерии (пРА) были перевязаны, и была введена диета с 8% солью, чтобы вызвать гипертензию. Магнитно-резонансная ангиография (МРА), стереомикроскопия и иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание были выполнены для оценки морфологических и патологических изменений ИА через три месяца после индукции. В экспериментальной группе четыре мыши умерли после первоначальной индукции. IA в разных местах была обнаружена у пяти из одиннадцати оставшихся мышей. Как микроскопическое, так и MRA исследование подтвердили образование IA. Патологоанатомический анализ и анализ ИГХ выявили нарушение внутренней эластической пластинки, разъединение коллагеновых волокон и инфильтрацию CD86-положительных макрофагов M1, что согласуется с теми, которые наблюдаются при ИА человека. Эта мышиная модель IA воспроизводит патологические изменения, наблюдаемые в образцах человека, и может служить ценным инструментом для исследования молекулярных механизмов образования и прогрессирования IA.

Введение

Распространенность внутричерепной аневризмы (ИА) оценивается в 3,2% от общей популяции1. ИА представляет значительный риск для здоровья из-за связанной с ним высокой заболеваемости и смертности. ИА является сложным и многомерным патологическим состоянием, на которое влияют гемодинамические изменения, воспаление и ремоделирование сосудов 2,3. Гемодинамические изменения и гипертензия участвуют в формировании и прогрессировании аневризм 4,5. IA часто возникает при бифуркациях головного мозга с повышенным гемодинамическим напряжением сдвига6, а бифуркации с узкими углами определены как факторы риска развития IA у человека7. Несмотря на достижения в области эндоваскулярного лечения и хирургических стратегий, субарахноидальное кровоизлияние, вызванное разрывом IA, остается катастрофическим. Таким образом, изучение фармакологических методов лечения является перспективным подходом к предотвращению разрыва аневризмы8. Однако механизмы, лежащие в основе патологического формирования и прогрессирования ИА, остаются неясными. Разработка подходящей мышиной модели формирования и прогрессирования ИА, основанной на факторах риска человека, имеет решающее значение для раскрытия основных механизмов и определения потенциальных терапевтических мишеней. Данное исследование направлено на построение модели формирования IA без разрыва у мышей, имитирующих характеристики IA человека.

Виллизиева круг (CW) соединяет и сообщает правую внутреннюю сонную артерию (ICA), левую ICA, а также двусторонние вертебробазилярные артерии. ХО служит компенсаторным механизмом в случаях окклюзии или стеноза ВСА или позвоночной артерии9. Крыловидная артерия (ППА) является ветвью ВСА, которая снабжает кровью внешнюю часть мозга10. Основываясь на компенсаторной функции CW, окклюзия PPA увеличивает кровоток в ICA. Комбинированное лигирование левой общей сонной артерии (ОСА), правой наружной сонной артерии (ОСА) и затылочной артерии (ОкА) приводит к увеличению кровотока в ХО, особенно при суженных углах, что приводит к гемодинамическим изменениям. В этой модели кровоснабжение мозга поддерживается вертебробазилярной артерией и правой ВСА. Лигирование ППА не способствовало смертности у мышей11.

Для индуцирования модели IA, основанной на инъекции эластазы, артериальную гипертензию индуцировали высвобождением ангиотензина-II (Ang-II) через насос Alzet или соль дезоксикортикостерона ацетата (DOCA)12,13. Высокую стоимость Alzet и DOCA следует учитывать в экспериментах с участием большого количества животных. Достигнутые уровни артериальной гипертензии достоверно не различались между лигированием задней и нижней ветвей двусторонних почечных артерий или только задних ветвей двусторонних почечных артерий. Однако первый подход приводил к большей почечной дисфункции14. Таким образом, лигирование двусторонних задних почечных артерий (пРА) считается рациональным методом для большинства исследователей.

Эластаза вводилась в спинномозговую жидкость в правой базальной цистерне путем однократной стереотаксической инъекции12. Модель IA на основе инъекции эластазы вызвала разрыв IA на 60%-80% через три недели после инъекции15,16, что слишком мало для изучения формирования и развития IA. Кроме того, нет никаких доказательств того, что у человека возникал повышенный уровень эластазы во время формирования IA. Кроме того, стереотаксическая инъекция в правый резервуар связана с высокой смертностью и инвалидностью у мышей, что создает значительные проблемы для новичков.

В этом исследовании мышиная модель ИА без разрыва в течение трех месяцев была построена на основе факторов риска человека. Эта модель устраняет высокую стоимость, связанную с DOCA и Alzet. Более того, она может быть выполнена с помощью только стереомикроскопа и может быть легко освоена новичками.

протокол

Все операционные процедуры на мышах соответствовали критериям Комитета по этической экспертизе и были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Шанхайского университета Цзяотун. Мышей-самцов C57BL/6 (в возрасте 8 недель, 20-25 г) содержали при температуре 22 °C с циклом свет/темнота 12 ч/12 ч. Рабочий процесс показан на рисунке 1А. Короче говоря, у животных, находящихся под наркозом, левая общая сонная артерия (ОСА), правая наружная сонная артерия (ХКА), затылочная артерия (OcA) и крыло-небная артерия (ППА) были перевязаны для индуцирования гемодинамических изменений. Впоследствии гипертензию индуцировали путем перевязки двусторонних почечных артерий (bRA) через неделю после начала гемодинамических изменений, и животных кормили диетой, содержащей 8% соли. Гемодинамические изменения и образование IA изображены на рисунке 1В. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

1. Установление МАУ у мышей на основе гемодинамических изменений и гипертонической болезни

Примечание: Мышей голодали в течение 12 ч перед операцией. Хирургические инструменты стерилизовали путем замачивания их в 70% спирте не менее чем на 30 минут.

  1. Введение анестезии (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) с использованием аппарата для анестезии мелких животных с ингаляцией 2% изофлурана в смесиО2 (1 л/мин) на нагреваемой прокладке при температуре 37 °С.
  2. Лигеть левый CCA
    1. Сделайте линейный разрез на 1 см по средней линии шеи. Рассеките подкожную клетчатку и платизму, чтобы обнажить трахею.
    2. Оттяните яремную вену в сторону и расположите влагалище сонной артерии вдоль трахеи (рис. 2A i,ii). Отделите левый ОСА от блуждающего нерва. Перевязать левый CCA шелковым швом 6-0 (Рисунок 2A iii, iv).
  3. Легирование правильных ECA и OcA
    1. Обнажите анатомическое строение CCA, ICA, ECA, OcA, блуждающего нерва и подъязычного нерва с правой стороны. Перевязать правую ЭКА шелковым швом 6-0 (Рисунок 2A iii, iv).
    2. Изолируйте OcA и разделите его с помощью 8-0 шелковый шов (Рисунок 2A v - viii). Отсоедините OcA с помощью двух прямых микрощипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: OcA, возникающая проксимально от ECA, находится ниже подъязычного нерва (Рисунок 2A, v - viii). Препарирование OcA помогает эффективно выявить анатомию PPA.
  4. Лигировать правильный PPA
    1. Изолируйте подъязычный нерв от ВСА. Поместите хирургическую вату между подъязычным нервом и ВСА, чтобы защитить нерв от травм, связанных с процедурой.
    2. Рассеките периваскулярную ткань вокруг ППА с помощью микрощипцов. Зажмите PPA и временно слегка потяните его вверх. Ставка 8-0 шелковый шов между PPA и ICA для лигатирования PPA (рис. 2A ix,x).
    3. Перевязывайте ППА и поддерживайте достаточное расстояние между местом лигирования и началом ППА для обеспечения кровотока в Виллисовом круге (Рисунок 2А х).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основной проблемой на этом этапе является лигирование ППА в чрезвычайно узком операционном пространстве без повреждения периферических нервов и сосудистых структур. Избегайте сдавливания трахеи во время воздействия ППА.
  5. Завершите операцию
    1. Простерилизовать операционное поле повидон-йодом и зашить рану. Наблюдайте за мышами до тех пор, пока они не оправятся от анестезии.
  6. Вызвать гипертонию
    1. Сделайте разрез по средней линии длиной 2 см на12-м уровне позвонков на спине. Разрежьте спинные мышцы, чтобы обнажить почку. Зажмите жировую ткань вокруг почки с помощью щипцов и зафиксируйте почку внутри мышечного разреза (рисунок 2B i,ii).
    2. Изолируйте жировую ткань вокруг ножки почки. Определите рРА в тесном контакте с почечной веной (рис. 2B iii, iv). Зажмите pRA и подтяните его вверх с помощью прямых микрощипцов. Рассеките фасцию между пРА и почечной веной с помощью других микрощипцов (рис. 2B v,vi).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность, чтобы предотвратить повреждение почечной вены, которое может привести к катастрофическому кровотечению.
    3. Лигать pRA с помощью шелкового шовного материала 6-0 (Рисунок 2B vii, viii). Сразу после лигирования наблюдайте образование ишемических очагов в верхней части почки (рисунок 2В ix,x). Зашивайте разрезы мышц и кожи.

2. Исследование ИА с помощью МРА и стереомикроскопа

  1. Проведите времяпролетную магнитно-резонансную ангиографию (МРА) магнитно-резонансной томографии (МРА) 7,0 Тл через три месяца после индукции аневризмы для оценки формирования IA.
    1. Усыпляйте мышей путем обескровливания и вывиха шейки матки после анестезии изофлураном (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Обнаружение IA под стереомикроскопом, как сообщалось ранее17.
    2. Введите в образцы охлажденный PBS, затем 4% параформальдегид, а затем микрофил для визуализации сосудов и аневризм.
    3. Определите аневризму как выпячивающуюся наружу в 1,5 раза больше, чем исходная артерия, как наблюдают два независимых нейрохирурга 8,18.

3. Гистологические и иммуногистохимические анализы

  1. Изолируйте круги Виллиса под микроскопом. Зафиксируйте образцы с 4% параформальдегидом при температуре 4 °C в течение 24 ч19.
  2. Обрабатывайте образцы в парафиновые и замороженные срезы для гистологического и иммунофлуоресцентного окрашивания. Окрашивание парафиновых срезов пятнами EVG и Masson в соответствии с инструкциями производителя19.
  3. Инкубируйте парафиновые срезы с помощью блокирующего раствора, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание.
  4. Инкубируйте секции с первичными антителами к CD86 в течение ночи при 4 °C. После инкубации со вторичным антителом разработайте коричневый цвет, реагируя на участки с DAB20.
  5. Выполнить противоокрашивание гематоксилином и смонтировать секции водным монтажным раствором20.

Результаты

Скорость формирования НМА
В опытной группе (n = 15) 2 мыши умерли в течение первой недели после первоначальной процедуры по неизвестным причинам. Одна мышь умерла от инфекции в ране спины на третий день после второй процедуры, а другая мышь умерла на 38-й день по ...

Обсуждение

В данном исследовании представлен модифицированный подход к построению мышиной модели ИА путем лигирования ППА для индуцирования аддитивных гемодинамических изменений в сочетании с артериальной гипертензией. Визуализация МРТ и микроскопический анализ показали з?...

Раскрытие информации

Рукопись прочитана и одобрена всеми названными авторами, при этом нет других лиц, удовлетворяющих критериям авторства, но не указанных в списке. У авторов нет конфликтов интересов, связанных с рукописью, и не было существенной финансовой поддержки этой работы, которая могла бы повлиять на ее результат. Спонсоры не участвовали в сборе данных, анализе данных или написании статей. Рукопись ранее не публиковалась в Интернете или в печатных изданиях, в том числе в журналах, на веб-сайтах или в блогах.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным институтом трансляционной медицины (Shanghai TMSK-2021-147), Шанхайским исследовательским проектом больницы Жэньцзи (RJTJ-QT-007) и Китайским фондом постдокторантуры (номер сертификата: 2024M760658).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
7.0 T magnetic resonance angiographyBrukerBioSpec 70/20 
C57BL/6 miceCharles River Laboratoriessex: male
CD86 antibodyCST91882
Elastic Van Gieson (EVG)stainSolarbioG1597
MassonSolarbioG1340
Micro forcepShanghai Jinzhong Instrument Company
MicrofilFlow Tech Inc.MV-120
Small animal anesthesia machine RWDR500
Stereo microscopeShanghai Optical Instrument CompanyXYH-6B
SutureShanghai Jinhuan Medical Company6-0, 8-0

Ссылки

  1. Vlak, M. H., Algra, A., Brandenburg, R., Rinkel, G. J. Prevalence of unruptured intracranial aneurysms, with emphasis on sex, age, comorbidity, country, and time period: A systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 10 (7), 626-636 (2011).
  2. Turjman, A. S., Turjman, F., Edelman, E. R. Role of fluid dynamics and inflammation in intracranial aneurysm formation. Circulation. 129 (3), 373-382 (2014).
  3. Shikata, F., et al. Potential influences of gut microbiota on the formation of intracranial aneurysm. Hypertension. 73 (2), 491-496 (2019).
  4. Penn, D. L., Komotar, R. J., Sander Connolly, E. Hemodynamic mechanisms underlying cerebral aneurysm pathogenesis. J Clin Neurosci. 18 (11), 1435-1438 (2011).
  5. Vlak, M. H., Rinkel, G. J., Greebe, P., Algra, A. Independent risk factors for intracranial aneurysms and their joint effect: A case-control study. Stroke. 44 (4), 984-987 (2013).
  6. Alfano, J., et al. Intracranial aneurysms occur more frequently at bifurcation sites that typically experience higher hemodynamic stresses. Neurosurgery. 73 (3), 497-505 (2013).
  7. Idil Soylu, A., Ozturk, M., Akan, H. Can vessel diameters, diameter ratios, and vessel angles predict the development of anterior communicating artery aneurysms: A morphological analysis. J Clin Neurosci. 68, 250-255 (2019).
  8. Starke, R. M., et al. Critical role of TNF-alpha in cerebral aneurysm formation and progression to rupture. J Neuroinflammation. 11, 77 (2014).
  9. Vrselja, Z., Brkic, H., Mrdenovic, S., Radic, R., Curic, G. Function of circle of Willis. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 578-584 (2014).
  10. Azedi, F., et al. Intra-arterial drug delivery to the ischemic brain in rat middle cerebral artery occlusion model. Bio Protoc. 9 (23), e3438 (2019).
  11. Yoshimura, S., et al. Reliable infarction of the middle cerebral artery territory in C57BL/6 mice using pterygopalatine artery ligation and filament optimization - The PURE-MCAo model. J Cereb Blood Flow Metab. , (2024).
  12. Nuki, Y., et al. Elastase-induced intracranial aneurysms in hypertensive mice. Hypertension. 54 (6), 1337-1344 (2009).
  13. Tada, Y., et al. Roles of hypertension in the rupture of intracranial aneurysms. Stroke. 45 (2), 579-586 (2014).
  14. Eldawoody, H., et al. Simplified experimental cerebral aneurysm model in rats: Comprehensive evaluation of induced aneurysms and arterial changes in the circle of Willis. Brain Res. 1300, 159-168 (2009).
  15. Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension. J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2014).
  16. Furukawa, H., et al. Mast cell promotes the development of intracranial aneurysm rupture. Stroke. 51 (11), 3332-3339 (2020).
  17. Dungan, C. M., et al. Deletion of SA beta-Gal+ cells using senolytics improves muscle regeneration in old mice. Aging Cell. 21 (1), e13528 (2022).
  18. Miyamoto, T., et al. Site-specific elevation of interleukin-1beta and matrix metalloproteinase-9 in the Willis circle by hemodynamic changes is associated with rupture in a novel rat cerebral aneurysm model. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (8), 2795-2805 (2017).
  19. Xu, C., et al. CD147 monoclonal antibody attenuates abdominal aortic aneurysm formation in angiotensin II-Infused apoE(-/-) mice. Int Immunopharmacol. 122, 110526 (2023).
  20. Taube, J. M., et al. Multi-institutional TSA-amplified multiplexed immunofluorescence reproducibility evaluation (MITRE) study. J Immunother Cancer. 9 (7), e002197 (2021).
  21. Frosen, J., et al. Saccular intracranial aneurysm: Pathology and mechanisms. Acta Neuropathol. 123 (6), 773-786 (2012).
  22. Cai, J., He, C., Yuan, F., Chen, L., Ling, F. A novel haemodynamic cerebral aneurysm model of rats with normal blood pressure. J Clin Neurosci. 19 (1), 135-138 (2012).
  23. Arnaout, O. M., et al. De novo large fusiform posterior circulation intracranial aneurysm presenting with subarachnoid hemorrhage 7 years after therapeutic internal carotid artery occlusion: case report and review of the literature. Neurosurgery. 71 (3), E764-E771 (2012).
  24. Nagata, I., Handa, H., Hashimoto, N., Hazama, F. Experimentally induced cerebral aneurysms in rats: Part VI. Hypertension. Surg Neurol. 14 (6), 477-479 (1980).
  25. Aoki, T., Kataoka, H., Morimoto, M., Nozaki, K., Hashimoto, N. Macrophage-derived matrix metalloproteinase-2 and -9 promote the progression of cerebral aneurysms in rats. Stroke. 38 (1), 162-169 (2007).
  26. Grunwald, I. Q., et al. An experimental aneurysm model: a training model for neurointerventionalists. Interv Neuroradiol. 12 (1), 17-24 (2006).
  27. Brinjikji, W., Ding, Y. H., Kallmes, D. F., Kadirvel, R. From bench to bedside: Utility of the rabbit elastase aneurysm model in preclinical studies of intracranial aneurysm treatment. J Neurointerv Surg. 8 (5), 521-525 (2016).
  28. Adibi, A., Eesa, M., Wong, J. H., Sen, A., Mitha, A. P. Combined endovascular coiling and intra-aneurysmal allogeneic mesenchymal stromal cell therapy for intracranial aneurysms in a rabbit model: A proof-of-concept study. J Neurointerv Surg. 9 (7), 707-712 (2017).
  29. Liao, B. Y., Zhang, J. Evolutionary conservation of expression profiles between human and mouse orthologous genes. Mol Biol Evol. 23 (3), 530-540 (2006).
  30. Han, Y., et al. Axl promotes intracranial aneurysm rupture by regulating macrophage polarization toward M1 via STAT1/HIF-1alpha. Front Immunol. 14, 1158758 (2023).
  31. Wang, S., et al. Rabbit aneurysm models mimic histologic wall types identified in human intracranial aneurysms. J Neurointerv Surg. 10 (4), 411-415 (2018).
  32. Nowicki, K. W., Hosaka, K., Walch, F. J., Scott, E. W., Hoh, B. L. M1 macrophages are required for murine cerebral aneurysm formation. J Neurointerv Surg. 10 (1), 93-97 (2018).
  33. Shi, Y., et al. Nrf-2 signaling inhibits intracranial aneurysm formation and progression by modulating vascular smooth muscle cell phenotype and function. J Neuroinflammation. 16 (1), 185 (2019).
  34. Morimoto, M., et al. Mouse model of cerebral aneurysm: experimental induction by renal hypertension and local hemodynamic changes. Stroke. 33 (7), 1911-1915 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

CD86 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены