혈역학적 변화와 고혈압에 기반한 두개내 동맥류의 수정된 마우스 모델

요약

두개내 동맥류(IA)는 고혈압 및 혈역학적 변화의 위험 인자를 사용하여 마우스에서 구성되었습니다. 혈역학적 변화는 경동맥의 가지를 결찰함으로써 유도된 반면, 고혈압은 신장 동맥의 후부를 결찰함으로써 이루어졌습니다. IA 형성은 자기공명혈관조영술(MRIGRAPHY), 입체현미경 검사, 병리학적 분석을 통해 검출되었다.

초록

두개내 동맥류(IA)는 동맥류 파열과 관련된 이환율 및 사망률로 인해 심각한 건강 위험을 초래합니다. 그러나 IA 발달의 기저에 있는 분자 메커니즘은 여전히 불분명하며 적절한 마우스 모델이 필요합니다. IA의 마우스 모델은 고혈압 유도와 결합된 부가적인 혈역학적 변화를 유도하기 위해 익상구개 동맥(PPA)을 결찰하여 확립되었습니다. C57BL/6 수컷 마우스에서 우측 PPA, 외부 경동맥(ECA), 후두 동맥(OcA) 및 좌측 반대쪽 총경동맥(CCA)을 포함한 혈관을 결찰하여 혈역학적 변화를 유도했습니다. 일주일 후, 신장 동맥(pRA)의 양측 후방 분지를 결찰하고 고혈압을 유발하기 위해 8% 소금 식단을 도입했습니다. 유도 3개월 후 IA의 형태학적 및 병리학적 변화를 평가하기 위해 자기공명혈관조영술(MRA), 입체현미경 검사, 면역조직화학(IHC) 염색을 수행했습니다. 실험군에서는 초기 유도 후 4마리의 쥐가 죽었다. 다른 위치에서의 IA는 남아 있는 11마리의 쥐 중 5마리에서 검출되었다. 현미경 검사와 MRA 검사 모두에서 IA 형성이 확인되었습니다. 병리학적 및 IHC 분석에서 내부 탄성 층의 파괴, 콜라겐 섬유의 단절, CD86 양성 M1 대식세포의 침투가 밝혀졌으며, 이는 인간 IA에서 관찰된 것과 일치하는 결과입니다. 이 IA 마우스 모델은 인간 샘플에서 관찰된 병리학적 변화를 복제하며 IA 형성 및 진행의 분자 메커니즘을 조사하기 위한 귀중한 도구 역할을 할 수 있습니다.

서문

두개내 동맥류(IA)의 유병률은 일반 인구의 3.2%로 추정된다¹. IA는 높은 관련 이환율 및 사망률로 인해 심각한 건강 위험을 초래합니다. IA는 혈역학적 변화, 염증 및 혈관 재형성의 영향을 받는 복잡하고 다차원적인 병리학적 질환입니다 ^2,3. 혈역학적 변화와 고혈압은 동맥류의 형성과 진행에 관여한다 ^4,5. IA는 혈역학적 전단 응력이 상승한 대뇌 분기점에서 자주 발생하며⁶, 좁은 각도의 분기는 인간의 IA 발달에 대한 위험 인자로 확인되었습니다⁷. 혈관내 치료법과 수술 전략의 발전에도 불구하고, IA 파열로 인한 지주막하 출혈은 여전히 재앙적입니다. 따라서 약물 치료법을 모색하는 것이 동맥류 파열을 예방할 수 있는 유망한 접근법이다⁸. 그러나 IA의 병리학적 형성과 진행의 기전은 불분명합니다. 인간의 위험 요인을 기반으로 IA 형성 및 진행에 적합한 마우스 모델을 개발하는 것은 기본 메커니즘을 밝히고 잠재적인 치료 표적을 식별하는 데 매우 중요합니다. 본 연구는 인간의 IA 특성을 모방한 마우스에서 파열 없는 IA 형성 모델을 구축하는 것을 목표로 합니다.

윌리스 원(CW)은 오른쪽 내부 경동맥(ICA), 왼쪽 ICA 및 양측 척추 기저 동맥을 연결하고 전달합니다. CW는 ICA 또는 척추 동맥의 폐색 또는 협착의 경우 보상 메커니즘으로 작용합니다⁹. 익상구개동맥(PPA)은 뇌의 외부 부분에 혈액을 공급하는 ICA의 한 분파입니다¹⁰. CW의 보상 기능에 따라 PPA 폐색은 ICA의 혈류를 증가시킵니다. 좌측 총경동맥(CCA), 우측 외경동맥(ECA) 및 후두동맥(OcA)의 결찰을 결합하면 특히 좁아진 각도에서 CW의 혈류가 증가하여 혈역학적 변화를 일으킵니다. 이 모델에서 뇌로의 혈액 공급은 척추 기저 동맥과 우측 ICA에 의해 지원됩니다. PPA 결찰은 마우스의 폐사율에 기여하지 않았다¹¹.

엘라스타제 주사를 기반으로 IA 모델을 유도하기 위해 Alzet 펌프 또는 DOCA(deoxycorticosterone acetate)-염^12,13을 통한 안지오텐신-II(Ang-II) 방출에 의해 고혈압이 유발되었습니다. Alzet와 DOCA의 높은 비용은 많은 수의 동물을 포함하는 실험에서 고려해야 합니다. 달성된 고혈압 수준은 양측 신장 동맥의 후방 분지와 하부 분지 결찰 간에 유의미한 차이가 없었거나 양측 신장 동맥의 후방 분지 간에 큰 차이가 없었다. 그러나 전자의 접근법은 더 큰 신기능 장애를 초래했다¹⁴. 따라서 양측 후방 신장 동맥(pRA)의 결찰은 대부분의 연구자에게 합리적인 방법으로 간주됩니다.

엘라스타제는 단일 정위 주사를 통해 오른쪽 기저 수조의 뇌척수액에 주입되었습니다¹². 엘라스타제 주사 기반 IA 모델은 주입 3주 후 60%-80% IA 파열을 일으켰는데,^{이는 15,16} IA 형성 및 발달을 연구하기에는 너무 짧습니다. 또한, IA 형성 중 인간의 엘라스타제 수치가 상승했음을 시사하는 증거는 없습니다. 또한 오른쪽 수조에 입체택시 주입은 마우스의 높은 폐사율 및 장애와 관련이 있어 초보자에게 상당한 도전이 됩니다.

본 연구에서는 인체 위험 요인을 기반으로 3개월 이내에 파열되지 않은 IA의 마우스 모델을 구축했습니다. 이 모델은 DOCA 및 Alzet와 관련된 높은 비용을 제거합니다. 또한 실체 현미경만 사용하여 수행할 수 있으며 초보자도 쉽게 마스터할 수 있습니다.

프로토콜

생쥐의 모든 수술 절차는 윤리 검토 위원회(Ethical Review Committee)의 기준을 준수했으며 상하이 교통대학교(Shanghai Jiaotong University)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. C57BL/6 수컷 마우스(8주령, 20-25g)를 12시간/12시간 라이트/다크 사이클로 22°C의 온도에서 사육했습니다. 운영 프로세스는 그림 1A에 나와 있습니다. 간단히 말해서, 마취된 동물에서 좌측 총경동맥(CCA), 우측 외부 경동맥(ECA), 후두동맥(OcA) 및 익상구개동맥(PPA)을 결찰하여 혈역학적 변화를 유도했습니다. 혈역학적 변화가 시작된 지 일주일 후에 양측 신동맥(bRA)을 결찰하여 고혈압을 유발하고, 동물에게 8%의 소금이 함유된 사료를 먹였습니다. 혈역학적 변화와 IA 형성은 그림 1B에 나와 있습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.

1. 혈역학적 변화 및 고혈압에 따른 마우스 UIA 확립

참고: 생쥐는 수술 전에 12시간 동안 금식했습니다. 수술 기구는 70% 알코올에 최소 30분 동안 담가 멸균했습니다.

1. 37°C로 유지되는 가열된 패드에서 O₂ (1L/분)의 혼합물로 2% 이소플루란 흡입이 가능한 소동물 마취기를 사용하여 마취(기관에서 승인한 프로토콜에 따름)를 시행합니다.
2. 왼쪽 CCA 합자
   1. 경추 정중선을 따라 1cm 직선으로 절개합니다. 기관을 노출시키기 위해 피하 조직과 판형질을 절개합니다.
   2. 경정맥을 당겨 빼내고 기관을 따라 경동맥초를 찾습니다(그림 2A, i, ii). 왼쪽 CCA와 미주신경을 분리합니다. 왼쪽 CCA를 6-0 실크 봉합사로 접합합니다(그림 2A iii,iv).
3. 올바른 ECA 및 OcA 연결
   1. 우측의 CCA, ICA, ECA, OcA, 미주신경, 설하신경의 해부학적 구조를 노출시킵니다. 오른쪽 ECA를 6-0 실크 봉합사로 접합합니다(그림 2A iii,iv).
   2. OcA를 분리하고 8-0으로 합칩니다. 실크 봉합사 (그림 2A, v-viii). 두 개의 직선 마이크로 집게를 사용하여 OcA를 분리합니다.
      참고: ECA에서 근위적으로 발생하는 OcA는 설상 신경 아래에 있습니다(그림 2A v - viii). OcA를 해부하면 PPA 해부학을 효과적으로 노출시키는 데 도움이 됩니다.
4. 올바른 PPA 결합
   1. ICA에서 설하신경을 분리합니다. 시술 관련 손상으로부터 신경을 보호하기 위해 설하신경과 ICA 사이에 수술용 면을 놓습니다.
   2. 마이크로핀셉스를 사용하여 PPA 주변의 혈관 주위 조직을 절개합니다. Clamp PPA를 임시로 가볍게 당겨 올립니다. 8-0 배치 PPA를 접합하기 위해 PPA와 ICA 사이의 실크 봉합사(그림 2A, ix, x).
   3. PPA를 접합하고 결찰 부위와 PPA의 기원 사이에 충분한 거리를 유지하여 Willis 원의 혈류를 보장합니다(그림 2A x).
      참고: 이 단계의 주요 과제는 말초 신경과 혈관 구조를 손상시키지 않고 매우 좁은 수술 공간 내에서 PPA를 결찰하는 것입니다. PPA에 노출되는 동안 기관을 압박하지 마십시오.
5. 작업 완료
   1. 포비돈 요오드로 수술 현장을 소독하고 상처를 봉합합니다. 마취에서 회복될 때까지 생쥐를 모니터링합니다.
6. 고혈압 유발
   1. 뒤쪽 12^번째 척추 높이에서 2cm 길이의 정중선을 절개합니다. 신장을 노출시키기 위해 등쪽 근육을 자릅니다. 겸자를 사용하여 신장 주위의 지방 조직을 고정하고 근육 절개 부위 내부에 신장을 고정합니다(그림 2B, i, ii).
   2. 신장 척추경 주위의 지방 조직을 분리하십시오. 신장 정맥과 밀접하게 접촉하는 pRA를 확인합니다(그림 2B, iii,iv). Clamp pRA를 잡고 직선 마이크로 집게를 사용하여 위로 당깁니다. 다른 마이크로 겸자를 사용하여 pRA와 신장 정맥 사이의 근막을 절개합니다(그림 2B, v, vi).
      알림: 치명적인 출혈로 이어질 수 있는 신장 정맥의 손상을 방지하기 위해 주의하십시오.
   3. 6-0 실크 봉합사로 pRA를 접합합니다(그림 2B, vii, viii). 결찰 직후, 신장 상부에 허혈성 병소가 형성되는 것을 관찰합니다(그림 2B, ix,x). 절개 부위의 근육과 피부를 봉합합니다.

2. MRA 및 실체 현미경을 통한 IA 검사

1. 동맥류 유도 후 3개월 후 TOF(Time-of-Flight) 7.0T 자기공명혈관조영술(MRA)을 수행하여 IA 형성을 평가합니다.
   1. 이소플루란 마취 후 출혈 및 자궁경부 탈구를 통해 마우스를 안락사시킵니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름). 이전에 보고된 대로 실체현미경으로 IA를 감지합니다¹⁷.
   2. 시료에 냉각된 PBS를 주입한 다음 4% 파라포름알데히드를 주입한 다음 Microfil을 주입하여 혈관과 동맥류를 시각화합니다.
   3. 동맥류는 모동맥보다 1.5배 더 크게 바깥쪽으로 부풀어 오르는 것으로 정의하며, 이는 두 명의 독립적인 신경외과 의사에 의해 관찰되었습니다 ^8,18.

3. 조직학 및 면역조직화학 분석

1. 현미경으로 Willis의 원을 분리합니다. 4 % 파라 포름 알데히드로 표본을 4 ° C에서 24 시간¹⁹ 분 동안 고정합니다.
2. 조직학적 및 면역형광 염색을 위해 표본을 파라핀 및 동결 절편으로 처리합니다. 제조업체의 지침에 따라 EVG 및 Masson 얼룩이 있는 파라핀 단면을 염색합니다¹⁹.
3. 파라핀 절편을 차단 용액으로 배양하여 비특이적 결합을 최소화합니다.
4. CD86에 대한 1차 항체가 있는 절편을 4°C에서 밤새 배양합니다. 2차 항체로 배양한 후 DAB²⁰으로 절편을 반응시켜 갈색을 띱니다.
5. hematoxylin으로 counterstaining을 수행하고 수성 장착 용액²⁰으로 섹션을 장착합니다.

결과

IA 형성 속도
실험군(n=15)에서는 2마리의 생쥐가 알 수 없는 이유로 초기 시술 후 1주일 이내에 사망했습니다. 한 마리의 쥐는 두 번째 시술 후 3일째 되는 날에 허리 상처의 감염으로 사망했고, 다른 한 마리는 동맥류가 발견되지 않은 채 알 수 없는 이유로 38일째에 사망했습니다. 대조군(n = 5)에서는 5마리의 생쥐가 모두 희생될 때까지 살아남았습니다. 실험?...

토론

본 연구는 고혈압과 병행하여 부가적인 혈류역학적 변화를 유도하기 위해 PPA의 결찰을 통해 IA의 마우스 모델을 구축하는 수정된 접근 방식을 제시합니다. MRA 영상과 현미경 분석은 Willis의 서클에서 상당한 동맥류 변화를 보여주었습니다. 이 모델에서 관찰된 병리학적 변화는 인간 샘플에서 발견된 것과 일치합니다. 이 마우스 모델은 IA 형성 및 발달의 기저에 있는 분자 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
7.0 T magnetic resonance angiography	Bruker	BioSpec 70/20
C57BL/6 mice	Charles River Laboratories		sex: male
CD86 antibody	CST	91882
Elastic Van Gieson (EVG)stain	Solarbio	G1597
Masson	Solarbio	G1340
Micro forcep	Shanghai Jinzhong Instrument Company
Microfil	Flow Tech Inc.	MV-120
Small animal anesthesia machine	RWD	R500
Stereo microscope	Shanghai Optical Instrument Company	XYH-6B
Suture	Shanghai Jinhuan Medical Company		6-0, 8-0