合资是由来自美国S＆结肠炎克罗恩基金会（CCFA）的奖学金支持。 JRM是支持由中国连锁经营协会，癌症研究所（CRI）的，霍华德H.古德曼（MGH），马萨诸塞州的生命科学中心（MLSC）和美国国立卫生研究院主任最新创新奖助学金。

1。 前肠道归巢和控制T细胞的体内产生（见图1 ） <ol><li>隔离糖化从野生型小鼠脾脾。在PBS的细胞悬液，离心重悬为5 400 × G.取出上清液和裂解红细胞resuspending在2-3分钟的ACK裂解液4毫升细胞沉淀。之后，添加5毫升的PBS。 5 400 XG离心去除上清。 </li><li>总脾重悬在1 × 10 6 /毫升的IMDM + 10％FBS + 50毫米2 -巯基乙醇+青霉素/链霉素（完整的IMDM）。分开两组，其中之一是与RA（或合成的RAR -受体激动剂，如Am80或Am580）补充到终浓度为100-200纳米3细胞。活化的T细胞在RA或RAR -受体激动剂的存在将上调a4b7and CCR9，将成为肠道嗜T细胞，而没有天雨激活的T细胞将成为控制T细胞。 </li><li>添加1.5-2.0毫升细胞悬液，每孔以前涂有抗CD3（10毫克/毫升）和抗CD28（10毫克/毫升）24孔板和37 °彗星在5％CO2 2（涂层板加500毫升/抗CD3加抗CD28在PBS孵育2小时，在37˚C，然后用2 ml PBS洗两次）。 </li><li>为了避免T细胞的过度刺激，转移到一个新的无涂层的24孔板中的细胞悬浮液后2-3天。孵育2-3天。根据细胞密度和增殖的媒体可能成为酸（黄色），在这种情况下，它可能是需要更换新鲜完整的IMDM媒体的一半。收获后4-5天（从0天算起）的细胞。 </li><li>典型的最终产量是1-2 × 10 6个效应T细胞/孔。因此，应至少每肠道嗜T细胞和控制T细胞9-12井镀以10-20 × 10 6 T细胞每条件。 </li></ol> 2。肠道归巢受体激活T细胞的分析经过4-5天的文化，我们应该观察肠道归巢受体的T细胞激活在RA或RAR激动剂的存在，而控制T细胞表达非常低的水平， 这些受体4 a4b7and CCR9的高表达。 流式细胞术（FACS）分析。 <ol><li>收集0.2-0.5 × 10 6细胞和离心5分钟在300克之间，4 ° C 。 </li><li>抗CD4 - FITC，抗- a4b7 - PE（BD公司），抗CCR9 - APC（eBiosciences）和抗- CD8 - PercP孵育15分钟，4 °在C黑暗。 </li><li>孵化后，300克4 ° C离心5分钟染色缓冲液洗和重悬细胞，并用流式细胞仪分析。 </li></ol> 3。 T与CFSE和CMTMR细胞跟踪细胞标记<ol><li>所有的解决方案保持在37℃前开始。清洗肠道嗜T细胞（a4b7 高 CCR9 高 ）和控制T细胞（a4b7 低/负 CCR9 低/ NEG）的两倍，用PBS去除血清。调节T细胞浓度为10-15 × 10 6 /毫升的PBS。 </li><li> CFSE（羧基琥珀酰亚胺酯）或CMTMR（氯苯甲酰氨基-四甲）荧光团，无论是肠道嗜T和控制T细胞的终浓度为5毫米和10毫米，分别轻轻旋涡和20分钟的孵育37 ° C。建议交换在相同或在另一项实验中，为了排除潜在的内在影响，对T细胞迁移荧光团的标号。 </li><li>孵化后，淬火1 FBS和孵化量在室温下为1-5分钟。用温PBS稀释10倍，离心5分钟，300克。洗净，用PBS重悬在完成IMDM两次。 </li><li> 10-20 × 10 6细胞的每个T人口理想的情况下，应以1:1的比例混合，然后在5分钟的300 XG离心。最后，在200-250毫升的温暖PBS重悬细胞和经尾静脉注入。 </li><li>为了计算出准确的投入比例（理想接近1）保存5-10毫升注入细胞悬液和300毫升的PBS稀释，并用流式细胞仪分析。 </li></ol> 4。分析的T细胞归巢虽然可以在不同时间点（1小时，几天后T细胞注射）分析小鼠，肠嗜T细胞归巢是最好的记录之间的12-24小时后注射。更长的时间点增加影响的最后一个单元格的数字/比率，如T细胞凋亡和T细胞从组织退出，其他变量的潜在影响。后的小鼠安乐死，从几个组织的细胞悬浮液，应毫不迟延地隔离，以减少细胞死亡，这可能会影响最终的产量和结果。利益的组织是小肠，结肠，脾，淋巴结肿大，Peyer氏斑，肝，肺和血液。如果注射T细胞是真正的肠嗜T细胞，它们应该平均5-10倍（或更高）的小肠黏膜相比，控制T细胞的家庭。然而，其他组织，如血液和脾脏，不应该表现出了优惠的T细胞迁移。淋巴细胞从肠道固有层和上皮内舱分离先前已经描述5。 <ol><li>流式细胞仪染色：样品是根据收集的密度不超过3.0 × 10 6细胞/ ml，悬浮细胞的数量。如果congenic CD45.1 +或Thy1.1 +小鼠作为接受者，与相 ​​应congenic的标记（例如，CD45.2或Thy1.2结合一些宗族标记（例如，TCRbchain，CD4 +，CD8 +细胞染色） ，CD45.1 + / CD45.2 +）。 </li><li>在流式细胞仪分析，细胞是门上的congenic标记（例如CD45.1），然后对具体的血统标志物（如CD4/CD8比值）和CMTMR和CFSE阳性细胞之间的比率分析。 </li><li>通常表示为归位指数（HI），这是计算的比例CFSE / CMTMR除以相应的输入比例（见下文）每一个组织（或CMTMR / CFSE）的数据。如果输入的比例是非常接近1，然后组织比率将相当于所喜。 </li></ol>您好= CFSE 组织 / CMTMR 组织 ：CFSE 输入 / CMTMR 输入 血也应该加以分析，以确定两个T细胞群是否平等的代表在流通领域中，如果一个T细胞的人口减少了其他方面（例如，在肺/肝优惠诱捕或下降的可行性）。可能发生这种情况时比较天真或休息的记忆性T细胞与最近激活的效应T细胞，因为后者可能会在更大程度上被困在肺部。如果血液中的HI是明显大于1的不同，可以在血液您好您好正常化组织。血液可通​​过从小鼠心脏穿刺麻醉avertin或isofluorane之前安乐死，并应与前两次使用流式细胞仪染色的ACK缓冲裂解。 血液正常化=您好组织 /嗨血 5。代表性的成果受体小鼠（Thy1.1 +）euthanized18h后的细胞注射。从脾，外周淋巴结（PLN），肠系膜淋巴结（MLN）和小肠椎板propia（LP）产生的细胞悬浮液。之后染色Thy1.2和CD8细胞，然后用流式细胞仪分析可行Thy1.2 + CD8 +细胞，这是最后CMTMR +细胞（肠嗜T细胞）和CFSE之间的比例分析浇注 +细胞（控制T细胞）除以投入比。结果可以显示在图2所示，其中肠道热带和控制T细胞同样归属脾（您好关闭TO1，用一根红线表示），可以欣赏。相比之下，肠道嗜T细胞迁移的10倍左右，更有效的唱片相比，控制T细胞。 <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="图1" /> 图1：被隔离。图显示肠道热带和非肠嗜T细胞的生成和标签的T细胞和野生型小鼠与anti-CD3/anti-CD28在100-200纳米的存在或缺席所有激活- 反式维甲酸（RA）的。经过4-5天的RA治疗T细胞获得肠道CCR9和a4b7归巢受体的表达。然后，肠道热带和控制T细胞的差异标记CFSE或CMTMR，洗净，以1:1的比例混合成收件人小鼠经尾静脉注射。一些标记的细胞被用来确定CFSE / CMTMR输入比率（应接近1）。 <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="图2" /> 图2：归位分析的例子 。小鼠分析h后12-18 T细胞注射液和单细胞悬液，获得利益的机关。细胞染色，抗- Thy1.2（congenic标志），加上抗CD8，然后Thy1.2 + CD8 + T细胞CMTMR比例分析 +和CFSE +各组织细胞，用流式细胞仪。组织CMTMR / CFSE比率，然后输入CMTMR / CFSE比例归一，以获取指数（HI）的归位。在这个例子中CMTMR +和CFSE +细胞是肠道热带和控制效应T细胞，分别。

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即使归巢的实验提供了非常宝贵的有关在任何特定的组织细胞总人口的迁移的信息，应牢记这些实验不直接分析内皮细胞粘附，因此不歧视的多级粘连步骤（S）级联（圈养/滚动，激活或坚持）一个给定的归巢受体行事。黄金标准中定义的粘附级​​联的归巢受体的具体的作用，是活体显微镜（IVM），其中个人荧光标记的T细胞（或其他细胞，甚至荧光标记的珠）直接观察与内皮细胞的实时交互。?...

动物：C57BL / 6小鼠的T细胞隔离。此外，杰克逊实验室（ME）的巴尔港，CD45.1和Thy1.1 congenic株都可以通过。 文化传媒：IMDM（Iscove的修改贝科的中等+ L -谷氨酰胺+ HEPES），加上10％ 的热量，灭活胎牛血清 （胎牛血清，低内毒素，GIBCO ®，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚）辅以100 ü / ml青霉素，100毫克/ ml链霉素（Hyclone公司抗生素，马萨诸塞州沃尔瑟姆），0.5毫克/毫升fungizone /两性霉素B（GIBCO），B -巯基乙醇和50毫米。 ACK红血细胞裂解液 （红细胞，10毫米KHCO 3 0.1毫米，150毫米NH 4 CL，EDTA，pH值8.0），调整pH值7.2-7.4，并储存在室温下）。 PBS（磷酸盐缓冲生理盐水，Hyclone公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆，）。 流式细胞仪（FACS）媒体 （PBS或IMDM + 2％FBS + 5 mM的EDTA）。当染色选择- FC的嵌合体，媒体使用2毫米钙+ +应该是所有步骤中使用（包括流式细胞仪收购） 。在这种情况下，建议IMDM培养。 T细胞的标签和过继转移：CFSE（羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯），CMTMR（（5 - （6 )-((( 4 -氯甲基）苯甲酰）氨基）四甲）自Molecular Probes ®，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA ）。 1000 ×股票应是在DMSO（CFSE 5毫米，20毫米CMTMR），并储存在-20 ° C 多克隆T细胞的活化 ：24孔或96孔板（组织培养处理，聚苯乙烯，平底，有盖的，位于美国新泽西州富兰克林湖，屋宇署猎鹰）孵育2小时，分别在37℃， 50毫升PBS含有抗CD3加抗CD28抗体（10毫克/毫升）。然后，培养板，用PBS洗两次，并立即用于T细胞培养。另外，anti-CD3/anti-CD28（DYNAL，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）涂层磁珠可用于对T细胞的活化，而不是板结合的抗体。 流式细胞仪（FACS）染色：多克隆活化：CD3（1452C11），CD28（37.51）。天堂单克隆抗体：CD4（L3T4），CD8a（LY - 2），Thy1.2（CD90.2/53-1.2），CD45.2（104）。肠道归巢受体：纯化CCR9（CD199/eBioCW-1.2，eBioscience公司，圣迭戈，CA），a4b7（LPAM-1/DATK3），同型对照 （IgG2a，K）。皮肤归巢受体：P -选择素- FC（纯化的小鼠P -选择- IgG融合蛋白，BD Pharmingen公司，圣何塞，加利福尼亚州），E -选择素- FC（重组小鼠E-Selectin/Fc奇美拉，R＆D系统，明尼阿波利斯， MN），加上相应的辅助试剂山羊F（AB）2抗人IgG的R - PE（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）。 全反式维甲酸 （Sigma公司，圣路易斯，密苏里州）是悬浮于无水乙醇或使用一个黄色的灯泡或间接的光线来源，在筹建期间DMSO的。商店的玻璃小瓶分装于-80 ° C和避光在任何时候。合成的RAR -受体激动剂：Am80（和光化工，里士满，弗吉尼亚州）。

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

为了发挥其功能的淋巴细胞，需要离开血液和迁移到身体的不同组织。淋巴细胞粘附于血管内皮细胞和组织外渗是一个多步骤的过程，不同的粘附分子控制（归巢受体）对淋巴细胞和各自的配体（addressins）1 2内皮细胞上显示。即使这些粘附受体的功能，可部分研究体外，其生理意义的最终测试，以评估他们的作用 ，在体内淋巴细胞的黏附和迁移。两个相辅相成的策略已经用于此目的：活体显微镜（IVM）和归巢的实验。虽然IVM必须确定精确的实时性和在不同组织中的粘附级联在特定的粘附受体的贡献，IVM的是耗费时间和劳动力密集，往往需要复杂的外科技术的发展，它需要同质化的前隔离细胞群，它允许在任何给定的时间只有一个组织/器官的分析。与此相反，有竞争力的归巢实验允许的直接同步比较，在相同的鼠标在两个移民（甚至更多）的细胞亚群，他们还允许许多组织和分析大量的细胞在相同的实验。 在这里，我们描述古典的竞争归巢的协议，用于特定组织，以确定一个给定的细胞类型的优势/缺点相比，控制细胞群。我们选择来说明肠道热带与非肠道嗜T细胞的迁徙，因为肠道黏膜是与外部环境最大的身体接触表面，它也是与最好的定义的迁徙要求额外的淋巴组织。此外，最近的工作已经确定，维生素代谢产物的全反式维甲酸（RA）诱导淋巴细胞的肠道特异性粘附受体（整合a4b7and趋化因子受体CCR9）负责的主要分子机制。因此，我们可以很容易地通过激活T细胞在RA的存在或缺乏肠道热带和非肠道嗜淋巴细胞体外大量产生，分别，终于可以在这里所描述的竞争归巢实验。

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

竞争归巢实验允许直接评估一个鼠标的两个不同的细胞群的洄游特性。在这里，我们说明了此过程中，通过对比前体内产生的肠道热带与非肠嗜T细胞迁移。

竞争的原点实验研究肠嗜T细胞迁移

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

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12.4K 次观看.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. 竞争归巢实验允许直接评估一个鼠标的两个不同的细胞群的洄游特性。在这里，我们说明了此过程中，通过对比前体内产生的肠道热带与非肠嗜T细胞迁移。