EJVは、アメリカのクローン病S＆大腸炎財団（CCFA）のフェローシップでサポートされています。 JRMはCCFA、がん研究所（CRI）、ハワードH.グッドマン（MGH）、マサチューセッツ州ライフサイエンスセンター（MLS​​C）とNIHのディレクターの新イノベーター賞からの補助金によってサポートされています。

腸管ホーミングと制御性T細胞（図1参照）1。 生体外での発生<ol><li>野生型マウスから一脾臓を糖化により、脾細胞を分離します。 5&#39;400 × gでのためにPBSと遠心で細胞懸濁液を懸濁します上清を除去し、2〜3分のためのACK溶解緩衝液を4 mlに細胞ペレットを再懸濁することにより赤血球を溶解する。その後、PBS 5 mlを加える。 400 xgで5&#39;間遠心し上清を取り除く。 </li><li> 1 × 10 IMDM 6 / mLの+ 10％FBS + 50 mM 2 -メルカプトエタノール+ペニシリン/ストレプトマイシン（完全IMDM）で合計脾細胞を再懸濁します。 100から200 nMの3の最終濃度にRA（またはそのようなAm80やAm580などの合成RAR -アゴニスト、）を補足されそのうちの1つのグループ、セルを区切る。 RAまたはRAR -アゴニストの存在下で活性化T細胞はa4b7and CCR9を上方調節し、RAせずに活性化T細胞が制御性T細胞になるのに対し、腸管指向性T細胞になります。 </li><li>以前に抗CD3（10 mg / ml）を、抗CD28（に10 mg / ml）でコートした24ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液の1.5〜2.0 mlを加え37℃、5％COで2は、（コーティング用プレートは、500ミリリットル/ウェルの抗CD3プラス37℃で2時間PBSとインキュベートにおける抗CD28を追加˚Cと後、2 mlのPBSで2回洗浄）。 </li><li> T細胞の過剰な刺激を避けるために、2〜3日後に新しいコーティングされていない24ウェルプレートに細胞懸濁液を移す。さらに2〜3日間インキュベートする。細胞密度と増殖に応じてメディアは、それが新鮮な完全IMDMとメディアの半分を交換する必要があるかもしれない、その場合には酸（黄色）、になる可能性があります。 4-5日（0日目から数えて）の後に細胞を収集する。 </li><li>典型的な最終的な収量は1〜2 × /ウェル10 6エフェクターT細胞である。したがって、各腸指向性T細胞と制御性T細胞の9月12日のウェルの最小値は、条件ごとに10から20 × 10 6 T細胞で終わるためにメッキをしてください。 </li></ol> 2。活性化T細胞上腸ホーミング受容体の解析制御性T細胞はこれらの受容体4の非常に低いレベルで発現してください一方、文化の4-5日後に我々は、RAまたはRARアゴニストの存在下で活性化T細胞上の腸管ホーミング受容体a4b7and CCR9の高発現を観察する必要があります。 フローサイトメトリー（FACS）分析。 <ol><li> 4℃で300gで5分間、0.2〜0.5 × 10 6個の細胞および遠心の間に収集℃の</li><li>抗CD4 - FITC、抗a4b7 - PE（BD Biosciences社）、4℃で15分間暗所でのための抗CCR9 - APC（eBiosciences）および抗- CD8 - PerCPでインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、300 G 4℃で5分間のために遠心分離洗って再懸濁細胞を染色バッファーでとFACSにより解析する。 </li></ol> 3。 CFSEとCMTMR細胞トラッカーを持つT細胞のラベリング<ol><li> 37すべてのソリューションを保持° Cを開始する前に。血清を除去するためにPBSで2回腸指向性T細胞（a4b7 ハイ CCR9 高 ）と制御性T細胞（a4b7 ロー/負 CCR9 ロー/ NEG）洗う。 10月15日× 10 6 / PBS中にT細胞の濃度を調整します。 </li><li>で穏やかにボルテックスし、20分間インキュベート、それぞれ5 mMおよび10mMの最終濃度に腸内指向性Tと制御性T細胞のいずれかにCFSE（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）またはCMTMR（クロロメチル - ベンゾイル - アミノ - テトラメチルローダミン）フルオロフォアを追加37℃それは、T細胞遊走に対する蛍光物質の潜在的な本質的な影響を除外するために、同じまたは別の実験でラベリングを交換することをお勧めします。 </li><li>インキュベーション後、室温で1〜5分間、FBSとインキュベートの1ボリュームで急冷。温かいPBSで10倍に希釈し、300 gで5分間遠心操作完全IMDMにPBSに懸濁するで2回洗浄。 </li><li>理想的には、各Tの人口の10-20 × 10 6細胞を1:1の割合で混合し、5分間、300 × gで遠心してください。最後に、温かいPBSの200から250 mLで細胞を再懸濁し、尾静脈を介して注入する。 </li><li>正確な入力の比を（理想的に1に近い）注入さ細胞懸濁液5〜10 mLを保存し、希釈PBS 300mLでとFACSによって分析する計算に。 </li></ol> 4。ホーミング性T細胞の解析マウスは様々な時点で（1時間と数日の後のT細胞の注入の間）で分析することができますが、腸管指向性T細胞のホーミングは、最高の12から24時間後の注射の間で文書化されています。長い時間点は、このようなT細胞のアポトーシスと組織からT細胞の出口としての最終的な細胞数/比率を、影響を与える他の変数の影響の可能性を増加させる。マウスは安楽死された後、いくつかの組織からの細胞懸濁液は、最終的な収量と結果に影響を与える可能性が細胞死を、減少させるために遅滞なく分離されている必要があります。興味のある組織は、小腸、大腸、脾臓、リンパ節、パイエル板、肝臓、肺と血液です。場合注入されたT細胞は正真正銘の腸管指向性T細胞であり、これらはT細胞を制御するために比較して、小腸の粘膜に平均5〜10倍向上（またはそれ以降）上のホームすべき。しかし、そのような血液や脾臓などの他の組織は、優先的T細胞の遊走を示さないではありません。腸管粘膜固有層および上皮内コンパートメントからリンパ球の単離は、以前は次の5を記載されている。 <ol><li> FACSは、染色：試料は3.0 × 10 6細胞/ ml以上ない高い密度で、採取した細胞の数に応じて再懸濁する。もしコンジェニックCD45.1 +またはThy1.1 +マウスをレシピエントとして使用された、細胞はいくつかの系統のマーカー（例えば、TCRbchain、CD4、CD8との組み合わせに対応するコンジェニックマーカー（例えば、CD45.2またはThy1.2）に染色されています、CD45.1 + / CD45.2 +）。 </li><li> FACS分析の間、細胞はコンジェニックマーカー（例えばCD45.1）上にしてから、特定の系統マーカー（例えば、CD4/CD8）にゲートとCMTMRとCFSE陽性細胞の比率が分析されます。 </li><li>データは通常、対応する入力の比率（下記参照）で割った、各組織の比のCFSE / CMTMR（またはCMTMR / CFSE）として計算されるホーミング指数（HI）、として表される。入力の比が1に非常に近い場合には、組織率は、HIと同じになります。 </li></ol> HI = CFSEの組織 / CMTMR 組織 ：CFSEの入力 / CMTMR 入力 血はまた、両方のT細胞集団が均等に循環で表現されている、または1つのT細胞集団が互いに対して（例えば、肺/肝臓や生存率低下による優先トラップによって）減少している場合かどうかを決定するために分析する必要があります。後者は肺に大きい程度にトラップされる可能性がありますので、ナイーブまたは安静時のメモリーT細胞と、最近活性化エフェクターT細胞を比較するときに発生する可能性があります。血液中のHIが1よりも大幅に異なる場合、人は血液中のHIによって組織の中にHI正規化することができます。血液は、麻酔したマウスから心臓穿刺によって得られることができる（AVERTINまたはイソフルラン前に安楽死を含む）及びFACS染色に使用する前に、ACK緩衝液で2回溶解されるべきである。 血液の正常化= HIの組織 / HI ブラッド 5。代表的な結果レシピエントマウス（Thy1.1 +）は euthanized18hポスト細胞注入した。細胞懸濁液は、脾臓、末梢リンパ節（PLN）、腸間膜リンパ節（MLN）と小腸の粘膜のpropia（LP）から生成されました。細胞は、Thy1.2とCD8を染色し、最終的にCMTMR +細胞（腸指向性T細胞）とCFSEの比率を分析した現実的なThy1.2 + CD8 +細胞、上にゲートでFACSにより解析したそのあと+入力の比で割った細胞（制御性T細胞）。結果は、それが腸指向性と制御性T細胞が均等に脾臓（HI赤線で示されている、TO1を閉じる）をホームとすることが理解できるような、 図2に示すように、表示することができます。 T細胞の制御に比べて対照的に、腸内指向性T細胞はLPに、より効率的に10倍の周りに移行。 <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：。腸指向性と非腸熱帯のT細胞の生成とラベルを示す T細胞は野生型マウスから単離されたとanti-CD3/anti-CD28とし、100〜200 nMのすべての存在下または非存在下で活性化されている図 - トランスレチノイン酸（RA）。 4-5日後にRAで処理したT細胞は腸管ホーミング受容体CCR9とa4b7の表現を取得する。その後、腸指向性と制御性T細胞は、差動1:1の割合で混合し、尾静脈を介してレシピエントマウスに注入、洗浄し、CFSEまたはCMTMRで標識されています。いくつかの標識された細胞をCFSE / CMTMR入力の比を（1に近いはず）を決定するために使用されています。 <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：。ホーミング分析の例マウスは、12から18時間後にT細胞の注入と、単一の細胞懸濁液が関心の器官から得られる分析した。細胞は抗Thy1.2（コンジェニックマーカー）+抗CD8し、Thy1.2で染色されています+ CD8 + T細胞はCMTMRの+とCFSE + FACSによって各組織中の細胞の割合について分析する。組織CMTMR / CFSE比は、ホーミングインデックスを（HI）を取得するために入力CMTMR / CFSE比で正規化されます。この例ではCMTMRの+とCFSE +細胞はそれぞれ、腸指向性と制御エフェクターT細胞である。

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	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ホーミングの実験は、任意の組織の全細胞集団の移行についての非常に貴重な情報を提供していても、それはこれらのアッセイは、直接血管内皮の接着性を分析していないため、多段階の接着性の中のステップ（複数可）を区別しないことを心に留めておく必要がありますカスケード（ローリング/テザリング、活性化または付着）所定のホーミング受容体が機能しています。接着カスケード...

動物：C57BL / 6マウスは、一般的にT細胞の単離に使用されています。さらに、CD45.1とThy1.1コンジェニック系統は、ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）を介して使用できます。 文化メディア：IMDM（イスコフ改変ダルベッコ培地+ L -グルタミン+ HEPES）を加えた10％ 熱不活性 100 U / mlペニシリンを添加したFBS（ウシ胎児血清、低エンドトキシン、GIBCO ®、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）、100 mgの/ mlのストレプトマイシン（HyCloneの抗生物質、ウォルサム、MA）、0.5 mg / mlのfungizone /アンホテリシンB（Gibco社）、および50mMのβ-メルカプトエタノール。 ACK赤血球溶解バッファー （RBC、10mMのKHCO 3、150mMのNH 4 Clを、0.1mMのEDTA、pHは8.0）、室温でpHを7.2から7.4とストアに調整します）。 PBS（リン酸生理食塩水、Hyclone、ウォルサム、マサチューセッツバッファ）。 フローサイトメトリー（FACS）メディア （PBSまたはIMDM + 2％FBS + 5mMのEDTA）。セレクチン- Fcをキメラを用いて染色する場合、2 mMのカルシウムを持つメディアは+ +のすべてのステップ（FACSの買収を含む）で使用する必要があります。 IMDMはこのケースで推奨されます。 T細胞標識と養子移入：CFSE（カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル）、CMTMR -分子プローブ®、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州から（（5（および6 )-((( 4 -クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン） ）。 1000 ×株をDMSOに作ら（5mMのCFSE、20mMのCMTMR）と-20℃で保存してください。 ポリクローナルT細胞の活性化 ：24ウェルまたは96ウェルプレート（組織培養処理された、蓋付き平底ポリスチレン、、BDファルコン、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）は、℃で50 mlのPBS、それぞれ37℃で2時間インキュベートする、抗CD3 +抗CD28抗体（10 mg / mLの各）を含む。その後、培養プレートをPBSで2回洗浄し、T細胞培養のためにすぐに使用。また、anti-CD3/anti-CD28（DYNAL、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）で被覆されたダイナビーズは、代わりにプレート結合抗体のT細胞活性化のために使用することができます。 フローサイトメトリー（FACS）染色：ポリクローナル活性化：CD3（1452C11）、CD28（37.51）。リネージュモノクローナル抗体：CD4（L3T4）、CD8a（LY - 2）、Thy1.2（CD90.2/53-1.2）、CD45.2（104）。腸管ホーミング受容体：精製CCR9（CD199/eBioCW-1.2、eBioscience社、サンディエゴ、CA）、a4b7（LPAM-1/DATK3）、アイソタイプコントロール （IgG2aの、K）。皮膚ホーミングレセプター：P -セレクチン- Fcの （精製マウスP -セレクチン- IgGの融合蛋白質、BD Pharmingen社、サンノゼ、カリフォルニア州）、E -セレクチン- Fcの （組換えマウスのE-Selectin/Fcキメラ、R＆Dシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）に加えて、対応する二次試薬ヤギF（ab&#39;）2の抗ヒトIgG R - PE（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）。 全トランスレチノイン酸（シグマ社、セントルイス、MO）準備中に黄色の電球や光の間接的なソースを使用して無水エタノールやDMSOに再懸濁する。 -80℃のガラスバイアルに保管してアリコート° Cとすべての回で光から保護。合成RAR -アゴニスト：Am80（和光ケミカル、リッチモンド、バージニア州）。

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

それらの機能リンパ球を発揮するために血液を離れて、体内の異なる組織に移行する必要があります。内皮細胞と組織の溢出にリンパ球の接着は、リンパ球と内皮細胞1 2上に表示されるそれぞれのリガンド（アドレシン）に発現する別の接着分子によって制御される多段階プロセス（ホーミング受容体）である。これらの接着受容体の機能が部分的にex vivoで検討することができるにもかかわらず、それらの生理的関連性の究極のテストは、 生体内リンパ球の接着および遊走の中に自分の役割を評価することである。生体顕微鏡（IVM）とホーミングの実験：二つの補完的な戦略は、この目的のために使用されています。 IVMは、リアルタイムで、異なる組織の接着カスケード時に特定の接着受容体の正確な寄与を定義するために必要不可欠なってきていますが、IVMは時間がかかり、労働集約的であり、それはしばしば、高度な手術手技の開発を必要とする、それは均質の前の分離が必要細胞集団と、それは任意の時点で唯一の組織/臓器の分析を可能にします。これとは対照的に、競争力のあるホーミングの実験では、同じマウスの2つ（あるいはそれ以上）細胞サブセットの移行における直接的と同時比較が可能となり、彼らはまた、多くの組織のと同じ実験中の細胞の数が多いの分析を可能にする。 ここでは、コントロール細胞集団と比較して、特定の組織へホームへ所定の細胞型の利点/欠点を決定するために使用される古典的な競争力のあるホーミングプロトコルについて説明します。腸の粘膜が外部環境と接触する最大の身体の表面であり、それはまた最高の定義の渡り鳥要件を持つ追加のリンパ組織であるので、我々は、腸管指向性に対する腸管指向性以外のT細胞の遊走特性を説明するために選んだ。また、最近の研究では、ビタミンが代謝オールトランスレチノイン酸（RA）がリンパ球上に腸に特異的な接着受容体（インテグリンa4b7andのケモカイン受容体CCR9）を誘導に関与する主要分子機構であると判断しました。従って、我々は容易にようやくここで説明する競争力のあるホーミングの実験で使用することができる、それぞれ、RAの存在下または非存在下でT細胞を活性化することによって腸指向性とリンパ球腸管指向性非ex vivoでの多数を生成することができます。

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

競争力のあるホーミングの実験は、直接、単一のマウスの2つの異なる細胞集団の遊走特性を評価することができます。ここでは、生体外で生成された腸管指向性と非腸熱帯T細胞の遊走を比較することによって、この手順を示しています。

腸管指向性T細胞の移動を研究するために競争力のあるホーミングアッセイ

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K ビュー.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. 競争力のあるホーミングの実験は、直接、単一のマウスの2つの異なる細胞集団の遊走特性を評価することができます。ここでは、生体外で生成された腸管指向性と非腸熱帯T細胞の遊走を比較することによって、この手順を示しています。

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

免疫・感染学

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

ナイーブCD4のアデノウイルス形質導入Tregの分化を研究するためにT細胞

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

マウスにおける同種のCD4 T細胞応答を研究する尾皮膚の移植

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

での感染の間に流入領域リンパ節へのマウスの皮膚樹状細胞の移動を研究するためにCFSEベースアッセイ<em&gt;マイコバクテリウム・ボビス</em&gt;カルメット - ゲラン

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

がん抗原の機構理事T細胞受容体の認識を決定するためにX線結晶学、生物物理学、および機能アッセイを使用して、

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

新規In Vitro細胞移動を評価する癒しのアッセイを傷

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

腸管指向性T細胞の移動を研究するために競争力のあるホーミングアッセイ

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移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ

白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで