EJV wird durch ein Stipendium der Crohn s &amp; Colitis Foundation of America (CCFA) unterstützt. JRM wird durch Zuschüsse aus CCFA, Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (MGH), Massachusetts Life Science Center (MLSC) und NIH Director s New Innovator Award unterstützt.

1. Ex-vivo-Generation von gut-Homing und Kontrolle T-Zellen (siehe Abbildung 1) <ol><li> Isolieren Splenozyten von Maischen ein Milz von Wildtyp-Mäusen. Resuspendieren der Zellen Suspension in PBS und zentrifugieren Sie für 5 &#39;bei 400 x g. Entfernen Sie den Überstand und lysieren die roten Blutkörperchen durch Resuspendieren des Zellpellets in 4 ml ACK-Lysepuffer für 2-3 Minuten. Danach werden 5 ml PBS. Zentrifugieren Sie für 5 &#39;bei 400 xg und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren insgesamt Splenozyten bei 1 x 10 6 / ml in IMDM + 10% FBS + 50 mM 2-Mercaptoethanol + Penicillin / Streptomycin (komplett IMDM). Trennen Sie die Zellen in zwei Gruppen, von denen einer mit RA (oder synthetischen RAR-Agonisten, wie zB AM80 oder Am580) bis zu einer Endkonzentration von 100-200 nM 3 ergänzt. T-Zellen in Anwesenheit von RA-oder RAR-Agonisten aktiviert wird hochregulieren a4b7and CCR9 und wird gut-tropic T-Zellen werden, während T-Zellen ohne RA aktiviert Kontrolle T-Zellen werden wird. </li><li> Fügen Sie 1,5-2,0 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte zuvor mit anti-CD3 (10 mg / ml) und anti-CD28 (10 mg / ml) beschichtet und bei 37 ° C in 5% CO 2 (für die Beschichtung der Platte 500 ml / well anti-CD3 und anti-CD28 in PBS und Inkubation für 2 Stunden bei 37 ˚ C und dann zweimal waschen mit 2 ml PBS). </li><li> Um T-Zell-Überstimulation zu vermeiden, nach 2-3 Tagen übertragen die Zellsuspensionen in ein neues unbeschichteten 24-Well-Platte. Inkubieren für weitere 2-3 Tage. Je nach Zelldichte und Proliferation der Medien könnte Säure (gelb), in welchem ​​Fall es nötig sein, die Hälfte der Medien mit frischen komplette IMDM ersetzen werden könnte. Ernte der Zellen nach 4-5 Tagen (gerechnet ab Tag 0). </li><li> Typische Endausbeuten sind 1-2 x 10 6 Effektor-T-Zellen / well. Deshalb sollte ein Minimum von 9-12 Vertiefungen jeder gut-tropic T-Zellen und T-Zellen steuern ausplattiert, um am Ende mit 10-20 x 10 6 T-Zellen pro Zustand sein. </li></ol> 2. Analyse der Darm-Homing-Rezeptoren auf aktivierten T-Zellen Nach 4-5 Tagen der Kultur sollten wir beobachten eine hohe Expression von gut-Homing-Rezeptoren a4b7and CCR9 auf T-Zellen in Anwesenheit von RA-oder RAR-Agonisten aktiviert, während die Control T-Zellen ein sehr niedriges Niveau dieser Rezeptoren 4 Express sollte. Durchflusszytometrie (FACS)-Analyse. <ol><li> Sammeln Sie zwischen 0,2-0,5 x10 6 Zellen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 300 g bei 4 ° C. </li><li> Inkubieren mit anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) und anti-CD8-PerCP für 15 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Nach der Inkubation für 5 min zentrifugieren bei 300 g 4 ° C. Waschen und die Zellen in Färbepuffer und analysieren durch FACS. </li></ol> 3. T-Zell-Markierung mit CFSE und CMTMR Zelle Tracker <ol><li> Bewahren Sie alle Lösungen bei 37 ° C vor dem Start. Wash gut-tropic T-Zellen (a4b7 Hohe CCR9 High) und Kontrolle T-Zellen (a4b7 Low / Neg CCR9 Low / Neg) zweimal mit PBS zur Entfernung des Serums. Passen Sie T-Zell-Konzentration von 10-15 x 10 6 / ml in PBS. </li><li> Add CFSE (Carboxyfluorescein Succinimidylester) oder CMTMR (chlormethyl-benzoyl-amino-Tetramethylrhodamin) Fluorophore entweder gut-tropic T und Kontrolle T-Zellen zu einer Endkonzentration von 5 mM und 10 mM bzw. vorsichtig vortexen, Inkubation für 20 min bei 37 ° C. Es wird empfohlen, die Markierungen in der gleichen oder in einem separaten Experiment Swap, um mögliche intrinsische Effekte von Fluorophoren auf T-Zell-Migration ausschließen. </li><li> Nach der Inkubation löschen mit 1 Volumen FBS und Inkubation für 1-5 min bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie 10-mal mit warmem PBS und zentrifugieren Sie für 5 min bei 300 g. Zweimal waschen mit PBS resuspendieren und in völliger IMDM. </li><li> Idealerweise sollte 10-20 x 10 6 Zellen jeder T Bevölkerung im Verhältnis 1:1 gemischt und anschließend zentrifugiert bei 300 xg für 5 min. Schließlich die Zellen in 200-250 ml warmem PBS und injizieren über die Schwanzvene. </li><li> Zur Berechnung der exakten Eingabe-Verhältnis (idealerweise nahe 1) zu retten 5-10 mL des injizierten Zellsuspension und mit 300 ml PBS verdünnt und analysiert mittels FACS. </li></ol> 4. Die Analyse der T-Zell-Homing Obwohl Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten (zwischen 1 h und mehreren Tagen post T-Zell-Injektion) analysiert werden kann, ist Homing von gut-tropic T-Zellen am besten zwischen 12-24 h nach der Injektion dokumentiert. Längere Zeit Punkte erhöhen die möglichen Auswirkungen der anderen Variablen, die die endgültige Anzahl der Zellen / Kennzahlen, wie z. B. T-Zell-Apoptose und T-Zell-Ausstieg aus dem Gewebe. Nach den Mäusen eingeschläfert, Zellsuspensionen aus verschiedenen Geweben, unverzüglich isoliert werden, um Zelltod zu verringern, könnten die Auswirkungen auf den endgültigen Erträge und Ergebnisse. Gewebe von Interesse sind, Dünndarm, Dickdarm, Milz, Lymphknoten, Peyer-Plaques, Leber, Lunge und Blut. Wenn dieinjizierten T-Zellen sind bona fide gut-tropic T-Zellen, sollten sie zu Hause im Durchschnitt 5-10 mal besser (oder höher) auf die Dünndarmschleimhaut im Vergleich zu T-Zellen zu steuern. Allerdings sollten auch andere Gewebe wie Blut und der Milz, nicht zeigen eine bevorzugte T-Zell-Migration. Isolierung von Lymphozyten aus der intestinalen Lamina propria und der intraepithelialen Fach wurde bereits 5 beschrieben. <ol><li> FACS-Färbung: Die Proben werden erneut suspendiert in Abhängigkeit von der Anzahl der Zellen gesammelt, bei einer Dichte nicht höher als 3,0 x 10 6 Zellen / ml. Wenn kongene CD45.1 + oder Thy1.1 + Mäusen als Empfänger verwendet wurden, werden die Zellen mit den entsprechenden kongene Marker (zB CD45.2 oder Thy1.2) mit einigen Linie Marker (zB TCRbchain, CD4, CD8 kombiniert gebeizt , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li> Während FACS-Analyse werden die Zellen gated auf der kongene Marker (zB CD45.1) und dann auf die spezifischen Linie Marker (z. B. CD4/CD8) und analysiert das Verhältnis zwischen CMTMR und CFSE-positiven Zellen. </li><li> Die Daten werden in der Regel als Homing Index (HALLO), die als das Verhältnis CFSE / CMTMR (oder CMTMR / CFSE) in jedem Gewebe durch die entsprechende Eingabe-Verhältnis (siehe unten) dividiert wird zum Ausdruck gebracht. Wenn die Eingabe-Verhältnis ist sehr nahe bei 1, dann das Gewebe Verhältnisse werden entsprechend der HALLO. </li></ol> HALLO = CFSE Gewebe / CMTMR Gewebe: CFSE Input / CMTMR Eingang Blut sollte auch analysiert, um festzustellen, ob beide T-Zell-Populationen gleichermaßen in den Kreislauf vertreten oder, wenn man T-Zell-Population ist in Bezug auf die anderen (z. B. durch bevorzugte Trapping in der Lunge / Leber oder durch eine verminderte Lebensfähigkeit) verringert werden. Dies könnte geschehen, wenn Vergleich naiv oder Ruhestätten Memory T-Zellen im Vergleich zu den zuletzt aktivierten Effektor-T-Zellen, da diese möglicherweise in einem größeren Ausmaß in die Lunge abgefangen werden. Wenn die HALLO im Blut ist deutlich anders als 1, kann man HALLO normalisieren im Gewebe durch die HALLO im Blut. Das Blut kann via Herzpunktion von Mäusen betäubt (mit Avertin oder Isofluoran vor Euthanasie) bezogen werden und sollten zweimal mit ACK-Puffer lysiert werden, bevor Sie es für FACS-Färbung. Blut Normalisierung = HALLO Gewebe / HALLO Blut 5. Repräsentative Ergebnisse Empfänger-Mäuse (Thy1.1 +) wurden euthanized18h post-Injektion. Zellsuspensionen wurden aus der Milz, periphere Lymphknoten (PLN), mesenterialen Lymphknoten (MLN) und Dünndarm Lamina propia (LP) erzeugt. Danach wurden die Zellen für Thy1.2 und CD8 gefärbt und dann analysiert durch FACS durch Gating auf lebensfähigen Thy1.2 + CD8 +-Zellen, die schließlich für das Verhältnis zwischen CMTMR +-Zellen (gut-tropic T-Zellen) und CFSE wurden analysiert + Zellen (Kontrolle T-Zellen) durch die Eingabe dividiert. Die Ergebnisse können wie in Abbildung 2, in der es versteht sich, dass gut-tropischen und Kontrolle T-Zellen auch für die Milz (HALLO nahe zu 1, gekennzeichnet mit einer roten Linie) homed kann gezeigt werden. Im Gegensatz dazu gut-tropic T-Zellen etwa 10-mal effizienter auf die LP migriert im Vergleich zu T-Zellen zu steuern. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1:. Schematische Darstellung der Erzeugung und Kennzeichnung von gut-tropischen und nicht-gut tropic T-Zellen T-Zellen sind aus Wildtyp-Mäusen isoliert und aktiviert mit anti-CD3/anti-CD28 und in der Gegenwart oder Abwesenheit von 100-200 nm alle - trans-Retinsäure (RA). Nach 4-5 Tagen RA-behandelten T-Zellen erwerben die Expression von gut Homing-Rezeptoren CCR9 und a4b7. Dann werden gut-tropischen und Kontrolle T-Zellen differentiell mit CFSE oder CMTMR gekennzeichnet, gewaschen, gemischt im Verhältnis 1:1 und in eine Empfänger-Maus über die Schwanzvene. Einige markierten Zellen werden verwendet, um die CFSE / CMTMR Eingabe-Verhältnis (sollte nahe bei 1 liegen) zu bestimmen. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2:. Beispiel Homing Analyse Mäuse analysiert 12-18 h post T-Zell-Injektion und Einzelzell-Suspensionen aus den Organen von Interesse sind, erhalten. Die Zellen werden mit anti-Thy1.2 (kongene Marker) plus anti-CD8 und dann Thy1.2 gebeizt + CD8 + T-Zellen sind für das Verhältnis von CMTMR analysiert + und CFSE + Zellen in jedem Gewebe durch FACS. Das Gewebe CMTMR / CFSE Verhältnisse sind dann durch den Eingang CMTMR / CFSE Verhältnis normalisiert, um die Homing-Indizes (HALLO) zu erhalten. In diesem Beispiel CMTMR + und CFSE + Zellen sind gut-tropischen und Kontrolle Effektor-T-Zellen.

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	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

Obwohl Homing Experimente sehr wertvolle Informationen über die Migration des gesamten Zell-Populationen in einem bestimmten Gewebe zu schaffen, sollte es im Auge behalten werden, dass diese Tests nicht direkt analysieren endothelialen Adhäsion und daher nicht zu diskriminieren, in der Stufe (n) des mehrstufigen Haftung Kaskade (Tethering / Walz-, Aktivierungs-oder Kleben) eine gegebene Homing-Rezeptor wirkt. Der Goldstandard der spezifischen Rolle der Homing-Rezeptoren in die Haftung Kaskade zu definieren, ist Intrav...

Tiere: C57BL / 6 Mäuse werden häufig für T-Zell-Isolierung verwendet. Darüber hinaus sind CD45.1 und Thy1.1 kongene Stämme durch Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) zur Verfügung. Kulturmedien: IMDM (Iscove-Modified Dulbecco Medium + L-Glutamin + Hepes) plus 10% Hitze-inaktiviertes FBS (fötales Rinderserum, niedrige Endotoxin, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA) mit 100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin (HyClone Antibiotika, Waltham, MA), 0,5 mg / ml Fungizone / Amphotericin B (Gibco) und 50 mM b-Mercaptoethanol. ACK Red Blood Cell Lysis-Puffer (RBC, 10 mM KHCO 3, 150 mM NH 4 Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), auf pH 7,2-7,4 und bei Raumtemperatur lagern anpassen). PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA). Durchflusszytometrie (FACS) Medien (PBS oder IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). Wenn Färbung mit Selectin-Fc-Chimären, Medien mit 2 mM Ca + + soll in allen Stufen (einschließlich FACS-Akquisition) verwendet werden. IMDM ist in diesem Fall empfohlen. T-Zell-Kennzeichnung und adoptiven Transfer: CFSE (Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester), CMTMR ((5 - (und-6 )-((( 4-Chlormethyl) benzoyl) amino) Tetramethylrhodamin) von Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). 1000 x Vorräte sollten in DMSO hergestellt werden (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) und bei -20 ° C. Polyklonale T-Zell-Aktivierung: 24-well oder 96-well-Platten (Gewebe-Kultur behandelt, Polystyrol, mit flachem Boden mit Deckel, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) für 2 Stunden bei 37 ° C mit 50 ml PBS, jeweils inkubiert , mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörper (10 mg / ml). Dann werden Kulturplatten zweimal mit PBS gewaschen und sofort für die T-Zell-Kultur verwendet. Alternativ können Dynabeads mit anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) beschichtet für T-Zell-Aktivierung statt Platte gebundene Antikörper verwendet werden. Durchflusszytometrie (FACS) Färbung: polyklonale Aktivierung: CD3 (1452C11), CD28 (37,51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-Homing-Rezeptoren: gereinigtes CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), Isotyp-Kontrolle (IgG2a, k). Skin-Homing-Rezeptoren: P-Selektin-Fc (gereinigtes Maus P-Selectin - IgG-Fusionsprotein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-Selektin-Fc (rekombinantes Maus E-Selectin/Fc Chimera, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN) plus entsprechende sekundäre Reagenz Ziege F (ab &#39;) 2 Anti-Human-IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). All-trans-Retinsäure (Sigma, St. Louis, MO) wird in absolutem Ethanol oder DMSO mit einer gelben Glühbirne oder eine indirekte Lichtquelle während der Vorbereitung resuspendiert. Shop-Aliquots in Glasflaschen bei -80 ° C und vor Licht geschützt zu allen Zeiten. Synthetische RAR-Agonisten: AM80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

Um ihre Funktion ausüben Lymphozyten benötigen, um das Blut zu verlassen und wandern in verschiedenen Geweben im Körper. Lymphozyten-Adhäsion an Endothelzellen und Gewebe Extravasation ist ein mehrstufiger Prozess durch verschiedene Adhäsionsmoleküle gesteuert (Homing-Rezeptoren) auf Lymphozyten und ihre jeweiligen Liganden (Addressine) auf Endothelzellen 1 2 angezeigt ausgedrückt. Obwohl die Funktion dieser Adhäsionsrezeptoren teilweise untersucht werden können ex vivo, der ultimative Test für ihre physiologische Relevanz ist, ihre Rolle bei der In-vivo-Lymphozyten Adhäsion und Migration zu bewerten. Intravitalmikroskopie (IVM) und Homing-Experimente: Zwei sich ergänzende Strategien sind für diesen Zweck verwendet worden. Obwohl IVM war wesentlich an den genauen Anteil der spezifischen Adhäsionsrezeptoren während die Haftung Kaskade in Echtzeit und in verschiedenen Geweben zu definieren, IVM zeitaufwendig und arbeitsintensiv ist, ist es oft erfordert die Entwicklung von anspruchsvollen chirurgischen Techniken, braucht es vor Isolierung von homogenen Zellpopulationen und es erlaubt die Analyse von nur einem Gewebe / Organ zu einem bestimmten Zeitpunkt. Im Gegensatz dazu ermöglichen wettbewerbsfähige Homing Experimente die direkte und gleichzeitige Vergleich bei der Migration von zwei (oder sogar mehr) Zellpopulationen in der gleichen Maus und sie erlauben auch die Analyse von vielen Geweben und einer hohen Anzahl von Zellen in das gleiche Experiment. Hier beschreiben wir die klassischen kompetitiven Homing-Protokoll verwendet, um den Vorteil / Nachteil eines bestimmten Zelltyp zu Hause, um spezifische Gewebe zu bestimmen, wie ein Steuerelement Zellpopulation verglichen. Wir entschieden uns für die Migration von gut-tropic gegenüber nicht gut-tropic T-Zellen zeigen, da die Darmschleimhaut ist die größte Körperoberfläche in Kontakt mit der äußeren Umgebung und es ist auch die extra-lymphatischen Gewebes mit den besten definierten wandernde Anforderungen . Darüber hinaus haben neuere Arbeiten festgestellt, dass die Vitamin-A-Metaboliten all-trans-Retinsäure (RA) die wichtigsten molekularen Mechanismus für die Induktion gut-spezifische Adhäsion Rezeptoren (Integrine a4b7and Chemokinrezeptor CCR9) auf Lymphozyten ist. So können wir ohne weiteres erzeugen eine große Anzahl von gut-tropischen und nicht gut-tropic Lymphozyten ex vivo durch Aktivierung von T-Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von RA, bzw., was schließlich in der Wettbewerbssituation Homing hier beschriebenen Experimente verwendet werden.

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Competitive Homing Experimente erlauben die direkte Beurteilung der wandernde Eigenschaften von zwei verschiedenen Zellpopulationen in einem einzigen Mausklick. Hier veranschaulichen wir dieses Verfahren durch einen Vergleich der Migration von ex vivo generierten gut-tropic versus nicht-gut tropic T-Zellen.

Competitive Homing-Assays auf Gut-trope T-Zell-Migration Study

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

competitive-homing-assays-to-study-gut-tropic-t-cell-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Competitive Homing Experimente erlauben die direkte Beurteilung der wandernde Eigenschaften von zwei verschiedenen Zellpopulationen in einem einzigen Mausklick. Hier veranschaulichen wir dieses Verfahren durch einen Vergleich der Migration von ex vivo generierten gut-tropic versus nicht-gut tropic T-Zellen.

Serie: Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Eine quantitative Auswertung der Zellmigration durch die Phagokinetic Spur Motilität Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Transplantation von Haut-Schwanz zu allogene CD4-T-Zellantworten in Mäusen untersucht

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bazillus Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

Mit Röntgenkristallographie, Biophysik, und funktionelle Assays zur Bestimmung der Mechanismen, die T-Zell-Rezeptor-Erkennung von Krebs-Antigene

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Eine neuartige In-vitro- Wunde heilende Assay Zellwanderung bewerten

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...