CPA est soutenu par une bourse de la maladie de Crohn S &amp; Colitis Foundation of America (CCFA). JRM est soutenu par des subventions de CCFA, le Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (HGM), dans le Massachusetts Life Science Center (MLSC) et le Prix du directeur des NIH s Innovateur Nouvelle.

1. Génération ex vivo de cellules T gut-homing et de contrôle (voir Figure 1) <ol><li> Isoler splénocytes en écrasant une rate de souris de type sauvage. Resuspendre la suspension des cellules dans du PBS et centrifuger pendant 5 &#39;à 400 x g. Enlever le surnageant et lyser les globules rouges par la remise en suspension du culot cellulaire dans 4 ml de tampon de lyse ACK pendant 2-3 minutes. Après cela, ajoutez 5 ml de PBS. Centrifuger pendant 5 &#39;à 400 xg et retirer le surnageant. </li><li> Resuspendre splénocytes total à 1 x 10 6 / ml en IMDM + 10% de FBS + 50 mM de 2-mercaptoéthanol + pénicilline / streptomycine (IMDM complet). Séparer les cellules en deux groupes, dont l&#39;un est complété par RA (ou synthétiques RAR-agonistes, tels que AM80 ou Am580) à une concentration finale de 100-200 Nm 3. Les cellules T activées en présence de la PR ou RAR-agonistes réguler positivement a4b7and CCR9 et deviendra l&#39;intestin tropisme des cellules T, tandis que les cellules T activées, sans AR devenir des cellules T de contrôle. </li><li> Ajouter de 1,5 à 2,0 ml de la suspension cellulaire dans chaque puits d&#39;une plaque de 24 puits préalablement revêtu d&#39;anti-CD3 (10 mg / ml) et anti-CD28 (10 mg / ml) et incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2 (pour le revêtement de la plaque ajouter 500 ml / puits d&#39;anticorps anti-CD3 et anti-CD28 dans le PBS et incuber pendant 2 heures à 37 ˚ C et puis laver deux fois avec 2 ml de PBS). </li><li> Afin d&#39;éviter une stimulation excessive des cellules T, après 2-3 jours de transférer les suspensions de cellules dans un nouveau non couché de 24 puits à plaques. Incuber pendant 2-3 jours supplémentaires. Selon la densité cellulaire et la prolifération des médias pourrait devenir acide (jaune), auquel cas il pourrait être nécessaire de remplacer la moitié des médias avec IMDM complet frais. Récolter les cellules après 4-5 jours (à compter du jour 0). </li><li> Typiques rendements finaux sont 1-2 x 10 6 cellules T effectrices / puits. Par conséquent, un minimum de 9-12 puits de chaque cellules T gut-tropic et le contrôle des cellules T devrait être plaquées afin de se retrouver avec 10-20 x 10 6 cellules T par condition. </li></ol> 2. Analyse de l&#39;intestin-homing récepteurs sur les cellules T activées Après 4-5 jours de culture, nous devrions observer une forte expression de récepteurs gut-homing a4b7and CCR9 sur les cellules T activées en présence d&#39;agonistes de la PR ou RAR, tandis que le contrôle des cellules T devrait exprimer des niveaux très bas de ces quatre récepteurs. La cytométrie en flux (FACS) analyse. <ol><li> Recueillir entre 0,2 à 0,5 x10 6 cellules et centrifuger pendant 5 min à 300 g à 4 ° C. </li><li> Incuber avec l&#39;anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) et anti-CD8-PerCP pendant 15 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Après l&#39;incubation, centrifuger pendant 5 min à 300 g à 4 ° C. Lavez et remettre en suspension les cellules dans du tampon coloration et d&#39;analyser par FACS. </li></ol> 3. Marquage des cellules T avec des cellules CFSE trackers et CMTMR <ol><li> Gardez toutes les solutions à 37 ° C avant de commencer. Laver l&#39;intestin tropisme des cellules T (a4b7 Haute CCR9 élevé) et le contrôle des cellules T (a4b7 Basse / Nég CCR9 Basse / Nég) à deux reprises avec du PBS pour éliminer le sérum. Ajuster la concentration de cellules T à 10-15 x 10 6 / ml dans le PBS. </li><li> Ajouter CFSE (carboxyfluorescéine succinimidyl ester) ou CMTMR (chlorométhyl-benzoyl-amino-tétraméthylrhodamine) fluorophores soit gut-tropic T et le contrôle des cellules T à une concentration finale de 5 mM et 10 mM, respectivement, doucement vortex et incuber pendant 20 min à 37 ° C. Il est recommandé d&#39;échanger les marquages ​​dans le même ou dans une expérience séparée afin d&#39;exclure les éventuels effets intrinsèques de fluorophores sur la migration des lymphocytes T. </li><li> Après l&#39;incubation, éteindre avec 1 volume de FBS et incuber pendant 1-5 min à température ambiante. Diluer 10 fois avec PBS et centrifuger chaude pendant 5 min à 300 g. Laver deux fois avec du PBS et remettre en suspension dans IMDM complet. </li><li> Idéalement, 10-20 x 10 6 cellules T de chaque population doit être mélangé dans un rapport 1:1 et ensuite centrifugé à 300 xg pendant 5 min. Enfin, remettre en suspension les cellules dans 200 à 250 ml d&#39;eau tiède PBS et injecter dans la veine de la queue. </li><li> Pour calculer le ratio d&#39;entrée exacte (idéalement proche de 1) sauver 5-10 mL de la suspension cellulaire injecté et diluer avec 300 ml de PBS et d&#39;analyser par FACS. </li></ol> 4. L&#39;analyse des cellules T homing Bien que les souris peuvent être analysés à différents temps (entre 1 h et plusieurs jours après l&#39;injection de cellules T), domiciliation des cellules T à tropisme intestinal sont les mieux documentées entre 12-24 h post-injection. Points de temps plus augmenter les effets potentiels des autres variables affectant la dernière cellule numéros / ratios, tels que l&#39;apoptose des cellules T et la sortie des cellules T à partir des tissus. Après les souris sont euthanasiées, les suspensions de cellules de différents tissus doivent être isolés, sans délai, afin de diminuer la mort cellulaire, ce qui pourrait affecter les rendements finaux et les résultats. Les tissus d&#39;intérêt sont l&#39;intestin grêle, côlon, rate, ganglions lymphatiques, les plaques de Peyer, le foie, les poumons et le sang. Si lesont injecté des cellules T sont de bonne foi l&#39;intestin tropisme des cellules T, ils devraient à domicile, en moyenne de 5-10 fois mieux (ou supérieur) à la muqueuse intestin grêle par rapport au contrôle des cellules T. Toutefois, d&#39;autres tissus, tels que le sang et la rate, ne doit pas présenter une migration préférentielle des cellules T. Isolement des lymphocytes de la lamina propria intestinale et le compartiment intra-épithéliale a été décrit précédemment 5. <ol><li> Coloration FACS: Les échantillons sont remis en suspension en fonction du nombre de cellules recueillies, à une densité ne dépassant pas 3,0 x 10 6 cellules / ml. Si congéniques CD45.1 + ou + Thy1.1 souris ont été utilisés en tant que bénéficiaires, les cellules sont colorées avec le marqueur correspondant congéniques (par exemple, ou de CD45.2 Thy1.2) combiné avec quelques marqueurs lignée (par exemple, TCRbchain, CD4, CD8 , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li> Lors de l&#39;analyse FACS, les cellules sont déclenchées sur le marqueur congéniques (par exemple CD45.1) et ensuite sur les marqueurs de la lignée spécifique (par exemple CD4/CD8) et analysés pour les rapports entre les cellules CFSE CMTMR positif. </li><li> Les données sont généralement exprimés comme l&#39;indice Homing (HI), qui est calculé comme le ratio de CFSE / CMTMR (ou CMTMR / CFSE) dans chaque tissu, divisé par le ratio d&#39;entrée correspondant (voir ci-dessous). Si le ratio d&#39;entrée est très proche de 1, alors les ratios de tissus sera équivalente à l&#39;HI. </li></ol> HI CFSE = tissu / CMTMR tissus: CFSE entrée / CMTMR entrée Le sang doit également être analysée afin de déterminer si les deux populations de cellules T sont également représentés dans la circulation ou si une population de cellules T est diminué rapport à l&#39;autre (par exemple, par le piégeage préférentiel dans les poumons / foie ou par la viabilité diminué). Cela peut arriver lorsque l&#39;on compare naïfs ou lymphocytes T mémoire par rapport récemment activé les lymphocytes T effecteurs, puisque ces derniers pourraient être piégés dans une plus grande mesure dans les poumons. Si le HI dans le sang est significativement différente de 1, on peut normaliser HI dans les tissus par le HI dans le sang. Le sang peut être obtenu par ponction cardiaque chez la souris anesthésiée (avec l&#39;euthanasie ou Avertin isofluorane préalable) et devrait être lysées à deux reprises avec le tampon ACK avant de l&#39;utiliser pour la coloration FACS. La normalisation de sang = HI tissu / HI sang 5. Les résultats représentatifs Souris receveuses (Thy1.1 +) ont été par injection euthanized18h cellule post. Les suspensions cellulaires ont été générées à partir de la rate, ganglions lymphatiques périphériques (PLN), les ganglions mésentériques (MLN) et les petits propia lamina intestin (LP). Après que les cellules ont été colorées pour Thy1.2 et CD8 et ensuite analysées par FACS par gating sur les cellules viables Thy1.2 + + CD8, qui ont finalement été analysés pour le ratio entre les cellules + CMTMR (gut-tropic cellules T) et CFSE + cellules (contrôle des cellules T) divisé par le ratio d&#39;entrée. Les résultats peuvent être affichés comme le montre la figure 2, dans lequel il peut être apprécié que gut-tropic et le contrôle des cellules T hébergés également à la rate (HI proches à1, indiqué par une ligne rouge). En revanche, l&#39;intestin tropisme des cellules T migré environ 10 fois plus efficacement à la SEC par rapport au contrôle des cellules T. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure1:. Schéma montrant la production et l&#39;étiquetage des boyaux à tropisme intestinal et non des cellules T Tropic cellules T sont isolés de souris de type sauvage et activé avec anti-CD3/anti-CD28 et dans la présence ou l&#39;absence de tous les 100-200 nm - trans rétinoïque (RA). Après 4-5 jours de PR traités lymphocytes T acquièrent l&#39;expression de l&#39;intestin récepteurs homing CCR9 et a4b7. Ensuite, l&#39;intestin et le contrôle à tropisme des cellules T sont différentiellement étiquetés avec CFSE ou CMTMR, lavés, mélangés dans un rapport 1:1 et injecté dans une souris receveuse via la veine de la queue. Certaines cellules marquées sont utilisées pour déterminer le ratio d&#39;entrée CFSE / CMTMR (qui devrait être proche de 1). <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2:. Souris Exemple d&#39;analyse de homing analysé 12-18 h après l&#39;injection de lymphocytes T et des suspensions cellulaires simples sont obtenus à partir des organes de l&#39;intérêt. Les cellules sont colorées avec des anti-Thy1.2 (marqueur congéniques) et anti-CD8 + et ensuite Thy1.2 cellules T CD8 + sont analysés pour le ratio de CMTMR + et + cellules CFSE dans chaque tissu par FACS. Le tissu CMTMR / CFSE ratios sont ensuite normalisés par l&#39;entrée CMTMR / CFSE rapport pour obtenir les indices de homing (HI). Dans ce + CMTMR exemple et CFSE + sont des cellules intestinales et les cellules-tropique de contrôle T effecteurs, respectivement.

<ol>
	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

Même si des expériences homing fournir des informations très précieuses sur la migration des populations de cellules au total dans tout tissu donné, il faut garder à l&#39;esprit que ces essais ne concernent pas directement l&#39;analyse d&#39;adhérence endothéliales et donc ne soient pas discriminatoires dans lequel l&#39;étape (s) de l&#39;adhésion à plusieurs étapes cascade (tethering / roulement, l&#39;activation ou de coller) un récepteur donné homing agit. L&#39;étalon-or pour définir le rôle spé...

Animaux: souris C57BL / 6 sont couramment utilisés pour l&#39;isolement de lymphocytes T. En outre, CD45.1 et Thy1.1 souches congéniques sont disponibles par le biais de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Milieux de culture: IMDM (milieu Iscove Dulbecco modifié par + L-glutamine + HEPES) majoré de 10% de la chaleur de FBS inactivé (sérum de veau fœtal, l&#39;endotoxine bas, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA), supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine (antibiotiques HyClone, Waltham, MA), 0,5 mg / ml fungizone / amphotéricine B (Gibco), et 50 mM b-mercaptoéthanol. ACK tampon lyse des globules rouges (RBC, 10 mM de KHCO3, 150 mM de NH 4 Cl, EDTA 0,1 mM, pH 8,0), ajuster le pH à 7.2 à 7.4 et stocker à température ambiante). PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA). La cytométrie en flux (FACS) médias (PBS ou IMDM + 2% de FBS + EDTA 5 mM). Lorsque coloration utilisant la sélectine-Fc chimères, des médias avec 2 mM de Ca + + doit être utilisé dans toutes les étapes (y compris l&#39;acquisition FACS). IMDM est recommandé dans ce cas. Marquage des cellules T et le transfert adoptif: CFSE (diacétate de carboxyfluorescéine, succinimidyl ester), CMTMR ((5 - (et-6 )-((( 4-chlorométhyl) benzoyl) amino) tétraméthylrhodamine) de Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). 1000 x stocks doit être faite dans le DMSO (5 CFSE mm, 20 mm CMTMR) et conservés à -20 ° C. Polyclonaux activation des cellules T: 24-puits ou plaques de 96 puits (de culture de tissus traités, polystyrène, fond plat avec couvercle, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) sont incubées pendant 2 heures à 37 ° C avec 50 ml de PBS, respectivement , contenant des anti-CD3 et anti-CD28 (10 mg / ml chacun). Ensuite, des plaques de culture sont lavées deux fois avec du PBS et utilisées immédiatement pour la culture cellulaire T. Alternativement, Dynabeads recouvert d&#39;anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) peut être utilisé pour l&#39;activation des cellules T au lieu de la plaque liée anticorps. La cytométrie en flux (FACS) coloration: activation polyclonale: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage MAB: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing récepteurs: CCR9 purifiée (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, Californie), a4b7 (LPAM-1/DATK3), isotype contrôle (IgG2a, k). Peau-homing récepteurs: la P-sélectine-Fc (purifiée souris P-sélectine - protéine de fusion IgG, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-sélectine-Fc (E-Selectin/Fc recombinant de souris chimère, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN) et correspondante F secondaires de chèvre réactif (ab &#39;) 2 anti-IgG humaine R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). Acide tout-trans rétinoïque (Sigma, St. Louis, MO) est remis en suspension dans l&#39;éthanol absolu ou le DMSO en utilisant une ampoule jaune ou une source indirecte de la lumière lors de la préparation. Aliquotes Conserver dans des flacons en verre à -80 ° C et protégé de la lumière à tout moment. RAR-agonistes synthétiques: AM80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

Afin d&#39;exercer leur fonction de lymphocytes besoin de quitter le sang et migrent dans les différents tissus de l&#39;organisme. L&#39;adhérence des lymphocytes aux cellules endothéliales et l&#39;extravasation des tissus est un processus en plusieurs étapes contrôlées par des molécules d&#39;adhérence différentes (récepteurs homing) exprimée sur les lymphocytes et leurs ligands respectifs (adressines) affiché sur les cellules endothéliales 1 2. Même si la fonction de ces récepteurs d&#39;adhésion peut être partiellement étudiée ex vivo, le test ultime pour leur pertinence physiologique est d&#39;évaluer leur rôle au cours de l&#39;adhérence des lymphocytes in vivo et la migration. Deux stratégies complémentaires ont été utilisés à cette fin: la microscopie intravitale (IVM) et des expériences homing. Bien IVM a été essentielle pour définir la contribution précise de récepteurs d&#39;adhésion spécifiques lors de la cascade d&#39;adhérence en temps réel et dans différents tissus, l&#39;IVM prend du temps et de main-d&#39;oeuvre, il faut souvent le développement de techniques sophistiquées de chirurgie, il a besoin d&#39;isolement avant d&#39;homogénéité populations de cellules et il permet l&#39;analyse d&#39;un seul tissu / organe à un moment donné. En revanche, la compétitivité des expériences homing permettre la comparaison directe et simultanée dans la migration de deux (ou même plus) sous-ensembles de cellules dans la même souris et ils permettent également l&#39;analyse de nombreux tissus et d&#39;un nombre élevé de cellules dans la même expérience. Nous décrivons ici les classiques du protocole concurrentiel homing utilisé pour déterminer l&#39;avantage / désavantage d&#39;un type cellulaire donné à la maison à des tissus spécifiques par rapport à une population de cellules de contrôle. Nous avons choisi d&#39;illustrer les propriétés migratoires des intestins à tropisme intestinal par rapport aux non-tropique des cellules T, parce que la muqueuse intestinale est la plus grande surface du corps en contact avec l&#39;environnement extérieur et il est aussi le tissu extra-lymphoïdes avec les exigences mieux définies migrateurs . Par ailleurs, des travaux récents ont établi que le métabolite de la vitamine A acide tout-trans rétinoïque (RA) est le principal mécanisme moléculaire responsable de l&#39;induction récepteurs d&#39;adhésion intestinale spécifique (récepteur de chimiokine intégrine a4b7and CCR9) sur les lymphocytes. Ainsi, nous pouvons facilement générer un grand nombre d&#39;ex vivo tropisme intestinal et non gut-tropic lymphocytes T en activant les cellules en présence ou en absence de RA, respectivement, ce qui peut être finalement utilisés dans les expériences décrites ici concurrentiel homing.

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration at JoVE.com

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Concurrentiels expériences homing permettent d&#39;évaluer directement les propriétés migratoires des deux populations cellulaires différentes dans une seule souris. Ici, nous illustrons cette procédure en comparant la migration des ex vivo généré gut-tropic versus non-intestinale des cellules T tropiques.

Les analyses concurrentielles Homing d&#39;étude Gut tropisme migration des lymphocytes T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

competitive-homing-assays-to-study-gut-tropic-t-cell-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K vues.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Concurrentiels expériences homing permettent d'évaluer directement les propriétés migratoires des deux populations cellulaires différentes dans une seule souris. Ici, nous illustrons cette procédure en comparant la migration des ex vivo généré gut-tropic versus non-intestinale des cellules T tropiques.

Vidéo: Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Human T isolement des lymphocytes, de la Culture et de l&#39;analyse des migrations In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Recherche

Immunologie et infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

L&#39;imagerie non invasive des Homing leucocytes et des migrations In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Une évaluation quantitative de la migration cellulaire par le test de motilité piste Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Transplantation de queue peau d&#39;étudier allogéniques CD4 réponses des cellules T chez la souris

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Un test basé CFSE pour étudier la migration de la peau murine cellules dendritiques dans les ganglions lymphatiques de drainage lors de l&#39;infection avec<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

Utilisation de cristallographie aux rayons X, biophysique, et des tests fonctionnels pour déterminer les mécanismes d&#39;administration des lymphocytes T Reconnaissance des récepteurs du cancer Antigènes

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Un roman In Vitro de la plaie guérison test afin d’évaluer la Migration cellulaire

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

Un protocole de boursouflure d’aspiration pour étudier les cellules T humaines rappel Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Adaptation des dosages de cytotoxicité in vivo à l’étude de l’immunodominance dans des réponses cellulaires spécifiques à la tumeur et aux lymphocytes T

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...