在 Vivo 增强的古特-霍姆调节 T 细胞诱导

该协议描述了一种潜在的新型治疗策略，可以很容易地修改为人类应用。该技术可直接增强周围淋巴组织中肠道宿主调节T细胞的诱导，即使在高度促进炎症的环境中也可以稳定实施。这些技术还可用于研究活性维生素D和维生素A在周围免疫系统中的作用。

此视觉演示将为生成高质量工程树突细胞提供分步说明，这些树突状细胞对于该技术的成功至关重要。首先在150~25毫米培养板的CM-10-D细胞培养基20毫升中，将10倍至7个293T细胞，在37摄氏度和5%的二氧化碳下进行24小时孵育。第二天，加入1.62毫升新鲜准备的双浓缩HBS溶液，9.5微克的包络质粒，17.5微克的包装质粒，和27微克的LENTI-CYP-ALDH质粒到50毫升的康体管。

将管内内容物的最终体积与水一起带到 3.0375 毫升，然后滴水添加 202.5 微升的两个摩尔氯化钙。将DNA沉淀混合物在室温下保持20分钟，偶尔混合，然后按293T培养成分滴入3.24毫升溶液，同时轻轻旋转盘子。将盘子放在培养箱中24小时，然后用PBS轻轻清洗每个盘子，用CM-4-D培养培养剂喂养细胞。

再培养24小时后，将超级钠收获到无菌瓶中，储存在4至8摄氏度，用新鲜的CM-4-D培养基再喂细胞24小时。第四天，再次收获超级钠，将第三天和第四天的超级钠应变到0.45微米过滤器。然后，通过离心24小时集中VSV-G伪型病毒。

第二天，把超级纳特人去。让管子在无菌生物安全柜中的纸巾上排干几分钟，然后将颗粒重新排放在 33.3 微升的无菌 PBS 中，每培养皿含有 5%甘油。对于骨髓衍生的树突状细胞生成，将从BALB/c小鼠收获的头骨和股骨放入含有新鲜培养基的100×20毫米培养皿中。

使用解剖剪刀和钳子从骨骼中去除任何组织。当所有骨骼都清洁干净后，使用剪刀切割每块骨头的两端，以暴露骨髓腔。使用装有 30 量针的 10 毫升注射器用 10 毫升新鲜培养培养剂冲洗每根骨骼，在 15 毫升管中采集骨髓。

收集所有骨髓后，通过离心沉淀骨髓，将颗粒重新悬浮在两毫升红细胞解液缓冲液中。在室温下4至5分钟后，偶尔摇晃，停止与10毫升细胞培养剂的反应，通过离心收集细胞。将颗粒重新在 CM-10-R 培养基的 10 毫升中，用于计数，并调整细胞的 1 倍至 CM-10-R 培养培养基浓度每毫升 6 个细胞。

接下来，每毫升向细胞中加入100个单位的重组喃喃 GM-CSF 和每毫升IL-410个单位。将四毫升细胞板放入六孔培养板的单个孔中，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育48小时。在孵育结束时，轻轻吸气非粘附细胞。

在将细胞返回到细胞培养箱48小时之前，将补充的转基因-CSF和IL-4的新鲜培养剂添加到培养物中。在第二次孵育结束时，将非粘附骨髓衍生的树突状细胞收获到50毫升锥形管中进行离心。为了产生BMDC-CYP-ALDH细胞，每井浓度的CM-10-R培养基每500微升，每500微升的树突状细胞以1倍10至第六树突细胞重新暂停，将500微升细胞板板到新的六井培养板的每个井中。

在每个井中加入50微升的LENTI-CYP-ALDH病毒和每毫升蛋白胺8微克，然后将盘子放在培养箱中24小时。第二天，用新鲜培养基代替超级细胞，将盘子返回细胞培养箱24小时。在第二次孵化结束时，每毫升脂质糖可激活100毫微克，在收获前24小时进行功能分析。

与亲骨骨髓衍生的树突状细胞相比，BMDC-CYP-ALDH细胞表现出1-α-羟基酶的增强表达。在BMDC-CYP和BMDC-CYP-ALDH细胞培养中，维生素D活性形式的浓度比在亲骨髓衍生树突细胞和BMDC-ALDH细胞培养中观察到的浓度高约20倍。用基质处理的BMDC-CYP-ALDH细胞的荧光强度比用基质处理的亲骨髓衍生树突细胞平均荧光强度高约六倍。

这表明BMDC-CYP-ALDH细胞表达显著增强的视网膜去氢酶-2酶活性。DC2.4细胞处理25-羟基维生素D和视网膜不诱导Foxp3阳性CCR9阳性CD4阳性T细胞的丰度显著变化。相比之下，用25-羟基维生素D和视网膜治疗的DC2.4 CYP-ALDH细胞以浓度依赖的方式诱导数量显著增加的肠道调控T细胞。

此外，与内向注射控制细胞相比，DC CYP-ALDH细胞在内向BALB/c接受者动物注射后，也诱导foxp3阳性CCR9阳性C24阳性T细胞的数量显著增加。手术的成功取决于健康T细胞和正确制备的DNA混合物的制备。