本实验的总体目标是通过测量体外和体内肠道上皮细胞渗透性，研究上皮屏障功能障碍功能引起的疾病。此方法可以帮助回答肠道屏障功能领域的关键问题，例如与炎症性肠病相关的问题。该技术的主要优点是，肠道上皮细胞的渗透性可以在体外和体内进行评估。
这种技术的影响延伸到胃肠道疾病的治疗或诊断，因为肠道上皮屏障功能障碍功能障碍有助于这些疾病。虽然这种方法可以提供对肠道屏障功能的洞察，它也可以应用于其他系统，如药物毒性研究和其他细胞类型的屏障完整性。此方法的可视化演示至关重要，因为某些步骤很难学习。
现在可以通过文本描述来理解此方法的准确操作。首先，在具有中等的T75烧瓶中生长Caco-2bbe细胞。根据细胞密度定期喂料瓶。
当细胞是80%汇合时，取出培养基，使用1-2毫升无菌PBS，无需钙冲洗。加入1.5毫升的三辛-EDTA，轻轻摇动烧瓶。然后，在37摄氏度的培养箱中放置20分钟，不摇摆。
当细胞进行复数时，将含有多孔聚碳酸酯膜的插入物放入24个孔板中。然后将1毫升培养基加入基底室，基底室是膜的下部空间。在烧瓶中加入5毫升的培养，用力将细胞对瓶内移液5至10次，将培养成松散的单个细胞，或两到三个细胞团。
板 0.166 毫升的细胞进入膜的上部空间的腔室。然后在37摄氏度下孵育板长达三周。每周三次给细胞喂气，使用压力泵从每一个井的基底室小心地吸气介质。
然后轻轻地将一毫升介质滴入每个刀片的腔室。对于细胞因子研究，在跨皮电阻或TER测量前一天，用介质替换基底介质，每毫升干扰素伽马含有10毫微克。在实验当天，用每毫升TNF含有2.5或7.5毫微克的HSSS代替介质。
要校正仪表，请将校正电极插入输入端口并选择欧姆模式。然后使用螺丝刀调整 R 调整螺钉，直到仪表显示读数为 1，000 欧姆。在 70%乙醇中对电极进行消毒 15 至 30 分钟，让电极风干 15 秒。
然后在实验细胞培养基中冲洗电极。接下来，打开电源并选择欧姆模式。在保持电极垂直的同时，小心地将电极桥的长端放入基底室，确保它们接触碟子。
然后将短端放入腔室，确保它们位于介质表面之下，但位于组织培养物插入物之上。在细胞因子治疗后 0、1、2、3 和 4 小时测量样品和空白刀片的电阻。然后记录阻力。
要实现不同板格式的一致性，请计算电阻的产品和有效膜面积，如下所示。对于 24 孔插入，有效膜面积为 0.33 平方厘米。要诱发结肠炎，将 DSS 添加到自 <3>化水中，最终浓度为每体积 3.5% 的重量。
然后使用 DSS 溶液替换 8 周大雄性 C57 黑六只小鼠的笼子里的饮用水，总共 7 天。给常规饮用水没有 DSS 控制小鼠。第七天后，将 DSS 水切换到常规饮用水。
每天，体重小鼠，并评估根据疾病严重程度定义的临床分数四个参数：直肠脱垂，大便一致性，出血和活动。从这些参数中总结分数，以最终的临床评分。分析DSS治疗后7天结肠组织病理学状况，根据文本协议对小鼠实施安乐死后，分离结肠和结肠，测量结肠的长度。
从远端结肠中切下0.5厘米的段，将组织固定在含有10毫升10%甲醛的15毫升猎鹰管中。用分级乙醇和二甲苯清洗固定组织。然后将组织嵌入石蜡中，并切割六毫米部分，用于血氧素和 eosin 染色。
为了测量DSS诱导小鼠的上皮屏障渗透性，在DSS给给开始7天后，对小鼠禁食3小时。通过解套针，确保无菌，然后在无菌水中使用150微升每毫升80毫克，4千达吨 FITC dextran 对小鼠进行加气，并保留未使用的 FITC dextran，以测量血清采集后的标准曲线。接下来，对鼠标进行加权以进行渗透性计算。
四个小时后，通过IP注射麻醉小鼠后，通过缺乏反射和胡须运动确认适当的麻醉。然后把老鼠放在热块上五分钟。用一把剪刀将一厘米的尾巴夹住，从尾巴收集100微升血液，放入血清收集管中。
在10，000倍g和室温下旋转采集的血液10分钟。用水，稀释血清一到四。然后，要制定一个标准曲线，使用水来准备未使用的 FITC dextran 的稀释。
将血清和标准曲线样品添加到 96 个孔板中，每孔添加 100 微升。使用板读卡器，读取 485 和 528 发射时荧光。基于标准曲线计算渗透率值，并乘以四以校正稀释。
将 FITC dextran 的浓度除以权重以使值正常化。这有助于使如果小鼠生病并且体重减轻，FITC dextran 分娩的差异正常化。此处显示的 Caco-2bbe 细胞标有核和 F-actin 染色，以显示未分化和分化细胞之间的差异。
应力纤维在未分化的细胞中清晰可见。分化细胞的体积较小，核更大，应力纤维比未分化的细胞少。TNF 是通过 MLCK 依赖紧密结调节对肠道屏障损失的核心。
如图所示，TNF 以剂量依赖的方式显著降低 Caco-2bbe 单层 TER，这表明 TNF 增加了上皮渗透性。与最初的体重相比，使用 DSS 治疗的小鼠体重减轻很大。结肠炎的严重程度由直肠脱垂、大便一致性、出血和活动来评分。
沾染血氧素和 eosin 的结肠组织的横截面显示 DSS 治疗小鼠的结肠粘膜损伤。此外，在经过 DSS 治疗的小鼠中，结肠墓穴的长度以及结肠本身的长度也减少了。最后，与对照小鼠相比，经过DSS治疗的小鼠的 FITC dextran 染色水平大约增加了两倍。
在尝试此过程时，重要的是要记住通过标准化操作过程和利用统计方法来尽量减少错误。该技术开发后，为肠道屏障功能领域的研究人员探索模型生物体和细胞系中的胃肠道疾病铺平了道路。看完这段视频后，您应该对如何通过测量 TER、Gavaging FITC dextran 和观察形态和组体化学变化来确定肠道上皮渗透性有了很好的了解。
