L’objectif global de cette expérience est d’étudier les maladies causées par le dysfonctionnement épithélial de barrière en mesurant la perméabilité épithéliale intestinale de cellules in vitro et in vivo. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la fonction de barrière intestinale, telles que celles liées à la maladie inflammatoire de l’intestin. Le principal avantage de cette technique est que la perméabilité intestinale des cellules épithéliales peut être évaluée à la fois in vitro et in vivo.
Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie ou le diagnostic des maladies gastro-intestinales, parce que le dysfonctionnement épithélial intestinal de barrière contribue à ces maladies. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la fonction de barrière intestinale, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que des études de toxicité de drogue et l’intégrité de barrière d’autres types de cellules. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car certaines étapes sont difficiles à apprendre.
Un fonctionnement précis de cette méthode peut maintenant être compris par description textuelle. Pour commencer, faire pousser les cellules Caco-2bbe dans un flacon T75 avec moyen. Nourrissez les flacons régulièrement, selon la densité cellulaire.
Lorsque les cellules sont 80% confluent, enlever le milieu et utiliser 1-2 millilitres de PBS stérile sans calcium pour les rincer. Ajouter 1,5 millilitres de Trypsin-EDTA et faire basculer doucement le flacon. Ensuite, placez-le dans l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant 20 minutes, sans basculer.
Pendant que les cellules trypsinisent, placez des inserts contenant des membranes poreuses de polycarbonate dans 24 plaques de puits. Ajouter ensuite 1 millilitre de milieu de culture dans la chambre basale qui est l’espace inférieur de la membrane. Ajouter 5 millilitres de milieu au flacon, et pipette vigoureusement les cellules contre l’intérieur du flacon 5 à 10 fois, pour séparer la culture en cellules individuelles lâches, ou deux à trois touffes de cellules.
Plaque 0,166 millilitres des cellules dans la chambre apical qui est l’espace supérieur de la membrane. Puis incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant un jusqu’à trois semaines. Nourrissez les cellules trois fois par semaine, à l’aide d’une pompe à pression pour aspirer soigneusement le milieu du compartiment basal de chaque puits.
Puis égouttez doucement un millilitre de milieu dans la chambre apical de chaque insert. Pour les études de cytokine, un jour avant la résistance électrique transepithelial ou les mesures TER, remplacer le milieu basal par moyen, contenant 10 nanogrammes par millilitre d’interféron gamma. Le jour de l’expérience, remplacer le milieu par HBSS contenant 2,5 ou 7,5 nanogrammes par millilitre de TNF.
Pour corriger le compteur, insérez l’électrode de correction dans le port d’entrée et choisissez le mode Ohm. Ensuite, utilisez un tournevis pour régler la vis R Adjustment jusqu’à ce que le compteur affiche une lecture de 1000 ohms. Stériliser les électrodes dans 70% d’éthanol pendant 15 à 30 minutes et leur permettre de sécher à l’air libre pendant 15 secondes.
Rincez ensuite les électrodes dans le milieu expérimental de culture cellulaire. Ensuite, allumez la puissance et choisissez le mode Ohm. Tout en gardant les électrodes verticales, placez soigneusement les longues extrémités des ponts d’électrode dans la chambre basale, en s’assurant qu’ils touchent le plat.
Placez ensuite les extrémités courtes dans la chambre apical, en veillant à ce qu’elles restent sous la surface du milieu, mais au-dessus des inserts de culture tissulaire. Mesurer la résistance de l’échantillon et les inserts vierges à 0, 1, 2, 3 et 4 heures après le traitement par cytokine. Alors enregistrez la résistance.
Pour obtenir une cohérence entre les différents formats de plaques, calculez le produit de la résistance et la zone membranaire efficace comme indiqué ici. Pour 24 inserts de puits, la surface membranaire efficace est de 0,33 centimètre carré. Pour induire la colite, ajouter le DSS à l’eau autoclavée à une concentration finale de 3,5% de poids par volume.
Ensuite, utilisez la solution DSS pour remplacer l’eau potable dans les cages de 8 semaines mâle C57 noir six souris pour un total de sept jours. Donnez régulièrement de l’eau potable sans DSS pour contrôler les souris. Après le septième jour, passez l’eau DSS à l’eau potable ordinaire.
Chaque jour, pesez les souris et évaluez les scores cliniques tels que définis en fonction de la gravité de la maladie par quatre paramètres : prolapsus rectal, consistance des selles, saignements et activité. Résumez les scores de ces paramètres pour un score clinique final. Analyser l’état histopathologique des tissus du côlon sept jours après le traitement du DSS, après avoir euthanasié des souris selon le protocole du texte, isoler le côlon et le ccum, et mesurer la longueur du côlon.
Couper 0,5 centimètre segments du côlon distal, et fixer le tissu dans un tube de faucon de 15 millilitres contenant 10 millilitres de formaline 10% pendant la nuit. Laver les tissus fixes avec de l’éthanol et du xylène classés. Puis intégrer les tissus dans la paraffine et couper six sections millimétriques pour l’hématoxyline et la coloration de l’éosine.
Pour mesurer la perméabilité épithéliale de barrière chez les souris DSS-induites, sept jours après le début de l’administration de DSS, jeûnez les souris pendant trois heures. Autoclavez une aiguille de gavage pour assurer la stérilité, puis utilisez 150 microlitres de 80 milligrammes par millilitre quatre kilodalton FITC dextran dans l’eau stérile pour gaver les souris, et gardez le dextran FITC inutilisé pour mesurer la courbe standard après la collecte du sérum. Ensuite, pondération des souris pour le calcul de perméabilité.
Quatre heures plus tard, après avoir anesthésié les souris par injection IP, confirmer l’anesthésie appropriée par le manque de réflexes et de mouvement de moustache. Ensuite, placez les souris sur un bloc thermique pendant cinq minutes. À l’aide d’une paire de ciseaux, couper un morceau d’un centimètre de la queue et recueillir 100 microlitres de sang de la queue dans un tube de collecte de sérum.
Faites tourner le sang recueilli à 10 000 fois g et la température ambiante pendant dix minutes. Avec de l’eau, diluer le sérum un à quatre. Ensuite, pour faire une courbe standard, utilisez l’eau pour préparer les dilutions du dextran FITC inutilisé.
Ajouter 100 microlitres par puits du sérum et les échantillons de courbe standard dans 96 plaques de puits. À l’aide d’un lecteur de plaque, lisez la fluorescence à une excitation de 485 et une émission de 528. Calculez les valeurs de perméabilité en fonction de la courbe standard, et multipliez par quatre pour corriger la dilution.
Divisez la concentration de FITC dextran par le poids pour normaliser les valeurs. Cela aide à normaliser la différence dans l’accouchement par dextran FITC si les souris sont malades, et ont perdu du poids. Les cellules Caco-2bbe montrées ici ont été étiquetées avec des taches de noyaux et de F-actin pour montrer la différence entre les cellules indifférenciées et différenciées.
Les fibres de stress sont clairement visibles dans les cellules indifférenciées. Les cellules différenciées ont un volume plus faible, des noyaux plus grands et moins de fibres de stress que les cellules indifférenciées. Le TNF est au cœur de la perte de barrière intestinale par la régulation des jonctions serrées dépendante du MLCK.
Comme on le voit dans ce chiffre, TNF diminue significativement le TER de la monocouche Caco-2bbe d’une manière dépendante de la dose, ce qui suggère que le TNF augmente la perméabilité épithéliale. Par rapport à leur poids corporel initial, les souris traitées avec DSS perdent une quantité importante de poids. La sévérité de la colite est notée par prolapsus rectal, consistance de selles, saignement, et activité.
Les sections transversales des tissus du côlon tachés d’hématoxyline et d’éosine présentent des lésions muqueuses du côlon chez les souris traitées par le DSS. En outre, la longueur de la crypte du côlon, ainsi que le côlon lui-même, est diminué chez les souris traitées par le DSS. Enfin, il y a une augmentation d’environ deux fois les niveaux de coloration dextran FITC chez les souris traitées au DSS, par rapport aux souris témoins.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de minimiser les erreurs, en standardisant les procédures opérationnelles et en utilisant des méthodes statistiques. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la fonction barrière intestinale pour explorer les maladies gastro-intestinales dans les organismes modèles et les lignées cellulaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer la perméabilité épithéliale intestinale en mesurant le TER, en gavant fitc dextran, et en observant les changements morphologiques et histochimiques.
