이 실험의 전반적인 목표는 시험관 내 및 생체 내장 상피 세포 투과성을 측정하여 상피 장벽 기능 장애로 인한 질병을 연구하는 것입니다. 이 방법은 염증성 장 질환과 관련된 장 장벽 기능 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 장 상피 세포 투과성을 시험관 내 및 생체 내 모두 평가할 수 있다는 것입니다.
이 기술의 의미는 위장 질환의 치료 또는 진단으로 확장, 장 상피 장벽 기능 장애는 그 질병에 기여하기 때문에. 이 방법은 장 장벽 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 약물 독성 연구 및 다른 세포 유형의 장벽 무결성과 같은 다른 시스템에도 적용 될 수 있습니다. 일부 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 메서드의 시각적 데모는 매우 중요합니다.
이제 텍스트 설명으로 이 메서드의 정확한 작업을 이해할 수 있습니다. 시작하려면, 배지와 T75 플라스크에서 Caco-2bbe 세포를 성장. 세포 밀도에 따라 플라스크를 정기적으로 공급합니다.
세포가 80%의 컨실루물일 때, 매체를 제거하고 칼슘 없이 멸균 PBS의 1-2 밀리리터를 사용하여 헹구는 다. 트립신-EDTA의 1.5 밀리리터를 넣고 플라스크를 부드럽게 흔들어 주세요. 그런 다음, 흔들지 않고 20 분 동안 섭씨 37도 인큐베이터에 놓습니다.
세포가 트립시닝하는 동안 다공성 폴리 카보네이트 멤브레인을 포함하는 인서트를 24 개의 웰 플레이트에 배치하십시오. 그런 다음 멤브레인의 낮은 공간인 기저 챔버에 배양 배지 1 밀리리터를 넣습니다. 플라스크에 배지 5밀리리터를 추가하고, 플라스크 내부에 대해 세포를 5~10회 적극적으로 피펫하여 배양을 느슨한 개별 세포 또는 2~3개의 세포 덩어리로 분리합니다.
플레이트 0.166 밀리리터는 멤브레인의 상부 공간인 정액 챔버로 세포의 밀리리터를 입력한다. 그런 다음 최대 3 주 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 압력 펌프를 사용하여 각 우물의 기저 구획에서 배지를 조심스럽게 흡인시켜 세포를 일주일에 세 번 공급합니다.
그런 다음 배지 1 밀리리터를 각 삽입의 정량 챔버에 부드럽게 떨어 뜨립니다. 사이토카인 연구의 경우, 환피성 전기 저항 또는 TER 측정 하루 전에, 인터페론 감마의 밀리리터 당 10 나노그램을 포함하는 배지로 기저 매체를 대체합니다. 실험 당일, TNF의 밀리리터당 2.5 또는 7.5 나노그램을 함유한 HBSS로 배지를 교체한다.
미터를 수정하려면 보정 전극을 입력 포트에 삽입하고 Ohm 모드를 선택합니다. 그런 다음 드라이버드라이버를 사용하여 미터가 1, 000 ohms의 판독값을 표시할 때까지 R 조정 나사를 조정합니다. 전극을 70%에 15~30분 동안 살균하고 15초 동안 공기 건조를 허용합니다.
그런 다음 실험 세포 배양 배지에서 전극을 헹구는 다. 다음으로 전원을 켜고 옴 모드를 선택합니다. 전극을 수직으로 유지하면서 전극 교량의 긴 끝을 기저 챔버에 조심스럽게 배치하여 접시에 닿을 수 있도록 합니다.
그런 다음 짧은 끝을 정문 챔버에 배치하여 매체의 표면 아래에 머무르지만 조직 배양 삽입 위에 유지되도록 합니다. 시토카인 치료 후 0, 1, 2, 3 및 4시간 시료 및 빈 인서트의 내성을 측정합니다. 그런 다음 저항을 기록합니다.
다양한 플레이트 형식에 걸쳐 일관성을 얻으려면 여기에 표시된 바와 같이 저항 및 유효 멤브레인 영역의 생성물을 계산합니다. 24개의 웰 인서츠의 경우 유효 멤브레인 영역은 0.33 평방 센티미터입니다. 대장염을 유도하기 위해, 부피당 3.5%의 중량의 최종 농도에 자동으로 된 물에 DSS를 추가합니다.
그런 다음 DSS 용액을 사용하여 8주된 남성 C57 블랙 6마우스의 케이지내식수를 총 7일 동안 교체한다. 쥐를 제어하기 위해 DSS없이 일반 식수를 제공합니다. 7일 후, DSS 물을 일반 식수로 전환합니다.
매일, 마우스를 계량하고 4개의 매개변수에 의해 질병 엄격에 따라 정의된 임상 점수를 평가합니다: 직장 탈출, 대변 일관성, 출혈 및 활동. 최종 임상 점수에 대한 이러한 매개 변수에서 점수를 합산합니다. 결장 조직의 조직 병리학 적 상태를 분석하기 위해 7 일 후 DSS 치료 후, 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 안락사 한 후, 결장과 cecum을 분리하고 결장의 길이를 측정한다.
탈경 결장에서 0.5 센티미터 세그먼트를 잘라 내고 하룻밤 사이에 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 팔콘 튜브에서 조직을 수정합니다. 등급에 따라 고정 된 조직을 에탄올과 자일렌으로 씻으시다. 그런 다음 파라핀에 조직을 포함하고 헤마톡시린과 에신 염색을위한 6 밀리미터 섹션을 잘라.
DSS 유도 마우스에서 상피 장벽 투과성을 측정하기 위해, DSS 투여 시작 후 7일 후, 마우스를 3시간 동안 빠르게 한다. 독클을 사용하여 살균을 보장하기 위해 gavage 바늘을 오토클레이브한 다음, 밀리리터 당 80 밀리그램의 150 마이크로리터를 멸균 물에 4킬로달톤 FITC 도비텐을 사용하여 생쥐를 휘저고 사용하지 않은 FITC dextran을 유지하여 세럼 수집 후 표준 곡선을 측정합니다. 다음으로, 투과성 계산을 위해 마우스의 가중치를 가린다.
4시간 후, IP 주입에 의한 마우스를 마취한 후 반사 신경 및 수염 운동의 부족에 의해 적절한 마취를 확인한다. 그런 다음 마우스를 열 블록에 5 분 동안 놓습니다. 한 쌍의 가위를 사용하여 꼬리의 1센티미터 조각을 클립하고 꼬리에서 100 마이크로리터의 혈액을 세럼 수집 튜브로 수집합니다.
수집된 혈액을 10, 000배, 실온에서 10분 간 회전시합니다. 물로 혈청을 1~4개 희석시 희석시다. 그런 다음, 표준 곡선을 만들기 위해, 사용하지 않은 FITC dextran의 희석을 준비하기 위해 물을 사용합니다.
세럼의 웰당 100 마이크로리터를 추가하고 표준 곡선 샘플을 96 개의 웰 플레이트에 넣습니다. 플레이트 판독기를 사용하여 485의 흥분과 528의 방출에서 형광을 읽으십시오. 표준 곡선을 기반으로 투과성 값을 계산하고 4로 곱하여 희석을 수정합니다.
FITC dextran의 농도를 가중치로 나누어 값을 정규화합니다. 이것은 마우스가 아프고 체중이 감소한 경우 FITC dextran 전달의 차이를 정상화하는 데 도움이됩니다. 여기에 표시된 Caco-2bbe 세포는 미분화 세포와 분화 된 세포의 차이를 보여주기 위해 핵과 F-액틴 얼룩으로 표지되었습니다.
스트레스 섬유는 미분화 된 세포에서 명확하게 볼 수 있습니다. 분화 된 세포는 미분화 세포보다 더 작은 부피, 더 큰 핵 및 적은 스트레스 섬유를 갖는다. TNF는 MLCK 의존적인 단단한 접합 규정을 통해 장 장벽 손실의 중심입니다.
이 그림에서 볼 수 있듯이, TNF는 용량 의존적인 방식으로 Caco-2bbe 단층의 TER를 현저히 감소시키고, TNF가 상피 투과성을 증가시킨다는 것을 시사합니다. 초기 체중에 비해 DSS로 치료된 마우스는 상당한 양의 체중을 잃습니다. 대장염의 중증도는 직장 탈출, 대변 일관성, 출혈 및 활동에 의해 점수가 매겨집니다.
헤마톡실린과 에오신으로 얼룩진 대장 조직의 단면은 DSS 처리된 마우스에 있는 결장 점막 손상을 보여줍니다. 또한, 결장 토굴의 길이뿐만 아니라 결장 자체, DSS 처리 마우스에서 감소된다. 마지막으로, 대조군 마우스에 비해 DSS 처리 마우스에서 FITC dextran 염색의 수준에 약 2 배 증가가 있다.
이 절차를 시도하는 동안 운영 절차를 표준화하고 통계 방법을 활용하여 오류를 최소화하는 것이 중요합니다. 개발 후,이 기술은 모델 유기체와 세포주 모두에서 위장 질환을 탐구하는 장 장벽 기능 분야의 연구자에 대한 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 TER를 측정하고 FITC dextran을 측정하고 형태학적 및 조직화학적 변화를 관찰하여 장 상피 투과성을 결정하는 방법에 대한 좋은 이해를 가져야 합니다.
