El objetivo general de este experimento es estudiar las enfermedades causadas por la disfunción de la barrera epitelial midiendo la permeabilidad de las células epiteliales intestinales in vitro e in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la función de barrera intestinal, como las relacionadas con la enfermedad inflamatoria intestinal. La principal ventaja de esta técnica es que la permeabilidad de las células epiteliales intestinales se puede evaluar tanto in vitro como in vivo.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de enfermedades gastrointestinales, porque la disfunción de la barrera epitelial intestinal contribuye a esas enfermedades. Aunque este método puede proporcionar información sobre la función de barrera intestinal, también se puede aplicar a otros sistemas, tales como estudios de toxicidad de fármacos y la integridad de la barrera de otros tipos de células. La demostración visual de este método es crítica, ya que algunos pasos son difíciles de aprender.
Una operación precisa de este método ahora se puede entender por descripción textual. Para empezar, haga crecer células caco-2bbe en un matraz T75 con medio. Alimentar los matraces regularmente, dependiendo de la densidad celular.
Cuando las células sean 80%confluentes, retire el medio y utilice 1-2 mililitros de PBS estéril sin calcio para enjuagarlas. Añadir 1,5 mililitros de Trypsin-EDTA, y balancear suavemente el matraz. A continuación, colóquelo en la incubadora de 37 grados Celsius durante 20 minutos, sin balancearse.
Mientras que las células son tripsinas, coloque inserciones que contengan membranas de policarbonato porosa en 24 placas de pozo. A continuación, añadir 1 mililitro de medio de cultivo en la cámara basal que es el espacio inferior de la membrana. Añadir 5 mililitros de medio al matraz, y pipetear vigorosamente las células contra el interior del matraz de 5 a 10 veces, para separar el cultivo en células individuales sueltas, o dos o tres grumos celulares.
Placa 0.166 mililitros de las células en la cámara apical que es el espacio superior de la membrana. Luego incubar las placas a 37 grados centígrados durante un máximo de tres semanas. Alimentar las células tres veces por semana, mediante el uso de una bomba de presión para aspirar cuidadosamente el medio desde el compartimiento basal de cada pozo.
A continuación, gotee suavemente un mililitro de medio en la cámara apical de cada plaquita. Para estudios de citoquinas, un día antes de la resistencia eléctrica transepitelial o mediciones TER, reemplace el medio basal por medio, que contiene 10 nanogramos por mililitro de interferón gamma. El día del experimento, sustituya el medio por HBSS que contenga 2,5 o 7,5 nanogramos por mililitro de TNF.
Para corregir el medidor, inserte el electrodo de corrección en el puerto de entrada y elija el modo Ohm. A continuación, utilice un destornillador para ajustar el tornillo de ajuste R hasta que el medidor muestre una lectura de 1.000 ohmios. Esterilice los electrodos en 70%etanol durante 15 a 30 minutos y démútelos secar al aire durante 15 segundos.
A continuación, enjuague los electrodos en un medio de cultivo celular experimental. A continuación, encienda la alimentación y elija el modo Ohm. Mientras mantiene los electrodos verticales, coloque cuidadosamente los extremos largos de los puentes de electrodos en la cámara basal, asegurándose de que toquen el plato.
A continuación, coloque los extremos cortos en la cámara apical, asegurándose de que permanezcan por debajo de la superficie del medio, pero por encima de los insertos de cultivo de tejido. Mida la resistencia de la muestra y las plaquitas en blanco a las 0, 1, 2, 3 y 4 horas después del tratamiento con citoquinas. Entonces registra la resistencia.
Para lograr la consistencia en diferentes formatos de placa, calcule el producto de la resistencia y el área de membrana efectiva como se muestra aquí. Para 24 inserciones de pozos, el área efectiva de la membrana es de 0,33 centímetros cuadrados. Para inducir la colitis, agregue DSS al agua autoclavada a una concentración final de 3,5% de peso por volumen.
A continuación, utilice la solución DSS para reemplazar el agua potable en las jaulas de seis ratones C57 negros C57 negros de 8 semanas de edad durante un total de siete días. Dar agua potable regular sin DSS para controlar ratones. Después del día siete, cambie el agua del DSS por agua potable regular.
Cada día, sopesar a los ratones y evaluar las puntuaciones clínicas según se define de acuerdo con la gravedad de la enfermedad por cuatro parámetros: prolapso rectal, consistencia de las heces, sangrado y actividad. Sume las puntuaciones de estos parámetros para una puntuación clínica final. Analizar la condición histopatológica de los tejidos del colon siete días después del tratamiento con DSS, después de eutanasiar ratones de acuerdo con el protocolo de texto, aislar el colon y el cecum, y medir la longitud del colon.
Corte segmentos de 0,5 centímetros del colon distal y fije el tejido en un tubo de halcón de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de 10% de formalina durante la noche. Lave los tejidos fijos con etanol y xileno clasificados. A continuación, incruste los tejidos en la parafina y corte seis secciones milimétricas para la tinción de hematoxilina y eosina.
Para medir la permeabilidad de la barrera epitelial en ratones inducidos por DSS, siete días después del inicio de la administración de DSS, ayúdenlos durante tres horas. Autoclave una aguja de gavage para asegurar la esterilidad, luego utilice 150 microlitros de 80 miligramos por mililitro de cuatro kilodatones FITC dextran en agua estéril para gavage los ratones, y mantenga el dextran FITC no utilizado para medir la curva estándar después de la recolección de suero. A continuación, ponderar a los ratones para el cálculo de la permeabilidad.
Cuatro horas más tarde, después de anestesiar los ratones por inyección IP, confirme la anestesia adecuada por la falta de reflejos y movimiento del bigote. A continuación, coloque los ratones en un bloque de calor durante cinco minutos. Usando un par de tijeras, sujeta una pieza de un centímetro de la cola y recoge 100 microlitros de sangre de la cola en un tubo de recolección de suero.
Gire la sangre recogida a 10.000 veces g y a temperatura ambiente durante diez minutos. Con agua, diluya el suero de uno a cuatro. A continuación, para hacer una curva estándar, utilice agua para preparar las diluciones del dextrán FITC no utilizado.
Agregue 100 microlitros por pozo del suero y las muestras de curva estándar en 96 placas de pozo. Usando un lector de placas, lea la fluorescencia con una excitación de 485 y una emisión de 528. Calcule los valores de permeabilidad en función de la curva estándar y multiplique por cuatro para corregir la dilución.
Divida la concentración de FITC dextran por el peso para normalizar los valores. Esto ayuda a normalizar la diferencia en el parto de dextran FITC si los ratones están enfermos y han perdido peso. Las células caco-2bbe que se muestran aquí fueron etiquetadas con núcleos y manchas de F-actina para mostrar la diferencia entre las células indiferenciadas y diferenciadas.
Las fibras de estrés se ven claramente en las células indiferenciadas. Las células diferenciadas tienen un volumen más pequeño, núcleos más grandes y menos fibras de tensión que las células indiferenciadas. El TNF es fundamental para la pérdida de barrera intestinal a través de la regulación de unión estrecha dependiente de MLCK.
Como se ve en esta cifra, TNF disminuye significativamente el TER de la monocapa Caco-2bbe de una manera dependiente de la dosis, lo que sugiere que TNF aumenta la permeabilidad epitelial. En comparación con su peso corporal inicial, los ratones tratados con DSS pierden una cantidad significativa de peso. La gravedad de la colitis se obtiene por prolapso rectal, consistencia de las heces, sangrado y actividad.
Las secciones transversales de los tejidos colónicos manchados con hematoxilina y eosina muestran daño de la mucosa colónica en ratones tratados con DSS. Además, la longitud de la cripta de colon, así como el colon en sí, se reduce en ratones tratados con DSS. Por último, hay un aumento de aproximadamente el doble en los niveles de tinción de dextrano FITC en ratones tratados con DSS, en comparación con los ratones de control.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar minimizar el error, estandarizando los procedimientos operativos y utilizando métodos estadísticos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino a los investigadores en el campo de la función de barrera intestinal para explorar enfermedades gastrointestinales tanto en organismos modelo como en líneas celulares. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo determinar la permeabilidad epitelial intestinal midiendo el TER, gavaging FITC dextran, y la observación de cambios morfológicos e histoquímicos.
