Общая цель этого эксперимента заключается в изучении заболеваний, вызванных эпителиальной дисфункцией барьера путем измерения кишечной эпителиальной проницаемости клеток in vitro и in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области функции кишечного барьера, такие как те, которые связаны с воспалительными заболеваниями кишечника. Основным преимуществом этого метода является то, что проницаемость кишечных эпителиальных клеток может быть оценена как в пробирке, так и in vivo.
Последствия этого метода распространяется на терапию или диагностику заболеваний желудочно-кишечного тракта, потому что дисфункция кишечного эпителиального барьера способствует этим заболеваниям. Хотя этот метод может обеспечить понимание функции кишечного барьера, он также может быть применен к другим системам, таким как исследования токсичности наркотиков и барьерной целостности других типов клеток. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как некоторые шаги трудно узнать.
Точную работу этого метода теперь можно понять по текстовому описанию. Для начала вырастите клетки caco-2bbe в колбе T75 со средой. Кормите колбы регулярно, в зависимости от плотности клеток.
Когда клетки 80% стекут, удалить средний и использовать 1-2 миллилитров стерильных PBS без кальция, чтобы промыть их. Добавьте 1,5 миллилитров трипсина-ЭДТА и аккуратно раскачивайте колбу. Затем поместите его в 37 градусов по Цельсию инкубатор в течение 20 минут, без качания.
В то время как клетки трипсинизации, место вставки, содержащие пористые поликарбонатные мембраны в 24 хорошо пластин. Затем добавьте 1 миллилитр среды культуры в базальную камеру, которая является нижним пространством мембраны. Добавьте 5 миллилитров среды в колбу и энергично пипетку клетки против внутренней стороны колбы 5-10 раз, чтобы разделить культуру на свободные отдельные клетки, или два-три клеточных сгустка.
Плита 0,166 миллилитров клеток в апикал-камеру, которая является верхним пространством мембраны. Затем инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию на срок до трех недель. Кормите клетки три раза в неделю, используя насос давления, чтобы тщательно аспирировать среду из базального отсека каждой хорошо.
Затем аккуратно капать один миллилитр среды в апикал-камеру каждой вставки. Для исследований цитокинов, за день до трансепителиальной электрической устойчивости или измерения TER, заменить базальной среды со средой, содержащей 10 нанограмм на миллилитр интерферона гамма. В день эксперимента замените среду HBSS, содержащую 2,5 или 7,5 нанограмма на миллилитр TNF.
Чтобы исправить счетчик, вставьте электрод коррекции в порт ввода и выберите режим Ohm. Затем используйте отвертку, чтобы настроить винт R регулировки до тех пор, пока метр отображает показания 1000 ohms. Стерилизовать электроды в 70% этанола в течение 15 до 30 минут и дать им высохнуть в течение 15 секунд.
Затем промыть электроды в экспериментальной среде культуры клеток. Затем включите питание и выберите режим Ohm. Сохраняя вертикальные электроды, аккуратно поместите длинные концы электродных мостов в базальную камеру, гарантируя, что они коснутся блюда.
Затем поместите короткие концы в апиалогическую камеру, гарантируя, что они остаются ниже поверхности среды, но выше вставки культуры ткани. Измерьте устойчивость образца и пустые вставки на 0, 1, 2, 3 и 4 часа после лечения цитокинов. Затем завехать сопротивление.
Для достижения согласованности между различными форматами пластин, рассчитать продукт сопротивления и эффективной мембранной области, как показано здесь. Для 24 хорошо вставки, эффективная площадь мембраны составляет 0,33 квадратных сантиметров. Чтобы вызвать колит, добавьте DSS в автоклавную воду до конечной концентрации 3,5% веса на объем.
Затем используйте раствор DSS для замены питьевой воды в клетках 8-недельного самца C57 черных шести мышей в общей сложности семь дней. Дайте регулярную питьевую воду без DSS для управления мышами. После седьмого дня переключит воду DSS на обычную питьевую воду.
Каждый день взвешивать мышей и оценивать клинические оценки, как определено в зависимости от тяжести заболевания по четырем параметрам: ректальный пролапс, консистенция стула, кровотечение, и активность. Сумма баллов из этих параметров для окончательного клинического балла. Для анализа гистопатологического состояния тканей толстой кишки семь дней после лечения DSS, после усыплять мышей в соответствии с текстовым протоколом, изолировать толстой кишки и cecum, и измерить длину толстой кишки.
Вырезать 0,5 сантиметра сегментов от дистальной толстой кишки, и исправить ткани в 15 миллилитров сокола трубки, содержащей 10 миллилитров 10%формалин ночь. Вымойте фиксированные ткани градуированным этанолом и ксиленом. Затем вставлять ткани в парафин и вырезать шесть миллиметров разделов для гематоксилина и эозина окрашивания.
Для измерения проницаемости эпителиального барьера у мышей, вызванных DSS, через семь дней после начала введения DSS, быстро мышей в течение трех часов. Автоклав гаваж иглы для обеспечения стерильности, а затем использовать 150 микролитров 80 миллиграммов на миллилитр четыре килодальтона FITC dextran в стерильной воде, чтобы gavage мышей, и сохранить неиспользованные FITC декстран для измерения стандартной кривой после сбора сыворотки. Далее вес мышей для расчета проницаемости.
Четыре часа спустя, после обезболивания мышей путем инъекций ИС, подтверждают правильное обезболивания из-за отсутствия рефлексов и усов движения. Затем поместите мышей на тепловой блок в течение пяти минут. Используя ножницы, зарезать один сантиметр кусок хвоста и собрать 100 микролитров крови из хвоста в трубку сбора сыворотки.
Спин собранной крови при 10 000 раз г и комнатной температуре в течение десяти минут. С водой разбавить сыворотку от одного до четырех. Затем, чтобы сделать стандартную кривую, используйте воду, чтобы подготовить разбавления неиспользованных FITC dextran.
Добавьте 100 микролитров на колодец сыворотки и стандартные образцы кривой в 96 пластин. Используя считыватель пластин, прочитайте флуоресценцию при возбуждении 485 и выбросе 528. Рассчитайте значения проницаемости на основе стандартной кривой и умножьте на четыре, чтобы исправить для разбавления.
Разделите концентрацию FITC dextran на вес для нормализации значений. Это помогает нормализовать разницу в FITC декстран доставки, если мыши больны, и потеряли вес. Клетки како-2bbe показаны здесь были помечены ядрами и F-актин пятна, чтобы показать разницу между недифференцированными и дифференцированными клетками.
Стрессовые волокна хорошо видны в недифференцированных клетках. Дифференцированные клетки имеют меньший объем, большие ядра и меньше стрессовых волокон, чем недифференцированные клетки. TNF имеет центральное значение для потери кишечного барьера через MLCK-зависимых жесткой регулировки соединения.
Как видно из этой цифры, TNF значительно снижает TER монослойного caco-2bbe в зависимости от дозы образом, предполагая, что TNF увеличивает эпителиабельную проницаемость. По сравнению с их первоначальной массы тела, мышей, обработанных DSS потерять значительное количество веса. Тяжесть колита забил ректальный пролапс, стул консистенции, кровотечения, и деятельность.
Поперечные сечения тканей толстой кишки, окрашенные гематоксилином и эозином, показывают повреждение слизистой оболочки толстой кишки у мышей, обработанных DSS. Кроме того, длина склепа толстой кишки, как и сама толстая кишка, снижается у обработанных DSS мышей. Наконец, есть примерно в два раза больше уровней FITC декстрана окрашивания в DSS-обработанных мышей, по сравнению с контрольных мышей.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы свести к минимуму ошибки, путем стандартизации оперативных процедур и использования статистических методов. После своего развития, этот метод проложил путь к исследователям в области функции кишечного барьера для изучения желудочно-кишечных заболеваний в обоих модельных организмов и клеточных линий. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как определить кишечной эпителиальной проницаемости путем измерения TER, gavaging FITC dextran, и наблюдения морфологических и гистохимических изменений.
