الهدف العام من هذه التجربة هو دراسة الأمراض الناجمة عن خلل الحاجز الظهاري عن طريق قياس نفاذية الخلايا الظهارية المعوية في المختبر وفي الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال وظيفة الحاجز المعوي ، مثل تلك المتعلقة بمرض التهاب الأمعاء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تقييم نفاذية الخلايا الظهارية المعوية في كل من المختبر وفي الجسم الحي.
الآثار المترتبة على هذه التقنية يمتد نحو العلاج أو تشخيص أمراض الجهاز الهضمي، وذلك لأن خلل حاجز الظهارية المعوية يساهم في تلك الأمراض. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة وظيفة الحاجز المعوي، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أنظمة أخرى، مثل دراسات سمية المخدرات وسلامة حاجز أنواع الخلايا الأخرى. العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم بعض الخطوات.
يمكن الآن فهم عملية دقيقة من هذا الأسلوب بواسطة وصف نصي. للبدء، تنمو خلايا كاكو-2bbe في قارورة T75 مع المتوسطة. تغذية القارورة بانتظام، اعتمادا على كثافة الخلية.
عندما تكون الخلايا 80٪ التقاء، وإزالة المتوسطة واستخدام 1-2 ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة دون الكالسيوم لشطف لهم. إضافة 1.5 ملليلتر من تريبسين-EDTA، وروك بلطف القارورة. ثم، وضعه في حاضنة درجة 37 مئوية لمدة 20 دقيقة، دون هزاز.
في حين أن الخلايا هي trypsinizing، مكان إدراج تحتوي على أغشية البولي كربونات المسامية في 24 لوحات جيدا. ثم إضافة 1 ملليلتر من المتوسط الثقافة في الغرفة القاعدية التي هي المساحة السفلى من الغشاء. إضافة 5 ملليلتر من المتوسطة إلى القارورة، والميصة بقوة الخلايا ضد داخل قارورة 5 إلى 10 مرات، لفصل الثقافة في الخلايا الفردية فضفاضة، أو كتل الخلايا اثنين إلى ثلاثة.
لوحة 0.166 ملليلتر من الخلايا في غرفة apical الذي هو الفضاء العلوي للغشاء. ثم احتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع. تغذية الخلايا ثلاث مرات أسبوعيا، وذلك باستخدام مضخة الضغط لpirate بعناية المتوسطة من المقصورة القاعدية من كل بئر.
ثم بالتنقيط بلطف ملليلتر واحد من المتوسطة في غرفة apical من كل إدراج. بالنسبة لدراسات السيتوكين، قبل يوم واحد من المقاومة الكهربائية عبر سفحلية أو قياسات TER، استبدل الوسيط القاعدي بالوسط، الذي يحتوي على 10 نانوجرامات لكل ملليلتر من إنترفيرون غاما. في يوم التجربة، استبدل الوسيط بـ HBSS يحتوي على 2.5 أو 7.5 نانوغرام لكل ملليلتر من TNF.
لتصحيح المقياس، أدخل قطب التصحيح في منفذ الإدخال واختر وضع أوم. ثم استخدم مفك لضبط المسمار تعديل R حتى يعرض العداد قراءة 1000 أوم. تعقيم الأقطاب الكهربائية في 70٪ الإيثانول لمدة 15 إلى 30 دقيقة والسماح لهم للهواء الجاف لمدة 15 ثانية.
ثم شطف الأقطاب الكهربائية في المتوسطة ثقافة الخلايا التجريبية. بعد ذلك، قم بتشغيل الطاقة واختر وضع أوم. مع الحفاظ على الأقطاب العمودية، ضع بعناية نهايات طويلة من جسور القطب في الغرفة القاعدية، وضمان أنها تلمس الطبق.
ثم ضع النهايات القصيرة في غرفة الزهاء ، وضمان بقائها تحت سطح الوسط ، ولكن فوق إدراج ثقافة الأنسجة. قياس مقاومة العينة وإدراج فارغة في 0، 1، 2، 3 و 4 ساعات بعد العلاج السيتوكين. ثم سجل المقاومة.
لتحقيق الاتساق عبر مختلف صيغ لوحة، وحساب نتاج المقاومة ومنطقة غشاء فعالة كما هو مبين هنا. بالنسبة لـ 24 من الآبار، تبلغ مساحة الغشاء الفعال 0.33 سنتيمتر مربع. للحث على التهاب القولون، إضافة DSS إلى الماء autoclaved إلى تركيز النهائي من 3.5٪ الوزن لكل وحدة تخزين.
ثم استخدم حل DSS لاستبدال مياه الشرب في أقفاص الذكور البالغ من العمر 8 أسابيع C57 فئران ستة سوداء لما مجموعه سبعة أيام. إعطاء مياه الشرب العادية دون DSS للسيطرة على الفئران. بعد اليوم السابع، قم بتحويل مياه DSS إلى مياه الشرب العادية.
كل يوم، وزن الفئران وتقييم الدرجات السريرية على النحو المحدد وفقا لشدة المرض من قبل أربعة المعلمات: هبوط المستقيم، واتساق البراز، والنزيف، والنشاط. جمع الدرجات من هذه المعلمات لدرجة سريرية النهائي. لتحليل الحالة الهستويولوجية للأنسجة القولون سبعة أيام بعد العلاج DSS، بعد القتل الرحيم الفئران وفقا لبروتوكول النص، وعزل القولون و cecum، وقياس طول القولون.
قطع 0.5 شرائح سنتيمتر من القولون القعد، وإصلاح الأنسجة في أنبوب صقر 15 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من 10٪ formalin بين عشية وضحاها. غسل الأنسجة الثابتة مع الإيثانول متدرج والزيلين. ثم تضمين الأنسجة في البارافين وقطع ستة مقاطع ملليمتر للهماوكسيلين وosin تلطيخ.
لقياس نفاذية الحاجز الظهارية في الفئران الناجمة عن DSS ، بعد سبعة أيام من بدء إدارة DSS ، تسرع الفئران لمدة ثلاث ساعات. الأوتوكلاف إبرة غافاج لضمان العقم، ثم استخدام 150 ميكرولترات من 80 ملليغرام لكل ملليلتر أربعة كيلودالون FITC dextran في الماء المعقم لgavage الفئران، والحفاظ على dextran FITC غير المستخدمة لقياس المنحنى القياسي بعد جمع المصل. بعد ذلك، قم بوزن الفئران لحساب نفاذية.
أربع ساعات في وقت لاحق، بعد تخدير الفئران عن طريق حقن IP، تأكيد التخدير السليم من عدم وجود ردود الفعل وحركة شعيرات. ثم ضع الفئران على كتلة الحرارة لمدة خمس دقائق. باستخدام زوج من مقص، مقطع قطعة سنتيمتر واحد من الذيل وجمع 100 ميكرولترات من الدم من الذيل في أنبوب جمع المصل.
تدور الدم الذي تم جمعه في 10،000 مرات ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق. بالماء، تمييع المصل من واحد إلى أربعة. ثم، لجعل منحنى قياسي، واستخدام المياه لإعداد التخفيفات من dextran FITC غير المستخدمة.
إضافة 100 ميكرولترات لكل بئر من المصل وعينات منحنى القياسية في 96 لوحات جيدا. باستخدام قارئ لوحة ، وقراءة الفلوريسنس في استثارة من 485 وانبعاث 528. حساب القيم نفاذية استناداً إلى منحنى القياسية، وضرب أربعة لتصحيح لتخفيف.
تقسيم تركيز dextran في المركز حسب الوزن لتطبيع القيم. وهذا يساعد على تطبيع الفرق في تسليم dextran في المركز إذا كانت الفئران مريضة، وفقدت الوزن. تم تسمية خلايا كاكو-2bb المعروضة هنا ببقع نوى و إف أكتين لإظهار الفرق بين الخلايا غير المتمايزة والمتمايزة.
ألياف الإجهاد واضحة في الخلايا غير المتمايزة. تحتوي الخلايا المتمايزة على حجم أصغر، ونوى أكبر، وألياف إجهاد أقل من الخلايا غير المتمايزة. TNF هو مركزي لفقدان الحاجز المعوي من خلال تنظيم تقاطع ضيق يعتمد على MLCK.
كما رأينا في هذا الرقم، TNF يقلل بشكل كبير من TER من أحادية caco-2bbe بطريقة تعتمد على الجرعة، مما يشير إلى أن TNF يزيد من نفاذية الظهارية. بالمقارنة مع وزن الجسم الأولي، تفقد الفئران المعالجة بـ DSS كمية كبيرة من الوزن. يتم تسجيل شدة التهاب القولون عن طريق هبوط المستقيم ، واتساق البراز ، والنزيف ، والنشاط.
تظهر المقاطع العرضية للأنسجة القولونية الملطخة بالهماوكسيلين واليوسين تلف الغشاء المخاطي القولوني في الفئران المعالجة DSS. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقليل طول سرداب القولون ، وكذلك القولون نفسه ، في الفئران المعالجة DSS. وأخيراً، هناك زيادة بمقدار الضعفين تقريباً في مستويات dextran في فيتC تلطيخ في الفئران المعالجة DSS، مقارنة بالفئران التحكم.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر تقليل الخطأ ، من خلال توحيد الإجراءات التشغيلية واستخدام الطرق الإحصائية. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال وظيفة الحاجز المعوي لاستكشاف أمراض الجهاز الهضمي في كل من الكائنات العضوية النموذجية وخطوط الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد نفاذية الظهارية المعوية من خلال قياس TER، dextran 1000، ومراقبة التغيرات المورفولوجية والهسجائية.
