Bu deneyin genel amacı in vitro ve in vivo bağırsak epitel hücre geçirgenliğini ölçerek epitel bariyer disfonksiyonu neden olduğu hastalıkları incelemektir. Bu yöntem bağırsak bariyeri fonksiyon alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, bu inflamatuar barsak hastalığı ile ilgili olanlar gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı bağırsak epitel hücre geçirgenliğinin hem in vitro hem de in vivo olarak değerlendirilebiliyor olmasıdır.
Bu tekniğin etkileri gastrointestinal hastalıkların tedavisi veya tanısına kadar uzanır, çünkü intestinal epitel bariyer disfonksiyonu bu hastalıklara katkıda bulunur. Bu yöntem bağırsak bariyer fonksiyonu içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer sistemlere uygulanabilir, ilaç toksisite çalışmaları ve diğer hücre türlerinin bariyer bütünlüğü gibi. Bazı adımları öğrenmek zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir.
Bu yöntemin doğru bir işlem artık metin açıklaması ile anlaşılabilir. Başlamak için, orta ile bir T75 şişesinde Caco-2bbe hücreleri büyümek. Hücre yoğunluğuna bağlı olarak şişeleri düzenli olarak besleyin.
Hücreler %80 konca olduğunda, ortayı çıkarın ve 1-2 mililitre steril PBS kullanın. Trypsin-EDTA 1,5 mililitre ekleyin ve yavaşça şişe kaya. Sonra, 37 derece santigrat antiktoruna 20 dakika boyunca, sallanmadan yerleştirin.
Hücreler denerken, gözenekli polikarbonat membranlar içeren kesici uçları 24 kuyu plakasına yerleştirin. Daha sonra membranın alt alanı olan bazal odaya 1 mililitre kültür ortamı ekleyin. Şişeye 5 mililitre orta litre ekleyin ve gevşek bireysel hücrelere kültürü ayırmak için, şişenin içine karşı hücreleri 5 ila 10 kez veya iki ila üç hücre kümeleri halinde şiddetle pipet.
Plaka 0.166 hücrelerin mililitre membranın üst alanı olan apikal odasına. Sonra plakaları 37 derecede üç haftakadar kuluçkaya yatırın. Her kuyunun bazal bölmesinden ortayı dikkatlice aspire etmek için bir basınç pompası kullanarak hücreleri haftada üç kez besleyin.
Daha sonra her kesici uça bir mililitre orta damlatın. Sitokin çalışmaları için, transepitel elektrikdirenci veya TER ölçümlerinden bir gün önce, bazal ortayı, mililitre interferon gama başına 10 nanogram içeren orta ile değiştirin. Deney günü, tnf mililitre başına 2,5 veya 7,5 nanogram içeren HBSS ile orta değiştirin.
Sayacı düzeltmek için, düzeltme elektrotunu giriş noktasına takın ve Ohm modunu seçin. Daha sonra sayaç 1.000 ohm'luk bir okuma görüntüleyene kadar R Ayar vidasını ayarlamak için bir tornavida kullanın. Elektrotları 15 ila 30 dakika boyunca %70 etanolile sterilize edin ve 15 saniye boyunca kurumasını bekleyin.
Daha sonra elektrotları deneysel hücre kültürü ortamında durulayın. Ardından, gücü açın ve Ohm modunu seçin. Elektrotları dikey tutarken, elektrot köprülerinin uzun uçlarını dikkatlice bazal odaya yerleştirin ve çanağa dokunmalarını sağlar.
Daha sonra kısa uçları apikal odaya yerleştirin, ortam yüzeyinin altında kalmalarını sağlamak, ancak doku kültürünün üzerinde ekler. Sitokin tedavisinden sonra numunenin direncini ve boş kesici uçları 0, 1, 2, 3 ve 4 saat ölçün. O zaman direnişi kaydet.
Farklı plaka biçimleri arasında tutarlılık elde etmek için, direnç ürün ve etkili membran alanı burada gösterildiği gibi hesaplayın. 24 kuyu kesici uç için etkili membran alanı 0,33 santimetre karedir. Kolitin indüklenebilmek için, otoklavlı suya dss ekleyin ve hacim başına %3,5 ağırlıkta son konsantrasyona ekleyin.
Daha sonra 8 haftalık erkek C57 siyah altı fare kafeslerinde içme suyu yerine yedi gün toplam DSS çözeltisi kullanın. Fareleri kontrol etmek için DSS olmadan düzenli içme suyu verin. Yedinci günden sonra, DSS suyunu normal içme suyuna çevirin.
Her gün, fareleri tartın ve hastalığın şiddetine göre tanımlanan klinik skorları dört parametre ile değerlendirin: rektal prolapsus, dışkı tutarlılığı, kanama ve aktivite. Son klinik puan için bu parametrelerden puanları toplamı. Kolon dokularının histopatolojik durumunu analiz etmek için yedi gün sonra DSS tedavisi, metin protokolüne göre fareler ötenazi sonra, kolon ve çekum izole, ve kolon uzunluğunu ölçmek.
Distal kolondan 0.5 santimetrelik parçalar kesin ve bir gecede 10 mililitre formalin içeren 15 mililitrelik şahin tüpündeki dokuyu düzeltin. Sabit dokuları dereceli etanol ve ksilen ile yıkayın. Sonra parafin dokuları gömmek ve hematoksilin ve eozin boyama için altı milimetrelik kesitler kesti.
DSS'ye bağlı farelerde epitel bariyer geçirgenliğini ölçmek için, DSS uygulamasının başlamasından yedi gün sonra, fareleri üç saat boyunca hızlı layın. Otoklav bir gavaj iğne kısırlık sağlamak için, sonra mililitre dört kilodalton FITC dextran steril suda fareler gavage başına 80 miligram 150 mikrolitre kullanın ve serum toplama sonra standart eğriyi ölçmek için kullanılmayan FITC dextran tutmak. Sonra, geçirgenlik hesaplamaiçin fareler ağırlık.
Dört saat sonra, IP enjeksiyonu ile fareler anestezi sonra, refleksleri ve bıyık hareketi eksikliği ile uygun anestezi onaylamak. Sonra fareleri beş dakika boyunca bir ısı bloğuna yerleştirin. Bir makas kullanarak, kuyruğun bir santimetrelik parçasını kırpın ve kuyruktan 100 mikrolitre kan toplayıp serum toplama tüpüne yerleştirin.
Toplanan kanı 10,000 kez g ve oda sıcaklığında on dakika döndürün. Suyla serumu 1'den 4'e seyrelt. Daha sonra, standart bir eğri yapmak için, kullanılmayan FITC dextran seyreltme hazırlamak için su kullanın.
96 kuyu plakası içine serum ve standart eğri örnekleri kuyu başına 100 mikrolitre ekleyin. Bir plaka okuyucu kullanarak, 485 bir uyarma ve 528 bir emisyon floresan okuyun. Standart eğriyi temel alarak geçirgenlik değerlerini hesaplayın ve seyreltme için düzeltmek için dörtle çarpın.
Değerleri normalleştirmek için FITC dextran konsantrasyonu ağırlığına bölün. Bu fareler hasta ise FITC dextran teslimat farkı normalleştirmek için yardımcı olur, ve kilo vermiş. Burada gösterilen Caco-2bbe hücreleri, farklılaşmamış ve farklılaşmış hücreler arasındaki farkı göstermek için çekirdek ve F-aktin lekeleri ile etiketlenmiştir.
Stres lifleri açıkça farklılaşmamış hücrelerde görülür. Farklılaşmış hücreler, farklılaşmamış hücrelere göre daha küçük hacimli, daha büyük çekirdeklere ve daha az stres liflerine sahiptir. TNF MLCK bağımlı sıkı kavşak regülasyonu ile bağırsak bariyer kaybı merkezidir.
Bu şekilde görüldüğü gibi, TNF doza bağımlı bir şekilde Caco-2bbe monolayer TER önemli ölçüde azalır, TNF epitel geçirgenliği artırır düşündürmektedir. İlk vücut ağırlıklarıyla karşılaştırıldığında, DSS ile tedavi edilen fareler önemli miktarda kilo kaybederler. Kolitin şiddeti rektal prolapsus, dışkı tutarlılığı, kanama ve aktivite ile puanlandırılır.
Hematoksilin ve eozin ile boyanmış kolon dokularının kesitleri DSS ile tedavi edilen farelerde kolon mukozal hasarı göstermektedir. Buna ek olarak, kolon mahzeninin uzunluğu ve kolon kendisi, DSS ile tedavi farelerde azalır. Son olarak, kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında, DSS ile tedavi edilen farelerde FITC dekstran boyama düzeylerinde yaklaşık iki kat artış vardır.
Bu yordamı denerken, operasyonel prosedürleri standartlaştırarak ve istatistiksel yöntemler kullanarak hatayı en aza indirmeyi unutmamak önemlidir. Bu teknik, geliştirildikten sonra hem model organizmalarda hem de hücre hatlarında gastrointestinal hastalıkları araştırmak için bağırsak bariyeri fonksiyonu alanında araştırmacıların önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, TER ölçerek, FITC dextran'ı katarak ve morfolojik ve histokimyasal değişiklikleri gözlemleyerek bağırsak epitelyal geçirgenliğini nasıl belirleyebildiğinizi iyi anlamalısınız.
