Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Krankheiten zu untersuchen, die durch epitheliale Barrieredysfunktion verursacht werden, indem die Darmepithelzellpermeabilität in vitro und in vivo gemessen wird. Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen im Bereich der Darmbarriere-Funktion zu beantworten, wie diejenigen im Zusammenhang mit der entzündlichen Darmerkrankung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Durchlässigkeit der Darmepithelzellartsowohlin in vitro und in vivo beurteilt werden kann.
Die Auswirkungen dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie oder Diagnose von Magen-Darm-Erkrankungen, weil Darmepithel-Barriere Dysfunktion trägt zu diesen Krankheiten. Obwohl diese Methode Einblick in die Darmbarrierefunktion bieten kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. Arzneimitteltoxizitätsstudien und Barriereintegrität anderer Zelltypen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da einige Schritte schwer zu erlernen sind.
Eine genaue Funktionsweise dieser Methode kann nun durch eine Textbeschreibung verstanden werden. Zunächst können Caco-2bbe-Zellen in einem T75-Kolben mit Medium wachsen. Füttern Sie die Kolben regelmäßig, abhängig von der Zelldichte.
Wenn die Zellen zu 80 % konfluent sind, entfernen Sie das Medium und verwenden Sie 1-2 Milliliter sterilen PBS ohne Kalzium, um sie zu spülen. Fügen Sie 1,5 Milliliter Trypsin-EDTA hinzu und schaukeln Sie den Kolben sanft. Dann legen Sie es in den 37 Grad Celsius Inkubator für 20 Minuten, ohne zu schaukeln.
Während die Zellen versuchen, legen Sie Inserts, die poröse Polycarbonatmembranen enthalten, in 24 Brunnenplatten. Dann fügen Sie 1 Milliliter Kulturmedium in die Basalkammer, die den unteren Raum der Membran ist. Fügen Sie 5 Milliliter Medium in den Kolben, und kräftig Pipette die Zellen gegen das Innere des Kolbens 5 bis 10 Mal, um die Kultur in lose einzelne Zellen zu trennen, oder zwei bis drei Zellklumpen.
Platte 0,166 Milliliter der Zellen in die apikale Kammer, die den oberen Raum der Membran ist. Dann die Platten bei 37 Grad Celsius für bis zu drei Wochen inkubieren. Füttern Sie die Zellen dreimal wöchentlich, indem Sie eine Druckpumpe verwenden, um das Medium vorsichtig aus dem Basalfach jedes Brunnens zu saugen.
Dann tropfen Sie vorsichtig einen Milliliter Medium in die apikale Kammer jedes Einsatzes. Bei Zytokinstudien ersetzen Sie einen Tag vor transepithelialem elektrischen Widerstand oder TER-Messungen das Basalmedium durch medium, das 10 Nanogramm pro Milliliter Interferongamma enthält. Ersetzen Sie das Medium am Tag des Experiments durch HBSS mit 2,5 oder 7,5 Nanogramm pro Milliliter TNF.
Um das Messgerät zu korrigieren, legen Sie die Korrekturelektrode in den Eingangsanschluss ein und wählen Sie den Ohm-Modus. Verwenden Sie dann einen Schraubendreher, um die R-Einstellungsschraube einzustellen, bis das Messgerät einen Messwert von 1.000 Ohm anzeigt. Sterilisieren Sie die Elektroden in 70% Ethanol für 15 bis 30 Minuten und lassen Sie sie für 15 Sekunden an der Luft trocknen.
Dann spülen Sie die Elektroden in experimentellen Zellkulturmedium. Schalten Sie als Nächstes die Stromversorgung ein und wählen Sie den Ohm-Modus. Während Sie die Elektroden vertikal halten, legen Sie die langen Enden der Elektrodenbrücken vorsichtig in die Basalkammer, um sicherzustellen, dass sie die Schale berühren.
Legen Sie dann die kurzen Enden in die apikale Kammer, um sicherzustellen, dass sie unter der Oberfläche des Mediums bleiben, aber über den Gewebekultureinsätzen. Messen Sie den Widerstand der Probe und der rohen Einsätze bei 0, 1, 2, 3 und 4 Stunden nach der Zytokinbehandlung. Dann notieren Sie den Widerstand.
Um Konsistenz über verschiedene Plattenformate hinweg zu erreichen, berechnen Sie das Produkt des Widerstands und der effektiven Membranfläche, wie hier gezeigt. Bei 24 Brunneneinsätzen beträgt die effektive Membranfläche 0,33 Quadratzentimeter. Um Kolitis zu induzieren, fügen Sie DSS zu autoklavierten Wasser zu einer Endkonzentration von 3,5% Gewicht pro Volumen hinzu.
Dann verwenden Sie die DSS-Lösung, um das Trinkwasser in den Käfigen des 8 Wochen alten männlichen C57 schwarzen sechs Mäuse für insgesamt sieben Tage zu ersetzen. Geben Sie regelmäßiges Trinkwasser ohne DSS, um Mäuse zu kontrollieren. Nach Tag sieben das DSS-Wasser auf normales Trinkwasser umstellen.
Wägen Sie jeden Tag die Mäuse ab und bewerten Sie die klinischen Werte, die nach dem Schweregrad der Erkrankung definiert sind, anhand von vier Parametern: rektaler Prolaps, Stuhlkonsistenz, Blutungen und Aktivität. Summieren Sie die Ergebnisse aus diesen Parametern für eine endgültige klinische Punktzahl. Um den histopathologischen Zustand von Dickdarmgeweben sieben Tage nach der DSS-Behandlung zu analysieren, nach der Einschlämung von Mäusen gemäß dem Textprotokoll, isolieren Sie den Dickdarm und das Zecum und messen Sie die Länge des Dickdarms.
Schneiden Sie 0,5 Zentimeter Segmente aus dem distalen Dickdarm und fixieren Sie das Gewebe in einem 15 Milliliter Falkenrohr, das 10 Milliliter 10% formalin über Nacht enthält. Waschen Sie die fixen Gewebe mit abgestuftem Ethanol und Xylol. Dann die Gewebe in Paraffin einbetten und sechs Millimeter Schnitte für die Hämatoxylin- und Eosinfärbung schneiden.
Um die Epithelbarrieredurchlässigkeit bei DSS-induzierten Mäusen zu messen, fasten sie sieben Tage nach Beginn der DSS-Verabreichung die Mäuse drei Stunden lang. Autoclave eine Gavage-Nadel, um Sterilität zu gewährleisten, dann verwenden Sie 150 Mikroliter von 80 Milligramm pro Milliliter vier Kilodalton FITC Dextran in sterilem Wasser, um die Mäuse zu gavage, und halten Sie die ungenutzte FITC dextran, um die Standardkurve nach serum Sammlung zu messen. Gewichten Sie als Nächstes die Mäuse für die Permeabilitätsberechnung.
Vier Stunden später, nach der Anästhesisierung der Mäuse durch IP-Injektion, bestätigen richtige Anästhesie durch den Mangel an Reflexen und Schnurrbartbewegung. Dann legen Sie die Mäuse für fünf Minuten auf einen Wärmeblock. Schneiden Sie mit einer Schere ein einen Zentimeter großes Stück des Schwanzes ab und sammeln Sie 100 Mikroliter Blut aus dem Schwanz in ein Serum-Sammelrohr.
Drehen Sie das gesammelte Blut bei 10.000 mal g und Raumtemperatur für zehn Minuten. Mit Wasser das Serum eins bis vier verdünnen. Um dann eine Standardkurve zu erstellen, verwenden Sie Wasser, um die Verdünnungen des unbenutzten FITC-Dextrans vorzubereiten.
Fügen Sie 100 Mikroliter pro Brunnen des Serums und die Standardkurvenproben in 96 Wellplatten ein. Lesen Sie mit hilfe eines Plattenlesers die Fluoreszenz bei einer Anregung von 485 und einer Emission von 528. Berechnen Sie die Permeabilitätswerte basierend auf der Standardkurve, und multiplizieren Sie sie mit vier, um die Verdünnung zu korrigieren.
Teilen Sie die Konzentration von FITC dextran durch das Gewicht, um die Werte zu normalisieren. Dies hilft, den Unterschied in der FITC Dextran-Entbindung zu normalisieren, wenn Mäuse krank sind und Gewicht verloren haben. Die hier gezeigten Caco-2bbe-Zellen wurden mit Kernen und F-Actin-Färbungen beschriftet, um den Unterschied zwischen undifferenzierten und differenzierten Zellen zu zeigen.
Spannungsfasern sind in undifferenzierten Zellen deutlich zu sehen. Differenzierte Zellen haben ein geringeres Volumen, größere Kerne und weniger Spannungsfasern als undifferenzierte Zellen. TNF ist zentral für den Verlust von Darmbarrieren durch MLCK-abhängige enge Kreuzungsregulierung.
Wie in dieser Abbildung gesehen, tNF deutlich verringert die TER der Caco-2bbe Monolayer in einer dosisabhängigen Weise, was darauf hindeutet, dass TNF epitheliale Permeabilität erhöht. Im Vergleich zu ihrem anfänglichen Körpergewicht verlieren mäuse, die mit DSS behandelt werden, eine erhebliche Menge an Gewicht. Die Schwere der Kolitis wird durch rektale Prolaps, Stuhlkonsistenz, Blutungen und Aktivität bewertet.
Querschnitte von mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Kolongeweben zeigen kolonische Schleimhautschäden bei DSS-behandelten Mäusen. Darüber hinaus wird die Länge der Doppelpunktkrypta, sowie der Doppelpunkt selbst, bei DSS-behandelten Mäusen verringert. Schließlich gibt es einen etwa doppelten Anstieg der FITC-Dextran-Färbung bei DSS-behandelten Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, fehlerbedenkt zu denken, indem Sie operative Verfahren standardisieren und statistische Methoden verwenden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Darmbarrierefunktion den Weg, um Magen-Darm-Erkrankungen sowohl in Modellorganismen als auch in Zelllinien zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Darmepithelpermeabilität bestimmen können, indem Sie den TER messen, FITC-Dextran gavaging und morphologische und histochemische Veränderungen beobachten.
