El objetivo general de este procedimiento es purificar los ribosomas de las mitocondrias de las líneas celulares humanas a gran escala que es suficiente para los estudios estructurales. Este método de purificación ribosoma mitocondrial permite caracterizar complejos de traducción, mutantes, conjuntos de control de calidad e intermedios de subunidades mitoribosomales. Estos se pueden utilizar para responder preguntas clave sobre la síntesis de proteínas en las mitocondrias.
La principal ventaja de esta técnica es que la cavitación de nitrógeno se utiliza para la lelisis celular y sólo se necesitan de 10 a las 10 células de cultivo para preparar los mitoribosomas para la determinación de la estructura de alta resolución. Esta técnica puede dar lugar al descubrimiento de nuevos componentes de la maquinaria de traducción de las mitocondrias y puede utilizarse más para el desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento del cáncer. Después de cultivar las células HEK293S de acuerdo con el protocolo de texto, cosecha dos tubos de células de un litro por centrifugación a 1.000 veces g y cuatro grados centígrados durante siete minutos.
Decantar cuidadosamente el sobrenadante y resuspend rápidamente cada pellet en 100 mililitros de PBS. Luego, afila las células y centrifuga la suspensión a 1.200 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, después de decantar cuidadosamente el sobrenadante, pesar el pellet.
Luego, utilice 120 mililitros de búfer MIB para resuspendarlo y dejar que las células resuspendidas se hinchen en la sala fría durante 20 minutos. Transfiera las células hinchadas a una cámara de cavitación de nitrógeno preenfriada sobre hielo. Luego, agregue 45 mililitros de búfer SM4 a las células.
Fije la cámara de cavitación de nitrógeno y llénelo con nitrógeno hasta que la presión alcance 500 PSI. Luego, cierra los grifos y mantenlo en hielo durante 20 minutos. El método de lysis de células de cavitación de nitrógeno previene el estrés físico externo en las células, evita el daño por calor a los orgánulos y el gas nitrógeno protege las células de la oxidación.
Además, es un método altamente reproducible. Suelte lentamente la presión en la cámara y recoja el izado. Luego, para eliminar los desechos celulares y los núcleos, centrifugar el material desnuspado a 800 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Recoger el sobrenadante vertiéndolo a través de un pedazo doblado de tela de muselina en un vaso de precipitados mantenido en hielo. No deseche el pellet. Resuspender el pellet en 90 mililitros de tampón MiBSM.
Luego, usando un homogeneizador de vidrio de teflón hacia abajo, homogeneizar la muestra y repetir la centrifugación a 800 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Una vez más, recoger el sobrenadante vertiéndolo a través de un pedazo doblado de tela de muselina en un vaso de precipitados mantenido en hielo. A continuación, combine este sobrenadante con el primer sobrenadante.
Centrifugar la muestra a 1.000 g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Luego, recoge el sobrenadante como antes. Después de desechar el pellet, centrifugar el sobrenadante que contiene mitocondrias brutas a 10.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos.
Lave cuidadosamente cualquier pellet suelto sin alterar la porción apretada. A continuación, utilice 10 mililitros de tampón MiBSM para resuspend el pellet apretado. Agregue 200 unidades de RNase-Free DNase a la muestra para extraer el ADN genómico y girar el tubo sobre un rodillo en la sala fría durante 20 minutos para digerir uniformemente la muestra.
Centrifugar la muestra a 10.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos y utilice dos mililitros de tampón SEM para resuspender el pellet. Cargue toda la suspensión mitocondrial en la parte superior del gradiente de sacarosa. Después de girar el degradado de acuerdo con el protocolo de texto, utilizando una pipeta de transferencia, recoja cuidadosamente la banda marrón migrando en la interfaz de 32% y 60%sacarosa.
Este protocolo utiliza cavitación de nitrógeno para romper las células. Una vez dominado, un aislamiento a gran escala de las mitocondrias intactas y altamente puras se puede hacer en un plazo de nueve horas y se puede modificar y adaptar fácilmente para diferentes tipos y escalas celulares. Después de descongelar las mitocondrias congeladas sobre hielo, agregue dos volúmenes de tampón de lelisis a tres mililitros de mitocondrias.
Mezcle inmediatamente invirtiendo el tubo varias veces. Utilice un pequeño homogeneizador de vidrio de teflón para ayudar con la lelisis e incubar el homogeneato sobre hielo durante cinco a 10 minutos para completar la reacción. Centrifugar el izado a 30.000 veces g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos para eliminar el material insoluble.
A continuación, recoja cuidadosamente el sobrenadante y deseche el pellet. Repita la centrifugación para asegurar la clarificación del sobrenadante. A continuación, recoja cuidadosamente el sobrenadante y deseche el pellet.
Para cada mililitro de material de lesido, prepare un cojín de sacarosa en un tubo ultra claro TLA-120.2 añadiendo 0,4 mililitros de cojín de sacarosa a los tubos. Capa de aproximadamente un mililitro de mitocondrias de lezado en cada cojín de sacarosa dando como resultado una relación de izado a cojín de 2,5 a uno. Luego, centrifuga la muestra en un rotor TLA-120.2 a 231, 550 veces g y cuatro grados Celsius durante 45 minutos.
Deseche el sobrenadante y utilice 100 microlitros del tampón de resuspensión para enjuagar el tubo y eliminar la sacarosa residual. Resuspender los pellets y combinarlos en un total de 100 microlitros de tampón de resuspensión. Mientras resuspender el pellet del cojín, es esencial realizar sobre hielo para evitar el calentamiento de la muestra y también para evitar la formación de espuma de la muestra con el fin de garantizar la integridad estructural de los ribosomas mitocondriales.
Vórtice la muestra a velocidad lenta durante 30 segundos para disolver los agregados restantes y centrifugar los tubos a 17, 949 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Recoja cuidadosamente el sobrenadante y repita la centrifugación. Después de medir la absorción mitoribosoma en A260, cargue toda la muestra en un solo tubo de gradiente de sacarosa lineal.
Centrifugar la muestra en un rotor TLS-55 a 213, 626 veces g y cuatro grados Celsius durante 120 minutos. Para fraccionar el gradiente, perfore la parte inferior del tubo y recoja la muestra en una placa de 96 pozos. La purificación del mitoribosoma no debe tardar más de siete horas en una cantidad suficiente de mitoribosomas.
Como se demuestra en este gradiente discontinuo de sacarosa, las mitocondrias purificadas migran a la banda inferior marrón en la interfaz 32-60%. Tras la separación de los mitoribotos de los complejos mitocondriales solubles en un gradiente de sacarosa, se identifican dos poblaciones mitoribosomales principales, el monosoma 55S y la subunidad grande 39S. La presencia de la fracción de subunidad grande sugiere que las células se cosechan en un estado de división activa.
Este panel muestra una micrografía con la muestra del pico monosoma dos en un aumento calibrado de 1,23 angstroms por píxel. Aquí se muestran datos después del procesamiento inicial que revelan monosomas intactos. Por último, en este panel se ilustra una reconstrucción 3D monosoma.
Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo preparar mitoribotosomas humanos intactos para estudios estructurales y bioquímicos. Nuestro protocolo ofrece preparaciones finales de alta calidad que podrían extrapolarse a otras macromoléculas mitocondriales.
