Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы очистить рибосомы от митохондрий клеточных линий человека в больших масштабах, что достаточно для структурных исследований. Этот митохондриальный метод очистки рибосомы позволяет о характеристике переводных комплексов, мутантов, сборок контроля качества и миторибосомальных промежуточных подразделений. Они могут быть использованы для ответа на ключевые вопросы об синтезе белка в митохондриях.
Основным преимуществом этого метода является то, что кавитация азота используется для клеточного лиза и только от 10 до 10 клеток культуры необходимы для подготовки mitoribosomes для определения структуры высокого разрешения. Этот метод может привести к открытию новых компонентов митохондрий перевод машины и может быть дополнительно использован для разработки новых терапевтических средств для лечения рака. После культивирования heK293S клеток в соответствии с текстовым протоколом, урожай двух один литр трубки клеток центрифугации в 1000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение семи минут.
Тщательно высасыв супернатант и быстро повторно помесить каждую гранулу в 100 миллилитров PBS. Затем, бассейн клеток и центрифуги подвески на 1200 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Далее, после тщательного декантирования супернатанта, взвесь гранулы.
Затем используйте 120 миллилитров буфера MIB, чтобы повторно использовать его и оставить перерасход клеток набухать в холодной комнате в течение 20 минут. Перенесите набухшее клеток в предварительно охлажденую камеру кавитации азота на льду. Затем добавьте в ячейки 45 миллилитров буфера SM4.
Закрепите камеру кавитации азота и заполните ее азотом до тех пор, пока давление не достигнет 500 PSI. Затем закройте краны и держите его на льду в течение 20 минут. Метод кавитации клеток азота предотвращает внешнюю физическую нагрузку на клетки, позволяет избежать теплового повреждения органелл, а азотный газ защищает клетки от окисления.
Кроме того, это очень воспроизводимый метод. Медленно отпустите давление в камере и соберите лисат. Затем, чтобы удалить клеточный мусор и ядра, центрифуга лизидного материала в 800 раз g и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут.
Соберите супернатант, наливая его через сложенный кусок муслина ткани в стакан хранится на льду. Не выбрасывайте гранулы. Переусердуйте гранулы в 90 миллилитров буфера MiBSM.
Затем, используя тефлоновый стакан вниз гомогенизатор, гомогенизировать образец и повторить центрифугации в 800 раз g и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Опять же, собирать супернатант, наливая его через сложенный кусок муслина ткани в стакан хранится на льду. Затем объедините этот супернатант с первым супернатантом.
Центрифуга образца в 1000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 15 минут. Затем соберите супернатант, как и раньше. После отбрасывания гранул центрифуги супернатант, содержащий сырые митохондрии, 10 000 раз г и четыре градуса Цельсия в течение 15 минут.
Тщательно вымойте любые свободные гранулы, не нарушая плотную часть. Затем используйте 10 миллилитров буфера MiBSM для повторного использования жесткой гранулы. Добавьте 200 единиц RNase-Free DNase в образец, чтобы удалить геномную ДНК и повернуть трубку на ролике в холодной комнате в течение 20 минут, чтобы равномерно переварить образец.
Центрифуга образца в 10 000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 15 минут и использовать два миллилитров буфера SEM для повторного перерасхода гранул. Загрузите всю митохондриальную подвеску поверх градиента сахарозы. После вращения градиента в соответствии с текстовым протоколом, используя перенесите пипетку, тщательно соберите коричневую полосу, мигрирующих на стыке 32%и 60% сахарозы.
Этот протокол использует кавитацию азота для разрыва клеток. После освоения, крупномасштабная изоляция очень чистых, нетронутых митохондрий может быть сделано в течение девяти часов и может быть легко изменена и адаптирована для различных типов клеток и весов. После разморажив замороженные митохондрии на льду, добавьте два тома буфера лиза в три миллилитра митохондрий.
Немедленно перемешайте, инвертировать трубку несколько раз. Используйте небольшой тефлоновый стакан вниз гомогенизатор, чтобы помочь с лизом и инкубировать гомогенат на льду в течение пяти-десяти минут, чтобы завершить реакцию. Центрифуга лисировать при 30 000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 20 минут, чтобы удалить нерастворимый материал.
Затем тщательно соберите супернатант и отбросьте гранулы. Повторите центрифугирование, чтобы обеспечить уточнение супернатанта. Затем тщательно соберите супернатант и отбросьте гранулы.
Для каждого миллилитра облизерного материала, подготовить подушку сахарозы в TLA-120.2 ультра ясно трубки, добавив 0,4 миллилитров подушки сахарозы в трубках. Слой примерно один миллилитр лизей митохондрий на каждой подушке сахарозы в результате лизата к подушке соотношение 2,5 к одному. Затем центрифуга образца в роторе TLA-120.2 в 231, 550 раз g и 4 градуса по Цельсию в течение 45 минут.
Откажитесь от супернатанта и используйте 100 микролитров буфера повторного незаменимия для полоскания трубки и удаления остаточной сахарозы. Повторное производство гранул и объединить их в общей сложности 100 микролитров буфера повторного незаменимия. При повторном использовании гранул подушки, важно выполнить на льду, чтобы избежать нагрева образца, а также, чтобы избежать вспенивания образца, с тем чтобы обеспечить структурную целостность митохондриальных рибосом.
Vortex образца на медленной скорости в течение 30 секунд, чтобы растворить оставшиеся агрегаты и центрифуги труб на 17, 949 раз g и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Аккуратно соберите супернатант и повторите центрифугу. После измерения поглощения миторибосомы на A260 загрузите весь образец на одну линейную градиентную трубку сахарозы.
Центрифуга образца в роторе TLS-55 в 213, 626 раз g и 4 градуса по Цельсию в течение 120 минут. Чтобы дробить градиент, проколоть дно трубки и собрать образец дроп-мудрый в 96-хорошо пластины. Очистка mitoribosome не должна занять более семи часов для достаточного количества mitoribosomes.
Как попродемонстрировано в этом прерывистом градиенте сахарозы, очищенные митохондрии мигрируют в коричневую нижнюю полосу на 32-60%интерфейсе. После отделения миторибосом от растворимых митохондриальных комплексов на градиенте сахарозы выявлены две основные миторибосомальные популяции: моносомная 55S и большая подлодка 39S. Наличие большой фракции субъединита позволяет предположить, что клетки собирают в активно делящихся состояниях.
На этой панели показан микрограф с образцом из моносомного пика два при откалиброванном увеличении 1,23 ангстрема на пиксель. Здесь показаны данные после первоначальной обработки выявления нетронутых моносом. Наконец, в этой панели иллюстрируется моносомная 3D-реконструкция.
После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как подготовить нетронутыми человека mitoribosomes для структурных и биохимических исследований. Наш протокол предлагает высококачественные окончательные препараты, которые могут быть экстраполированы на другие митохондриальные макромолекулы.
