肿瘤切片提取物的建立与分析是诊断检测的前提

这种方法可以帮助回答临床前研究中的关键问题，其中肿瘤切片外植的药物反应研究可能有助于诊断目的。该技术的主要优点是切片外植可以在短时间内模拟本地组织的复杂生物学，包括空间分布功能。虽然这种方法可以提供从穆林肺肿瘤切片的使用洞察，它也可以应用于其他组织类型，包括人体组织。

首先，准备振动器，并按照手册中提供的说明执行 VibraCheck。然后用汉克平衡盐溶液一毫升，辅以青霉素和链霉素，将盘子放在冰上。将 25 针插入安乐死小鼠的所有四爪，放在发泡胶盖上，使胸部暴露，动物被拉伸。

在暴露的皮肤表面喷洒 70% 的酒精。使用放置在倾斜位置的剪刀将皮肤从腹部切开，切到胸部，一直切开到颈部区域。使用钳子拉伸两侧的皮肤，并插入 25 个量表的针头。

切开腹部区域。然后切开肋骨笼和隔膜，露出肺和心脏。通过切割周围组织暴露气管。

解肺，连同心脏。将组织放入含有 30 毫升冰冷 HBS 的 50 毫升管中，并辅以放在冰上的 Pen-Strep，然后尽快进入下一步。现在将带有肿瘤的肺转移到10厘米的组织培养板中。

使用无菌剪刀和钳子分离肺叶，并选择表面有肿瘤的叶进行切片。将带肿瘤组织的肺叶放在一张滤纸上，以避免滑倒，并切掉肿瘤周围的部分正常肺或其他肿瘤组织，使用无菌手术刀生成扁平组织片面。将扁平的一滴氰丙烯酸酯粘合剂浸入一滴白化硅胶粘剂中，并安装到振动组试样支架上，使肿瘤以直立位置面对刀片，并让它干燥两到三分钟。

将振动器试样支架放入金属缓冲盘中。用用笔链补充的冷HSS填充托盘，直到组织浸入缓冲液中。用仪器提供的 Plexiglas 盖盖住缓冲盘，将托盘放入白色冰浴中，并添加冰，以保持组织在切片过程中保持凉爽。

将白色冰浴连接到振动器上。然后选择合适的切片设置并开始切片。将振动器刀片带到切片位置并设置切片窗口。

使用无菌钳收集切片在24井板充满一毫升的HPSS补充每井的Pen-Strep，并保持冰上。在跟踪切片顺序的同时，根据实验计划标记24井板的每个井。收集与培养切片相邻的组织切片，作为零小时或未培养的参考。

收集至少三个参考切片，以表示组织的顶部、中心和底部。切片完成后，继续修复和处理。之后，通过将钛网格放入中，准备一个包含每井2.5毫升培养介质的六井板。

确保钛栅格和介质之间没有形成气泡。将切片加载到网格上，使六井板保持倾斜位置，使介质的一部分覆盖网格。然后将切片放在网格上的介质中，并使用钳子进行摊铺。

放置切片后，将六孔板装载到放置在加湿培养箱内的旋转孵化单元上，该培养箱保持在 37 摄氏度，二氧化碳为 95%02 和 5%。开始旋转循环。为了长期栽培，每天使用无菌钳子来补充培养媒介，以提升含有组织切片的网格，并放在六井板的空井中。

用新鲜培养介质替换 70% 的介质，然后重新放置网格。继续旋转周期，如以前一样。用于肿瘤切片的药物治疗，将稀释药物或车辆控制添加2.5毫升的介质，进入六井板。

将钛网格放入孔中，然后像以前一样将切片放入网格上。进行24小时治疗后，继续修复和处理。开始修复所需的切片小心地将其转移到一个 10 厘米的板中，其中包含填充两到三毫升 PBS 的浸泡滤纸，并让它浮动。

然后用一对钳子把滤纸提起，放在一个纸盒里。将滤纸放入一个轮盘盒中。在组织切片上加入一滴稀释的赤氧树脂，以标记切片的位置，以完成后续步骤。

关闭盒式磁带，将其转移到 4% 中性缓冲形式溶液中，并在 4 摄氏度下过夜。在按协议所述清洗和处理盒式磁带后，打开磁带盒，并使用手术刀小心地从滤纸中提起固定切片。丢弃滤纸，将切片转移到含有液体石蜡的模具中。

使用平量将组织压在嵌入模具的底部，以确保均匀的分段。将轮盘盒的底部放在模具顶部。在上面加入液体石蜡。

让模具在冷盘上冷却30分钟。之后，将冷却的模具与石蜡块分离。使用微切器准备 FFPE 组织切片块的四微米薄部分。

修剪掉组织周围多余的石蜡。在整个组织中获得均匀部分，请调整块的角度，使块的表面与刀片水平方向。使用薄刷子收集从玻璃滑梯上部开始的石蜡嵌入组织切片的顺序组织部分。

继续收集深层组织层的部分到中间，然后是玻璃滑梯的底部。从每个组织切片的不同层到对象幻灯片的部分的集合，是为了在生存能力、细胞迁移或生物标志物表达中捕获潜在的培养诱导梯度。收集各节后，继续处理和进一步分析，如协议中所述。

组织切片厚度会影响培养切片的可行性。在这种情况下，250微米厚的切片显示坏死梯度增加，而200微米厚的切片由于较厚的切片容易在切片中缺氧或营养扩散。然而，160微米薄片包含较大的坏死区域，可能是由于在切片定位过程中的技术处理造成的，因为这些切片很脆弱，容易卷曲。

NKX2-1是分化良好的肺腺癌的标记，分析表明，与零小时未培养切片相比，其表达在培养切片中没有显著变化。NKX2-1表达的定量分析进一步证实，该表达在培养中与未培养的切片相比没有显著变化，这表明培养过程没有明显影响腺癌组织的分化状态。为了测试肿瘤组织切片是否可用于评估靶向药物的疗效，它们被DMSO或滴定量的化合物治疗。

当用一个微摩尔dactolisib治疗时，它的目标为4EBP1的mTOR通路磷酸化被抑制。0.5 以 MAP 激酶通路为目标的微摩尔黄豆酰胺有效抑制 ERK1/2 的磷酸化。看完这个视频后，你应该有一个很好的理解，如何工作，并批判性地分析切片新鲜切从珍贵的肿瘤组织。

我们的前博士后Katja Narhi与IMI预处理联盟组织切片平台的同事合作，为这种方法的建立做出了贡献。