この方法は、腫瘍スライス外植の薬物応答研究が診断目的に役立つ可能性のある前臨床研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、スライスの外植は、空間的に分散された関数を含むネイティブ組織の複雑な生物学をモデル化する時間の短いウィンドウのためにできることです。この方法は、マウス肺腫瘍からのスライスの使用に関する洞察を提供することができるが、それはまた、ヒト組織を含む他の組織タイプに適用することができる。
開始するには、ビブラートを準備し、マニュアルに記載されている指示に従ってVibraCheckを実行します。その後、ペニシリンとストレプトマイシンを補ったハンクのバランス塩溶液の1ミリリットルで24ウェルプレートの各井戸を充填し、氷の上にプレートを保ちます。胸が露出し、動物が引き伸ばされるように、発泡スチロールの蓋の上に置かれた安楽死マウスの4つの足すべてに25ゲージの針を挿入します。
露出した皮膚の表面に70%アルコールをスプレーします。斜めの位置に置かれたはさみを使用して、腹部から胸に向かって、そして首の領域まで皮膚を切り開きます。鉗子を使用して両側の皮膚を伸ばし、25ゲージの針を挿入します。
腹部を切り開く。次に、肋骨ケージと横隔膜を切り開いて肺と心臓を露出します。周囲の組織を切り取って気管を露出させる。
心臓と一緒に肺を解剖する。30ミリリットルの氷冷HBSSを含む50ミリリットルのチューブに組織を入れ、氷の上に置かれたペンストレップを補い、できるだけ早く次のステップに進みます。今度は腫瘍を持つ肺を10センチメートルの組織培養プレートに移す。
生殖不能のはさみおよび鉗子を使用して肺の葉を分離し、スライスのために表面に腫瘍を有するローブを選択する。濾紙の上に腫瘍組織を持つ肺葉を置き、滅菌メスを使用して腫瘍を取り囲む正常な肺または追加の腫瘍組織の一部を切り取って平らな組織片表面を生成するのを避ける。シアノアクリル酸接着剤の滴で平らな側を浸し、腫瘍が直立した位置でブレードに向かうことができるようにビブラートメ標本ホルダーに取り付け、2〜3分間乾燥させます。
ビブラートメの標本ホルダーを金属バッファートレイに入れます。ティッシュがバッファーに浸されるまでペンストレップで補った冷たいHBSSでトレイを満たします。楽器に付属のプレキシグラス蓋でバッファートレイを覆い、トレイを白い氷浴に入れ、スライス中に組織を冷たく保つために氷を加えます。
白い氷浴をビブラートメに取り付けます。次に、適切なスライス設定を選択し、スライスを開始します。ビブラートメブレードをスライス位置に持ってきて、スライスウィンドウを設定します。
滅菌鉗子を使用して、1ウェルあたりPen-Strepを補ったHBSSの1ミリリットルで満たされた24ウェルプレートにスライスを収集し、氷の上に保ちます。スライスの順序を追跡しながら、実験計画に従って24ウェルプレートの各ウェルをマークします。培養スライスに隣接する組織スライスをゼロ時間または未培養参照として収集する。
組織の上部、中央、底部を表すために、少なくとも3つの参照スライスを収集します。スライスが完了したら、修正と処理を続けます。その後、チタングリッドを入れて、1ウェルあたり2.5ミリリットルの培養培地を含む6ウェルプレートを準備します。
チタングリッドと媒体の間に気泡が形成されないようにしてください。スライスをグリッドにロードするには、6 ウェル プレートを斜めの位置に保ち、メディアの一部がグリッドを覆います。次に、スライスをグリッド上の媒体に配置し、鉗子を使用して広げます。
スライスを配置した後、95%02と5%CO2で摂氏37度に維持加湿インキュベーターの中に置かれた回転インキュベーターに6ウェルプレートをロードします。回転サイクルを開始します。長期間の栽培のために、滅菌鉗子を使用して組織スライスを含むグリッドを持ち上げ、6ウェルプレートの空の井戸に入れ、毎日培養培地を補充する。
培地の70%を新鮮な培養培地に置き換え、グリッドを元に戻します。以前と同様に、回転サイクルを継続します。腫瘍スライスの薬物治療のために、希釈された薬物または車両制御を有する培地2.5ミリリットルを6ウェルプレートに加える。
チタングリッドを井戸に入れ、スライスを先に行ったようにグリッドに配置します。24時間治療を行った後、固定処理を続ける。所望のスライスの固定を開始するには、慎重に2〜3ミリリットルPBSで満たされた浸した濾紙を含む10センチメートルのプレートに鉗子を使用してそれを転送し、それを浮かべます。
次に、フィルターペーパーを鉗子で持ち上げ、ヒストカセットに入れ。フィルター用紙をヒストカセットに移します。組織スライスの上に希釈したヘマトキシリンの滴を加えて、その後のステップのスライスの位置をマークします。
カセットを閉じ、4%中性緩衝ホルマリン溶液に移し、摂氏4度で一晩放置します。プロトコルに記載されているようにカセットの洗浄と処理後、ヒストカセットを開き、メスを使用してフィルターペーパーから固定スライスを慎重に持ち上げます。濾紙を捨てて、流動パラフィンを含むモールドにスライスを移します。
平らな重量を使用して、均一な断面化を確実にするために、埋め込み型の底部に対して組織を押し付ける。金型の上にヒストカセットの下部を置きます。その上に流動パラフィンを加えます。
そして、冷たいプレートで30分間カビを冷まします。その後、冷却された金型をパラフィンブロックから分離する。マイクロトームを使用して、FFPE組織スライスブロックの4マイクロメートルの薄い切片を調製します。
組織を取り巻くパラフィンの過剰をトリミングします。組織全体の切片を得るためには、ブロックの表面がブレードに対して水平方向に向くようにブロックの角度を調整する。薄いブラシを使用すると、パラフィン埋め込み組織スライスのシーケンシャルな組織切片が、スライドガラスの上部から採取されます。
より深い組織層のセクションを中央に集め続け、続いてガラススライドの下部を採取する。各組織スライスの異なる層からオブジェクトスライドまでのセクションの収集は、生存率、細胞遊離またはバイオマーカー発現における潜在的な培養誘発勾配の捕獲を可能にするために行われる。セクションを収集した後、プロトコルで説明されているように、その処理とさらなる分析を続行します。
組織スライスの厚さは、培養スライスの生存率に影響を与える可能性があります。この場合、厚さ250マイクロメートルのスライスは、厚いスライスがスライス全体の酸素または栄養拡散の欠乏を起こしやすいため、厚いスライスと比較して壊死勾配が増加することを示しています。しかし、160マイクロメートルの薄いスライスは、これらは壊れやすく、カールする傾向があるため、スライスの位置決め時の技術的な取り扱いによって引き起こされる大きな壊死領域を含んでいる可能性があります。
よく分化した肺腺癌のマーカーであるNKX2-1の分析は、培養スライスの発現が、培養されていないスライスのゼロ時間と比較して有意に変化しないことを示している。NKX2-1発現の定量分析は、培養スライスと未培養スライスにおいて発現が有意に変化していないことをさらに確認し、培養プロセスが腺癌組織の分化状態に目に見えて影響を及ぼさないことを示唆した。腫瘍組織スライスを使用して標的薬物の有効性を評価できるかどうかを試験するために、DMSOまたは滴定量の化合物で治療した。
4EBP1のmTOR経路リン酸化を標的とする1つのミクロモルダクトリシブで処理した場合、阻害された。MAPキナーゼ経路を標的とする0.5マイクロモルセルメチニブは、ERK1/2のリン酸化を阻害するのに有効であった。このビデオを見た後、あなたは、貴重な腫瘍組織から切り取られたスライスを扱い、批判的に分析する方法をよく理解している必要があります。
私たちの以前のポスドク、Katja Narhiは、IMIプレデックコンソーシアムティッシュスライスプラットフォームの同僚と共同でこの方法の確立に大きく貢献しました。
