Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación preclínica, donde los estudios de respuesta a fármacos en explantes de rebanadas tumorales pueden servir para fines diagnósticos. La principal ventaja de esta técnica es que los explantes de rebanadas pueden para un corto período de tiempo modelar la compleja biología de los tejidos nativos, incluidas las funciones distribuidas espacialmente. Aunque este método puede proporcionar información sobre el uso de rebanadas de tumores pulmonares murinos, también se puede aplicar a otros tipos de tejido, incluidos los tejidos humanos.
Para empezar, prepare el vibratome y realice un VibraCheck de acuerdo con las instrucciones proporcionadas en el manual. A continuación, llene cada pozo de la placa de 24 pozos con un mililitro de solución de sal equilibrada de Hank complementada con penicilina y estreptomicina y mantenga la placa en hielo. Inserte agujas de calibre 25 en las cuatro patas de un ratón eutanizado colocado en una tapa de espuma de poliestireno para que el pecho quede expuesto y el animal se estire.
Rocíe 70%alcohol en la superficie de la piel expuesta. Utilice tijeras colocadas en una posición en ángulo para abrir la piel desde el abdomen hacia el pecho y hasta la región del cuello. Estire la piel a cada lado con fórceps e inserte agujas de calibre 25.
Abra la región abdominal. Luego abre la caja torácica y el diafragma para exponer el pulmón y el corazón. Exponga la tráquea cortando el tejido circundante.
Disecciona los pulmones, junto con el corazón. Coloque los tejidos en un tubo de 50 mililitros que contenga 30 mililitros de HBSS helado complementado con Pen-Strep colocado en hielo y proceda al siguiente paso lo más rápido posible. Ahora transfiera los pulmones que soportan tumores a una placa de cultivo de tejido de 10 centímetros.
Utilice tijeras y fórceps estériles para separar los lóbulos pulmonares y seleccionar lóbulos con tumores en la superficie para cortar. Coloque un lóbulo pulmonar con un tejido tumoral en un pedazo de papel de filtro para evitar resbalones y corte parte del pulmón normal o tejido tumoral adicional que rodea el tumor utilizando un bisturí estéril para generar una superficie plana de la pieza de tejido. Sumerja el lado plano en una gota de adhesivo de cianoacrilato y colóquelo en el soporte de la muestra de vibratoma para que el tumor se enfrente a la hoja en posición vertical, y déjela secar durante dos o tres minutos.
Coloque el soporte de la muestra de vibratomo en la bandeja de tampón de metal. Llene la bandeja con HBSS frío complementado con Pen-Strep hasta que el tejido se sumerja en el tampón. Cubra la bandeja tampón con la tapa del plexiglás que se suministra con el instrumento y coloque la bandeja en un baño de hielo blanco y agregue hielo para mantener el tejido fresco durante el corte.
Fije el baño de hielo blanco al vibratome. A continuación, seleccione los ajustes de corte adecuados y comience a cortar. Lleve la hoja vibratome a la posición de corte y ajuste la ventana de corte.
Utilice fórceps estériles para recoger las rodajas en una placa de 24 pocillos llenas de un mililitro de HBSS complementado con Pen-Strep por pozo y mantener en hielo. Mientras realiza un seguimiento del orden de corte, marque cada pozo de la placa de 24 pozos de acuerdo con el plan experimental. Recopile una rebanada de tejido adyacente a las rebanadas cultivadas como una referencia de cero horas o sin cultura.
Recoja al menos tres rebanadas de referencia para representar la parte superior, central e inferior del tejido. Y una vez completado el corte, continúe con la fijación y el procesamiento. Después de eso, preparar una placa de seis pozos que contenga 2,5 mililitros de medio de cultivo por pozo mediante la colocación de rejillas de titanio en él.
Asegúrese de que no se forman burbujas de aire entre la rejilla de titanio y el medio. Para cargar un corte en la rejilla, mantenga la placa de seis pozos en una posición en ángulo para que una parte del medio cubra la rejilla. A continuación, coloque la rebanada en el medio en la cuadrícula y use fórceps para esparcirla.
Después de colocar las rodajas, cargue las placas de seis pocillos sobre la unidad de incubación giratoria colocada dentro de una incubadora humidificada mantenida a 37 grados celsius con 95%02 y 5%CO2. Inicie el ciclo de rotación. Para el cultivo a largo plazo reponer el medio de cultivo todos los días mediante el uso de fórceps estériles para levantar la rejilla que contiene las rodajas de tejido y colocarlo en un pozo vacío de la placa de seis pocillos.
Sustituya el 70% del medio por un medio de cultivo fresco y vuelva a colocar la rejilla. Continúe el ciclo de rotación como se ha publicado anteriormente. Para el tratamiento farmacológico en las rodajas tumorales añadir 2,5 mililitros de medios con el medicamento diluido o el control del vehículo en la placa de seis pozos.
Coloque las rejillas de titanio en los pozos y luego coloque las rodajas en las rejillas como se hizo anteriormente. Después de realizar los tratamientos durante 24 horas, continúe con la fijación y el procesamiento. Para empezar a fijar la rebanada deseada, transfiérala cuidadosamente usando fórceps en una placa de 10 centímetros que contenga un papel de filtro empapado lleno de dos a tres mililitros PBS y déjelo flotar.
A continuación, levante el papel de filtro con un par de fórceps y colóquelo en un casete histo. Transfiera el papel de filtro a un cassette histo. Agregue una gota de hematoxilina diluida en la parte superior de la rebanada de tejido para marcar la posición de la rebanada para los pasos posteriores.
Cierre el cassette y transfiérelo a una solución de formalina tamponada 4%neutral y déjela durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de lavar y procesar el cassette como se describe en el protocolo, abra el cassette histo y utilice un bisturí para levantar cuidadosamente la rebanada fija del papel de filtro. Deseche el papel de filtro y transfiera la rebanada a un molde que contenga parafina líquida.
Utilice un peso plano para presionar el tejido contra la parte inferior del molde de incrustación para asegurar una sección uniforme. Coloque la parte inferior del cassette histo en la parte superior del molde. Agregue parafina líquida encima.
Y deje que el molde se enfríe en una placa fría durante 30 minutos. Después de eso separar el molde enfriado del bloque de parafina. Use un microtoma para preparar secciones delgadas de cuatro micrómetros de los bloques de corte de tejido FFPE.
Recorta el exceso de parafina que rodea el tejido. Para obtener secciones pares a lo largo del tejido, ajuste el ángulo del bloque de modo que la superficie del bloque esté orientada horizontalmente con respecto a la hoja. Usando un cepillo delgado, recoja secciones de tejido secuenciales de la rebanada de tejido incrustada en parafina comenzando en la parte superior de los portaobjetos de vidrio.
Continúe recogiendo las secciones de las capas de tejido más profundas hacia el centro, seguidas de la parte inferior de los portaobjetos de vidrio. La colección de secciones de diferentes capas de cada sector de tejido a las diapositivas de objetos se realiza para permitir la captura de posibles gradientes inducidos por el cultivo en viabilidad, migración celular o expresión de biomarcador. Después de recopilar las secciones continuar con su procesamiento y análisis posterior como se describe en el protocolo.
El grosor de las rebanadas de tejido puede influir en la viabilidad de las rodajas cultivadas. En este caso, las rodajas gruesas de 250 micrómetros muestran gradientes de necrosis aumentados en comparación con las rodajas de 200 micrómetros de espesor debido a que las rodajas más gruesas se vuelven propensas a deficiencias en la difusión de oxígeno o nutrientes a través de las rodajas. Sin embargo, las rodajas delgadas de 160 micrómetros contienen grandes áreas necróticas probablemente causadas por el manejo técnico durante el posicionamiento de las rodajas, ya que son frágiles y tienden a curvarse.
El análisis de NKX2-1, un marcador de adenocarcinoma pulmonar bien diferenciado, muestra que su expresión no se altera significativamente en las rodajas cultivadas en comparación con las rodajas no cultivadas de hora cero. El análisis cuantitativo de la expresión NKX2-1 confirmó además que la expresión no se alteró significativamente en las rodajas cultivadas frente a las no cultivadas, lo que sugiere que el proceso de cultivo no afecta visiblemente al estado de diferenciación del tejido adenocarcinoma. Para comprobar si se pueden utilizar rebanadas de tejido tumoral para evaluar la eficacia de los medicamentos dirigidos, se trataron con DMSO o cantidades valoradas de compuestos.
Cuando se trata con un dactolisib micromolar que se dirige a la fosforilación de la vía mTOR de 4EBP1 se inhibió. 0.5 selumetinib micromolar que se dirige a la vía de la quinasa MAP fue eficaz para inhibir la fosforilación de ERK1/2. Después de ver este video usted debe tener una buena comprensión de cómo trabajar con y analizar críticamente las rebanadas recién cortadas de los tejidos tumorales preciosos.
Nuestro antiguo postdoc, Katja Narhi, contribuyó significativamente al establecimiento de este método en colaboración con colegas de la plataforma IMI Predect Consortium Tissue Slice Platform.
