Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans la recherche préclinique, où les études de réponse médicamenteuse dans les explants de tranches tumorales peuvent servir à des fins diagnostiques. Le principal avantage de cette technique est que les explants de tranches peuvent pour une courte fenêtre de temps modéliser la biologie complexe des tissus indigènes, y compris les fonctions réparties spatialement. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’utilisation de tranches de tumeurs pulmonaires murines, elle peut également être appliquée à d’autres types de tissus, y compris les tissus humains.
Pour commencer, préparez le vibratome et effectuez un VibraCheck selon les instructions fournies dans le manuel. Remplissez ensuite chaque puits de la plaque de 24 puits d’un millilitre de solution de sel équilibré de Hank complétée par de la pénicilline et de la streptomycine et gardez la plaque sur la glace. Insérez des aiguilles de calibre 25 dans les quatre pattes d’une souris euthanasié placées sur un couvercle en polystyrène afin que la poitrine soit exposée et que l’animal soit étiré.
Vaporiser 70% d’alcool à la surface de la peau exposée. Utilisez des ciseaux placés en position inclinée pour couper la peau de l’abdomen vers la poitrine et jusqu’à la région du cou. Étirez la peau de chaque côté à l’aide de forceps et insérez des aiguilles de calibre 25.
Coupez la région abdominale. Ensuite, coupez la cage thoracique et le diaphragme pour exposer le poumon et le cœur. Exposer la trachée en coupant les tissus environnants.
Disséquer les poumons, avec le cœur. Placez les tissus dans un tube de 50 millilitres contenant 30 millilitres de HBSS glacé complété par pen-strep placé sur la glace et passez à l’étape suivante aussi rapidement que possible. Maintenant, transférez les poumons porteurs de tumeurs dans une plaque de culture tissulaire de 10 centimètres.
Utilisez des ciseaux stériles et des forceps pour séparer les lobes pulmonaires et sélectionner les lobes avec des tumeurs à la surface pour trancher. Placez un lobe pulmonaire avec un tissu tumoral sur un morceau de papier filtre pour éviter de glisser et de découper une partie du poumon normal ou du tissu tumoral supplémentaire qui entoure la tumeur à l’aide d’un scalpel stérile pour générer une surface plate de morceau de tissu. Tremper le côté plat dans une goutte d’adhésif cyanoacrylate et le monter sur le porte-spécimen vibratome de sorte que la tumeur fait face à la lame en position verticale, et laisser sécher pendant deux à trois minutes.
Placez le porte-spécimen vibratome dans le bac tampon métallique. Remplissez le plateau de HBSS froid complété par Pen-Strep jusqu’à ce que le tissu soit immergé dans le tampon. Couvrir le plateau tampon avec le couvercle en plexiglas fourni avec l’instrument et placer le plateau dans un bain de glace blanche et ajouter de la glace pour garder le tissu au frais pendant le tranchage.
Attachez le bain de glace blanche au vibratome. Sélectionnez ensuite les réglages de tranchage appropriés et commencez à trancher. Amenez la lame vibratoire à la position de tranchage et réglez la fenêtre de tranchage.
Utilisez des forceps stériles pour recueillir les tranches dans une assiette de 24 puits remplie d’un millilitre de HBSS complétée par Pen-Strep par puits et garder sur la glace. Tout en gardant une trace de l’ordre de tranchage, marquer chaque puits de la plaque de 24 puits selon le plan expérimental. Recueillir une tranche de tissu adjacente aux tranches de culture comme une référence zéro heure ou inculte.
Recueillir au moins trois tranches de référence pour représenter le haut, le centre et le bas du tissu. Et une fois le tranchage terminé, continuer avec la fixation et le traitement. Après cela, préparez une plaque de six puits contenant 2,5 millilitres de milieu de culture par puits en y plaçant des grilles de titane.
Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est formée entre la grille de titane et le milieu. Pour charger une tranche sur la grille garder la plaque de six puits dans une position inclinée de sorte qu’une partie du milieu couvre la grille. Ensuite, placez la tranche dans le milieu sur la grille et utilisez des forceps pour la répandre.
Après avoir placé les tranches, chargez les plaques de six puits sur l’unité d’incubation rotative placée à l’intérieur d’un incubateur humidifié maintenu à 37 degrés Celsius avec 95%02 et 5%CO2. Démarrez le cycle de rotation. Pour la culture à long terme reconstituer le milieu de la culture tous les jours en utilisant des forceps stériles pour soulever la grille contenant les tranches de tissu et le placer dans un puits vide de la plaque de six puits.
Remplacez 70% du milieu par un milieu de culture frais et replacez la grille. Continuez le cycle de rotation comme précédemment. Pour le traitement médicamenteux sur les tranches de tumeur ajouter 2,5 millilitres de médias avec le médicament dilué ou le contrôle du véhicule dans la plaque de six puits.
Placez les grilles de titane dans les puits, puis placez les tranches sur les grilles comme cela a été fait précédemment. Après avoir effectué les traitements pendant 24 heures, continuer avec la fixation et le traitement. Pour commencer à fixer la tranche désirée, transférez-la soigneusement à l’aide de forceps dans une plaque de 10 centimètres contenant un papier filtre trempé rempli de deux à trois millilitres PBS et laissez-la flotter.
Soulevez ensuite le papier filtre avec une paire de forceps et placez-le dans une cassette histo. Transférer le papier filtre dans une cassette histo. Ajouter une goutte d’hématoxyline diluée sur le dessus de la tranche de tissu pour marquer la position de la tranche pour les étapes suivantes.
Fermez la cassette et transférez-la dans une solution formaline tamponnée neutre de 4 % et laissez-la pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Après le lavage et le traitement de la cassette tel que décrit dans le protocole, ouvrez la cassette d’histo et utilisez un scalpel pour soulever soigneusement la tranche fixe du papier filtre. Jeter le papier filtre et transférer la tranche dans un moule contenant de la paraffine liquide.
Utilisez un poids plat pour appuyer sur le tissu contre le fond du moule d’intégration pour assurer même la section. Placez la partie inférieure de la cassette histo sur le dessus du moule. Ajouter la paraffine liquide sur le dessus.
Et laisser refroidir le moule sur une plaque froide pendant 30 minutes. Après cela séparer le moule refroidi du bloc de paraffine. Utilisez un microtome pour préparer des sections minces de quatre micromètres des blocs de tranches de tissu FFPE.
Coupez l’excès de paraffine entourant le tissu. Pour obtenir des sections différentes dans tout le tissu ajuster l’angle du bloc de sorte que la surface du bloc est orientée horizontalement par rapport à la lame. À l’aide d’une fine brosse recueillir des sections séquentielles de tissu de la tranche de tissu paraffine intégrée à partir de la partie supérieure des glissières en verre.
Continuez à recueillir les sections des couches tissulaires plus profondes jusqu’au milieu, suivies de la partie inférieure des glissières de verre. La collecte de sections de différentes couches de chaque tranche de tissu aux diapositives d’objet est effectuée pour permettre la capture des gradients potentiels induits par la culture dans la viabilité, la migration cellulaire ou l’expression des biomarqueurs. Après avoir recueilli les sections continuer avec leur traitement et une analyse plus approfondie comme décrit dans le protocole.
L’épaisseur des tranches de tissu peut influencer la viabilité des tranches de culture. Dans ce cas, les tranches épaisses de 250 micromètres montrent des gradients de nécrose accrus par rapport aux tranches épaisses de 200 micromètres dues à des tranches plus épaisses qui deviennent sujettes à des carences en oxygène ou en éléments nutritifs dans les tranches. Cependant, les tranches minces de 160 micromètres contiennent de grandes zones nécrotiques probablement causées par la manipulation technique lors du positionnement des tranches car celles-ci sont fragiles et ont tendance à se courber.
L’analyse de NKX2-1, un marqueur de l’adénocarcinome pulmonaire bien différencié, montre que son expression n’est pas sensiblement altérée dans les tranches de culture par rapport aux tranches non cultivées de zéro heure. L’analyse quantitative de l’expression NKX2-1 a également confirmé que l’expression n’a pas été sensiblement modifiée dans les tranches cultivées par rapport aux tranches non cultivées, suggérant que le processus de culture n’affecte pas visiblement le statut de différenciation du tissu d’adénocarcinome. Pour vérifier si des tranches de tissu tumoral peuvent être utilisées pour évaluer l’efficacité des médicaments ciblés, elles ont été traitées avec du DMSO ou des quantités titrées de composés.
Lorsqu’il est traité avec un dactolisib micromolaire qui cible la phosphorylation de la voie mTOR de 4EBP1 a été inhibé. 0.5 selumetinib de micromolaire qui cible la voie de kinase de MAP était efficace en inhibant la phosphorylation d’ERK1/2. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de travailler avec et d’analyser de façon critique les tranches fraîchement coupées à partir de tissus tumoraux précieux.
Notre ancien postdoc, Katja Narhi, a contribué de manière significative à la mise en place de cette méthode en collaboration avec des collègues de la plate-forme IMI Predect Consortium Tissue Slice.
