이 방법은 종양 슬라이스 각질에 있는 약 반응 연구 결과가 진단 목적을 봉사할 수 있는 전임상 연구에서 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 슬라이스 이출이 공간적으로 분산된 기능을 포함하여 네이티브 조직의 복잡한 생물학을 짧은 시간 동안 모델링할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 뮤린 폐 종양에서 슬라이스의 사용에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 인간의 조직을 포함한 다른 조직 유형에 적용 될 수있다.
시작하려면 진동을 준비하고 설명서에 제공된 지침에 따라 VibraCheck를 수행합니다. 그런 다음 페니실린과 연쇄상 구균으로 보충한 행크의 균형 잡힌 소금 용액 1밀리리터로 24웰 플레이트의 각 우물을 채우고 접시를 얼음 위에 보관하십시오. 가슴이 노출되고 동물이 뻗어 있도록 스티로폼 뚜껑에 놓인 안락사 마우스의 네 발에 25 게이지 바늘을 삽입합니다.
노출된 피부 표면에 70%의 알코올을 분사합니다. 각진 자세에 놓인 가위를 사용하여 복부에서 가슴과 목 부위까지 피부를 잘라냅니다. 집게를 사용하여 양쪽에 피부를 스트레칭하고 25 게이지 바늘을 삽입합니다.
복부 영역을 열어 잘라. 그런 다음 갈비뼈와 다이어프램을 열어 폐와 심장을 노출시합니다. 주변 조직을 절단하여 기관체를 노출합니다.
폐를 심장과 함께 해부합니다. 페틀-스트렙이 얼음 위에 올려놓은 얼음 차가운 HBSS 30밀리리터를 함유한 50밀리리터 튜브에 티슈를 넣고 가능한 한 빨리 다음 단계로 진행합니다. 이제 종양 베어링 폐를 10센티미터 조직 배양 판으로 옮기.
멸균 가위와 집게를 사용하여 폐 로브를 분리하고 슬라이스를 위해 표면에 종양이 있는 로브를 선택합니다. 종양 조직을 필터 용지에 놓고 정상적인 폐 또는 멸균 메스를 사용하여 종양을 둘러싸는 추가 종양 조직의 일부를 잘라 내어 평평한 조직 조각 표면을 생성합니다. 평평한 면을 청착색으로 찍어 진동시 표본 홀더에 장착하여 종양이 블레이드를 똑바로 세울 수 있도록 2~3분 동안 건조시키십시오.
진동 용 표본 홀더를 금속 버퍼 트레이에 넣습니다. 조직이 완충제에 침지될 때까지 펜 스트렙으로 보충된 차가운 HBSS로 트레이를 채웁니다. 완충 트레이에 악기가 제공된 플렉시글라스 뚜껑을 덮고 트레이를 하얀 얼음 욕조에 넣고 얼음을 추가하여 슬라이스 하는 동안 조직을 시원하게 유지합니다.
진동기에 하얀 얼음 목욕을 부착합니다. 그런 다음 적절한 슬라이싱 설정을 선택하고 슬라이스를 시작합니다. 진동 블레이드를 슬라이스 위치에 가져와 슬라이스 창을 설정합니다.
멸균 집게를 사용하여 24웰 플레이트에 펜 스트렙으로 보충된 HBSS 1밀리리터로 채워진 슬라이스를 수집하고 얼음을 유지합니다. 슬라이스 순서를 추적하는 동안, 실험 계획에 따라 24 웰 플레이트의 각 우물을 표시합니다. 배양된 슬라이스에 인접한 조직 조각을 0시간 또는 배양되지 않은 참조로 수집합니다.
조직의 상단, 중앙 및 바닥을 나타내기 위해 적어도 세 개의 참조 조각을 수집합니다. 그리고 슬라이스가 완료되면 고정 및 처리를 계속하십시오. 그 후 티타늄 그리드를 배치하여 양배 배지 2.5 밀리리터를 포함하는 6웰 플레이트를 잘 준비합니다.
티타늄 그리드와 매체 사이에 기포가 형성되지 않았는지 확인합니다. 그리드에 슬라이스를 로드하려면 6웰 플레이트를 각진 위치에 유지하여 매체의 일부가 그리드를 덮습니다. 그런 다음 그리드의 매체에 슬라이스를 놓고 집게를 사용하여 확산합니다.
슬라이스를 놓은 후 6웰 플레이트를 가습된 인큐베이터 내부에 배치하여 95%02 및 5%CO2로 섭씨 37도유지에 배치된 회전 인큐베이션 장치에 적재합니다. 회전 주기를 시작합니다. 장기 재배를 위해 멸균 집게를 사용하여 조직 조각을 포함하는 그리드를 들어 올리고 6웰 플레이트의 빈 우물에 배치하여 매일 배양 배지를 보충한다.
매체의 70%를 신선한 배양 매체로 교체하고 그리드를 다시 배치합니다. 이전과 같이 회전 주기를 계속합니다. 종양 슬라이스에 약물 치료를 위해 6웰 플레이트에 희석 약물 또는 차량 제어와 미디어의 2.5 밀리리터를 추가합니다.
티타늄 그리드를 우물에 넣은 다음 조각조각을 이전과 마찬가지로 그리드에 놓습니다. 24 시간 동안 치료를 수행 한 후, 고정 및 처리를 계속합니다. 원하는 슬라이스를 조심스럽게 10센티미터 플레이트에 넣고 2~3밀리리터 PBS로 채워진 적폐종이를 담고 있어 부동하게 한다.
그런 다음 필터 용지를 한 쌍의 집게로 들어 올려 히스토 카세트에 놓습니다. 필터 용지를 히스토 카세트로 옮킨다. 후속 단계에 대한 슬라이스의 위치를 표시하기 위해 티슈 슬라이스 위에 희석 된 헤마톡린 한 방울을 추가합니다.
카세트를 닫고 4% 중립 버퍼링 된 포르말린 솔루션으로 옮기고 섭씨 4도에서 하룻밤을 둡니다. 프로토콜에 설명된 바와 같이 카세트의 세척 및 처리 후 히스토 카세트를 열고 메스를 사용하여 필터 용지에서 고정 된 조각을 조심스럽게 들어 올립니다. 필터 용지를 버리고 슬라이스를 액체 파라핀이 들어 있는 몰드로 옮겨 넣습니다.
평평한 무게를 사용하여 포함 금형의 바닥에 대해 조직을 눌러 균일한 단면도 보장합니다. 히스토 카세트의 하단 부분을 금형 위에 놓습니다. 그 위에 액체 파라핀을 넣습니다.
그리고 30 분 동안 차가운 접시에 금형을 식히게하십시오. 그 후 파라핀 블록에서 냉각 된 금형을 분리합니다. 마이크로토메를 사용하여 FFPE 조직 슬라이스 블록의 4마이크로미터 얇은 섹션을 준비합니다.
조직을 둘러싼 파라핀의 과잉을 잘라냅니다. 조직 전체에 걸쳐 균일 한 섹션을 얻기 위해 블록의 표면이 블레이드에 대하여 수평 으로 지향되도록 블록의 각도를 조정합니다. 얇은 브러시를 사용하여 유리 슬라이드의 상부에서 시작하여 파라핀 임베디드 조직 슬라이스의 순차적 조직 섹션을 수집합니다.
유리 슬라이드의 하단 부분이 그 뒤를 잇고, 중간에 더 깊은 조직 층의 섹션을 계속 수집합니다. 각 조직 슬라이스의 상이한 층에서 물체 슬라이드에 이르는 섹션의 컬렉션은 생존가능성, 세포 이동 또는 바이오마커 발현에서 배양 유도그라데이션의 캡처를 가능하게 한다. 섹션을 수집한 후 프로토콜에 설명된 대로 처리 및 추가 분석을 계속합니다.
조직 슬라이스 두께는 배양 된 조각의 생존에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 경우 250마이크로미터 두께의 슬라이스는 슬라이스 전반에 걸쳐 산소 나 영양 확산의 결핍이 발생하기 쉽기 때문에 두꺼운 슬라이스로 인해 200 마이크로 미터 두께의 슬라이스에 비해 괴사 그라데이션이 증가합니다. 그러나, 160 마이크로미터 얇은 조각은 아마 이들이 깨지기 쉽고 곱슬 하는 경향이 슬라이스의 위치 지정 하는 동안 기술적 처리에 의해 발생 하는 큰 괴사 영역을 포함.
잘 분화된 폐 아데노암종의 마커인 NKX2-1의 분석은 배양된 슬라이스에서 0시간 비배양식 슬라이스에 비해 발현이 크게 변하지 않는다는 것을 보여준다. NKX2-1 발현의 정량적 분석은 발현이 배양된 슬라이스대 배양에서 현저히 변화되지 않았다는 것을 확인했으며, 이는 재배 과정이 아데노암 조직의 분화 상태에 눈에 띄게 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다. 종양 조직 슬라이스가 표적 약물의 효능을 평가하는 데 사용될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 DMSO 또는 적정량의 화합물로 치료하였다.
4EBP1의 mTOR 통로 인산화를 표적으로 하는 1개의 마이크로몰러 dactolisib로 취급될 때 억제되었다. 0.5 마이크로몰라 셀루메티닙은 MAP 키나아제 경로를 표적으로 하는 ERK1/2의 인산화를 억제하는 데 효과적이었다. 이 비디오를 시청한 후에는 귀중한 종양 조직에서 갓 잘라낸 슬라이스를 사용하여 작업하고 비판적으로 분석하는 방법에 대한 좋은 이해를 가져야 합니다.
우리의 이전 postdoc, 카자 나히, 크게 IMI Predect 컨소시엄 조직 슬라이스 플랫폼의 동료와 공동으로이 방법의 설립에 기여.
