Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в доклинкологических исследованиях, где исследования реакции на наркотики в эксплантах ломтика опухоли могут служить диагностическим целям. Основным преимуществом этого метода является то, что ломтик explants может в течение короткого периода времени моделировать сложную биологию родных тканей, включая пространственно распределенные функции. Хотя этот метод может дать представление об использовании ломтиков от опухолей легких мурина, он также может быть применен к другим типам тканей, включая человеческие ткани.
Для начала подготовьте виброметр и выполните VibraCheck в соответствии с инструкциями, предусмотренными в руководстве. Затем заполните каждый колодец 24-хорошо пластины с одним миллилитром сбалансированного соленого раствора Хэнка дополняется пенициллин и стрептомицин и держать пластину на льду. Вставьте 25-го калибра иглы во всех четырех лапах усыпляемой мыши, помещенной на крышку пенополистирола, так что грудь подвергается и животное растягивается.
Спрей 70% алкоголя на поверхности открытой кожи. Используйте ножницы, помещенные в угловое положение, чтобы разрезать кожу от живота к груди и до области шеи. Растянуть кожу с обеих сторон с помощью типсов и вставить 25-го калибра иглы.
Разрежьте область живота. Затем разрежьте грудную клетку и диафрагму, чтобы разоблачить легкие и сердце. Разоблачить трахею, отрезав окружающие ткани.
Рассекают легкие вместе с сердцем. Поместите ткани в 50-миллилитровую трубку, содержащую 30 миллилитров ледяного HBSS, дополненную Pen-Strep, помещенной на лед, и как можно быстрее перейти к следующему шагу. Теперь перенесите опухоленосные легкие в 10-сантиметровую пластину культуры тканей.
Используйте стерильные ножницы и миппы, чтобы отделить легочные доли и выбрать доли с опухолями на поверхности для нарезки. Поместите легочную долей с опухолевой тканью на лист фильтровальной бумаги, чтобы избежать скольжения и вырезать часть нормального легкого или дополнительной опухолевой ткани, которая окружает опухоль с помощью стерильного скальпеля для создания плоской поверхности ткани. Опустите плоскую сторону в каплю клея цианоакрилата и смонтировать его на держатель образца вибромы так, чтобы опухоль лицом к лезвию в вертикальном положении, и дайте ему высохнуть в течение двух-трех минут.
Поместите держатель образца вибромы в металлический буферный лоток. Заполните лоток холодным HBSS, дополненным Pen-Strep, пока ткань не будет погружена в буфер. Обложка буфер лоток с крышкой Plexiglas, который предоставляется с инструментом и поместить лоток в белую ледяную ванну и добавить лед, чтобы сохранить ткань прохладной во время нарезки.
Прикрепите белую ледяную ванну к виброме. Затем выберите подходящие настройки нарезки и начните нарезку. Принесите лезвие вибромы в положение нарезки и установите нарезанное окно.
Используйте стерильные типсы, чтобы собрать ломтики в 24-хорошо пластины заполнены одним миллилитров HBSS дополняется Pen-Strep за колодец и держать на льду. Отслеживая порядок нарезки, отметь каждый колодец из 24-хорошо пластины в соответствии с экспериментальным планом. Соберите кусочек ткани, прилегающий к культурным ломтикам, в качестве нулевого часа или некультурной ссылки.
Соберите по крайней мере три эталонных ломтика, чтобы представлять верхнюю, центральную и нижнюю часть ткани. И как только нарезка завершена, продолжайте чинить и обрабатывать. После этого подготовьте шестиясную пластину, содержащую 2,5 миллилитров среды культуры на колодец, поместив в нее титановые сетки.
Убедитесь, что между титановой сеткой и средой не образуются пузырьки воздуха. Чтобы загрузить срез на сетку держать шесть хорошо пластины в угловом положении, так что часть среды охватывает сетку. Затем поместите срез в среду на сетку и использовать типсы, чтобы распространить его.
После размещения ломтиков загрузите шесть пластин на вращающийся инкубационный блок, расположенный внутри увлажненные инкубатора поддерживается на 37 градусов по Цельсию с 95%02 и 5%CO2. Запустите цикл вращения. Для длительного культивирования пополнить культуру среды каждый день с помощью стерильных типсов, чтобы поднять сетку, содержащую ломтики ткани и поместить его в пустой колодец из шести хорошо пластины.
Замените 70% среды свежей средой культуры и поместите сетку обратно. Продолжить цикл вращения, как и раньше. Для медикаментозного лечения на ломтиках опухоли добавьте 2,5 миллилитров носителя с разбавленным препаратом или контроль транспортного средства в шести-хорошо пластины.
Поместите титановые сетки в скважины, а затем поместите ломтики на сетки, как это было сделано ранее. После выполнения процедур в течение 24 часов, продолжить фиксацию и обработку. Чтобы начать фиксацию желаемого ломтик тщательно передать его с помощью типсов в 10-сантиметровую пластину, содержащую пропитанную фильтровальную бумагу, наполненную двумя-тремя миллилитров PBS и дайте ему плавать.
Затем поднимите фильтровальную бумагу с парой типсов и поместите ее в кассету с гисто. Перенесите фильтровальную бумагу в кассету с гисто. Добавить каплю разбавленного гематоксилина на верхней части ткани ломтик, чтобы отметить положение ломтик для последующих шагов.
Закройте кассету и перенесите ее в 4%нейтральный буферный раствор формалина и оставьте на ночь при четырех градусах по Цельсию. После мытья и обработки кассеты, как описано в протоколе, откройте кассету с гисто и используйте скальпель, чтобы аккуратно снять фиксированный кусок с фильтровальной бумаги. Откажитесь от фильтровальной бумаги и перенесите кусочек в форму, содержащую жидкий парафин.
Используйте плоский вес, чтобы прижимать ткань к нижней части встраивания формы для обеспечения даже секции. Поместите нижнюю часть кассеты гисто поверх формы. Добавить жидкий парафин на нем.
И дайте плесени остыть на холодной тарелке в течение 30 минут. После этого отделить охлажденую плесень от парафин блока. Используйте микротом для подготовки четырехмиметровых тонких секций блоков ткани FFPE.
Обрезать избыток парафина, окружающего ткани. Для получения овых секций по всей ткани отрегулируйте угол блока так, чтобы поверхность блока была горизонтально ориентирована по отношению к лезвию. С помощью тонкой кисти собирайте последовательные участки тканей парафиновой ткани, начиная с верхней части стеклянных слайдов.
Продолжить сбор разделов глубоких слоев ткани к середине, а затем в нижней части стеклянных слайдов. Сбор секций из разных слоев каждого среза ткани на слайды объекта делается для того, чтобы можно было зафиксировать потенциальные градиенты, вызванные культурой, в жизнеспособности, миграции клеток или выражении биомаркеров. После сбора разделов продолжить их обработку и дальнейший анализ, как описано в протоколе.
Толщина ломтика ткани может повлиять на жизнеспособность культурных ломтиков. В этом случае, 250-микрометров толщиной ломтики показывают увеличение градиентов некроза по сравнению с 200-микрометров толщиной ломтики из-за толще ломтики становятся склонными к дефициту кислорода или диффузии питательных веществ через ломтики. Тем не менее, 160-микрометровые тонкие ломтики содержат большие некротические области, вероятно, вызванные технической обработкой во время позиционирования ломтиков, поскольку они хрупкие и имеют тенденцию к завитку.
Анализ NKX2-1, маркера хорошо дифференцированной аденокарциномы легких, показывает, что его экспрессия не изменяется существенно в культурных ломтиках по сравнению с нулевым часом некультурных ломтиков. Количественный анализ выражения NKX2-1 также подтвердил, что выражение не было существенно изменено в культурных по сравнению с некультурными ломтиками, предполагая, что процесс выращивания не влияет заметно влияет на дифференциацию статуса аденокарциномной ткани. Чтобы проверить, можно ли использовать ломтики опухолевых тканей для оценки эффективности целевых препаратов, их лечили ДМСО или титровали количество соединений.
При лечении одним микромоляным дактолизибом, который нацелен на фосфорилирование путей mTOR 4EBP1, был ингибирован. 0,5 микромоляного селеметинова, который нацелен на путь киназы MAP, был эффективен в ингибировании фосфорилирования ERK1/2. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее понимание того, как работать и критически анализировать ломтики свежевырезанные из драгоценных опухолевых тканей.
Наша бывшая постдок, Катя Нари, в значительной степени способствовала созданию этого метода в сотрудничестве с коллегами из консорциума IMI Predect Tissue Slice Platform.
